STUDI TENTANG PROTEIN ORGAN HATI YANG
BERINTERAKSI DENGAN AFLATOKSIN B
1EKO SUGENG PRIBADI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa Disertasi dengan judul “Studi tentang Protein Organ Hati yang Berinteraksi dengan Aflatoksin B1” adalah karya saya sendiri dan belum
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber-sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Maret 2006 Eko Sugeng Pribadi
ii
ABSTRAK
EKO SUGENG PRIBADI. Studi tentang Protein Organ Hati yang Berinteraksi dengan Aflatoksin B1. Komisi Pembimbing: I WAYAN T. WIBAWAN,
FACHRIYAN H. PASARIBU, RIZAL SYARIEF
Biotransformasi dan bioaktivasi aflatoksin merupakan suatu proses metabolisme di dalam tubuh yang berperan penting bagi aktivitas aflatoksin. Kedua proses ini terjadi di dalam organ hati. Satu tipe protein yang berikatan dengan aflatoksin B1
(PAB1) dari organ hati telah diisolasi menggunakan teknik kromatografi affinitas.
AFB1 diikatkan pada matriks nitroselulosa yang diaktifkan dengan Br-CN untuk
menangkap protein kemudian diinkubasi dengan ekstrak hati bebek dan ayam yang mengandung protein. Kandungan protein di dalam ekstrak kasar adalah 0,4310 mg/ml untuk hati bebek dan 0,3946 mg/ml untuk hati ayam yang diukur menggunakan metode Bradford. Ada dua pita PAB1 (66 dan 25 kDa) yang
diisolasi dari protein ayam dan hanya satu pita PAB1 (66 kDa) yang diisolasi dari
protein bebek ketika diisolasi menggunakan teknik SDS-PAGE. Antibodi terhadap PAB1 dihasilkan dengan menggunakan hewan coba kelinci yang disuntik
dengan PAB1 yang telah diisolasi. Keberadaan dan titer antibodi terhadap PAB1
(APAB1) diperiksa menggunakan teknik AGPT. APAB1 yang diperoleh digunakan
untuk memeriksa penyebaran PAB1 di dalam jaringan hati menggunakan teknik
imunohistokimiawi. Penyebaran PAB1 di dalam jaringan hati didapatkan di dalam
preparat jaringan hati bebek dan ayam. Keberadaan PAB1 di dalam organ hati
bebek lebih banyak dan menyebar dibandingkan di dalam organ hati ayam. Kata-kata kunci: aflatoksin B1, PAB1, penyebaran PAB1.
iii
ABSTRACT
EKO SUGENG PRIBADI. Study on Liver Organ Proteins which Interacted to Aflatoxin B1. Supervised by I WAYAN T. WIBAWAN, FACHRIYAN H.
PASARIBU, RIZAL SYARIEF
Biotransformation and bioactivation of aflatoxin play an important role in activity of aflatoxin. These processes will be took place in liver cell. The soluble intracellular aflatoxin B1-binding protein (PAB1) was isolated with an affinity
chromatography technique. For this, AFB1 was immobilized on Br-CN activated
nitrocellulose, then incubated with duck and chicken liver crude extract containing protein. Protein concentration of crude extract are 0.4310 mg/ml for duck liver and 0.3946 mg/ml for chicken liver measured by Bradford method. Two major protein bands was expressed by isolated PAB1 of chicken liver organs (66 and 25
kDa) and one protein band (66 kDa) for duck determined with SDS-PAGE. Antibodies against PAB1 were produced using rabbits injected with isolated PAB1
and the occurrence and the titre of specific antibodies were confirmed with AGPT. The antibody PAB1 was used to explore the distribution of PAB1 in liver tissues
with immunohistochemistry technique. PAB1 distribution could be detected in
duck as well as chicken liver preparation. The occurrence of PAB1 in duck liver is
clearly disseminate compared to chicken.
iv
STUDI TENTANG PROTEIN ORGAN HATI
YANG BERINTERAKSI DENGAN
AFLATOKSIN B
1EKO SUGENG PRIBADI
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar DOKTOR pada
Program Studi Sains Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
v Judul disertasi : Studi tentang Protein Organ Hati yang Berinteraksi dengan
Aflatoksin B1.
Nama : Eko Sugeng Pribadi NRP : 995133
Program Studi : Sains Veteriner Disetujui Komisi Pembimbing Dr. drh. I Wayan T. Wibawan, MS.
Prof. Dr. drh. Fachriyan H. Pasaribu
Ketua Anggota Prof. Dr. Ir. H. Rizal Syarief SN, DESS
Anggota Diketahui
Ketua Program Studi Sains Veteriner Dekan Sekolah Pascasarjana drh. Bambang P. Priosoeryanto, MS., Ph.D. Prof. Dr. Ir. Sjafrida Manuwoto, MSc.
Tanggal ujian : __________________ Tanggal lulus : __________________
vi
PRAKATA
Assalaamu’alaikum wr. wb.
Syukur alhamdulillah Penulis panjatkan kepada Allah swt karena kuasaNYA dan rahmatNYA pada akhirnya Penulis dapat menyelesaikan penulisan disertasi “Studi tentang protein organ hati yang berinteraksi dengan aflatoksin B1”
menjadi syarat untuk menyelesaikan pendidikan program doktor di Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Penulis sangat bersyukur karena memiliki guru-guru besar, hebat dan
mengagumkan yang diantaranya adalah Dr. drh. I Wayan T. Wibawan, MS., Prof.
Dr. drh. Fachriyan H. Pasaribu dan Prof. Dr. Ir. Rizal Syarief SN, DESS, yang telah bersedia dengan sabar selalu mengajak diskusi, membimbing dan mengarahkan Penulis selama menempuh pendidikan dan selalu memberi dorongan untuk menyelesaikan pendidikan ini. Rasa bangga juga Penulis rasakan karena memiliki kolega-kolega, seperti Dr. Setyo Widodo, Dr. Soeripto, Prof. Djokowoerjo Sastradipradja, Dr. Dewi Apri, drh. Gani, drh. Oetoro, drh. Sukobagyo, dr. Soedjasmiran dan masih banyak yang tidak mungkin disebutkan semuanya, yang selalu memberikan semangat untuk TETAP menyelesaikan pendidikan ini. Ucapan terima kasih kepada drh. Dewa Made Ngurah Dharma. Ucapan terima kasih khusus untuk drh. Ida Lestari, drh. Ketut Karuni, MSi, drh. Pudji, Ph.D. dan seluruh rekan di BPMSOH. Terima kasih kepada drh. Lia, drh. Yuni, drh. Wandi, Bapak Medi dan Ibu Yeni atas bantuan selama Penulis memanfaatkan fasilitas penelitian di PT. Bio Farma (Persero). Ucapan terima kasih kami haturkan kepada drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D. yang walaupun dengan kondisi kesehatan yang kurang namun masih bersemangat berbagi pengetahuan tentang uji imunohistokimiawi. Juga, kepada drh. Adi Winarto, Ph.D. dan drh. Ketut Mudite Adnyane, Msi. yang selalu membantu dan menemani ketika kami hampir merasakan kejenuhan sewaktu melakukan uji imunohistokimiawi.
Terima kasih untuk tim khusus gerak cepat, yaitu Pak Aria, Pak Agus Somantri, Sastra “Abeng” Gumilar, Dodi dan Ika, atas bantuan selama penelitian
vii dan kesediaan menemani selama penelitian. Juga Pak Rudi, Pak Said, Pak Rafi, Pak Kosasih untuk informasi kolokium, Pak Kosasih dan Pak Budi atas seluruh dukungannya.
Sujud saya kepada Bapak dan Ibu yang selalu penuh doa dan harapan agar Penulis dapat segera menyelesaikan semua ini, almarhum Papa yang selalu mengingatkan Penulis dengan perbincangan terakhirnya dan Mama. Pelukan dan ciuman hangat untuk istriku Rina, atas kesabaran dan pengertiannya menemani hingga disertasi ini selesai dikerjakan, dan tak lupa untuk Vira.
Penulis tidak dapat menyebutkan semua pihak yang selama ini telah membantu dan mendorong Penulis untuk menyelesaikan pendidikan ini. Penulis hanya berharap agar semua kebaikan yang sudah diberikan selama ini akan dibalas dengan rahmat yang berlipat dari Allah swt.
Akhir tulisan, Penulis sembahkan tulisan ini untuk pengembangan ILMU PENGETAHUAN.
Wassalaamu’alaikum wr. wb.
Bogor, Desember 2006 Eko S. Pribadi
viii
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pendopo-Palembang pada tanggal 5 Juni 1964 dari pasangan Ponimin dan Markomah. Penulis merupakan anak pertama dari lima bersaudara.
Pendidikan dasar dan menengah pertama dilalui Penulis di Jambi. Setelah menyelesaikan pendidikan di SMA Negeri 1 Bogor, Penulis meneruskan pendidikan ke Institut Pertanian Bogor melalui jalur Proyek Perintis II (jalur tanpa ujian). Penulis menyelesaikan pendidikan sarjana kedokteran hewan pada tahun 1987 dan dokter hewan pada tahun 1988 pada Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Pendidikan pascasarjana program magister di Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana IPB ditempuh selama penulis masih bekerja di sektor swasta sebagai konsultan dan program tersebut dapat diselesaikan pada tahun 1991. Program Doktor mulai dijalani sejak tahun 1999 di Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana IPB.
Begitu lulus dokter hewan, Penulis langsung menjalani karir di sektor swasta sebagai technical advisor di PT. Pyridam. Setahun kemudian, Penulis berkarir sebagai konsultan bidang AMDAL dan lingkungan hidup paruh waktu di beberapa kantor konsultan. Tahun 1992 menjadi pegawai negeri sipil di IPB. Saat ini Penulis terdaftar sebagai staf pengajar di Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Penulis menikahi Ir. Iriana Ekasari pada tahun 1993 yang berkarir di sektor swasta dan dikaruniai seorang putri bernama Savira Anjani yang saat ini sudah duduk di kelas VI SD.
ix
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR ……… xi
DAFTAR TABEL ……… xii
DAFTAR LAMPIRAN………. xiii
PENDAHULUAN……… 1
Latar belakang ……… 1
Tujuan penelitian ………. 4
Hipotesis ……….. 4
Manfaat hasil penelitian ………. 5
TINJAUAN PUSTAKA ……….. 6
Cendawan Aflatoksigenik ………. 6
Sifat Fisik dan Kimiawi Aflatoksin sebagai Racun ………... 7
Biosintesis Aflatoksin ……… 9
Organ Hati dan Proses Biotransformasi Aflatoksin ………. 13
Pencemaran Aflatoksin dalam Pakan dan Bahan Makanan ………. 18
Gangguan Kesehatan Ternak dan Manusia oleh Aflatoksin ………. 22
Teknik-Teknik untuk Mendeteksi Aflatoksin dan Mendiagnosa Aflatoksikosis……….. 25
Pengendalian Mikotoksin ……….. 26
Pengobatan terhadap Aflatoksikosis ……… 30
BAHAN DAN METODE PENELITIAN ……….. 32
Tempat dan Waktu Penelitian ……… 32
Bahan Penelitian ………... 32
1. Hewan Percobaan ………... 32
2. Organ Hati ………... 34
3. Bahan Kimia ……… 34
Metode Penelitian ………. 34
1. Ekstraksi Sel Hati ………. 34
2. Penentuan Kadar Protein ……… 35
3. Pembuatan Matriks AFB1 ……… 35
4. Pemurnian PAB1 ………. 36
5. Karakterisasi PAB1 ………. 36
6. Produksi Anti-Protein (APAB1) ……… 37
7. Uji Keberadaan Anti-Protein (APAB1) ……… 37
8. Pemeriksaan Histologik Ikatan PAB1 dan APAB1 di Organ Hati ………... 39
8.1 Pewarnaan Hematoksilin-Eosin ………. 39
8.2 Pewarnaan Imunohistokimiawi ……….. 40
x
HASIL DAN PEMBAHASAN ……… 43
Ekstraksi Hati ……… 43
Matriks AFB1 ………. 44
Protein yang Berikatan dengan AFB1 murni (PAB1) ………. 45
Antibodi Poliklonal PAB1 ……… 48
Gambaran Histologik PAB1 di Preparat Jaringan Hati Sehat ……… 50
SIMPULAN DAN SARAN ………. 57
Simpulan .……… 57
Saran ……… 57
xi
DAFTAR GAMBAR
No. Judul Hal 1. Gambaran Jalur Poliketida yang merupakan jalur awal ………… 10
metabolisme untuk sintesis aflatoksin
2. Peranan beberapa prekursor dalam tahapan sintesis aflatoksin …. 11 3. Bagan proses biotransformasi dan bioaktivasi AFB1 yang terjadi ... 14
di sitokrom P450 organ hati primata non-manusia
4. Peranan mikrosoma CYP1A2 dan CYP3A4 dalam bioaktivasi ... 15 AFB1 menjadi AFB1-8,9-epoksida
5. Hewan percobaan kelinci yang digunakan untuk memproduksi ... 33 APAB dipelihara dalam kan-dang bertingkat (Lokasi: Ruang
Pemeliharaan Hewan, Laboratorium Monitoring Hewan PT. Bio Farma (Persero)
6. Penyuntikan PAB1 kepada hewan coba kelinci melalui …………. 38 v. auricularis (a). Serum diambil setiap lima hari setelah
penyuntikan untuk dilakukan pemantauan keberadaan dan titer APAB1 (b)
7. Kurva baku yang diperoleh untuk menghitung kadar protein …… 44 di dalam contoh ekstrak
8. Bagan pengaktifan nitroselulosa dengan menggunakan bromsian …. 45 (CNBr) menjadi matriks penangkapan AFB1 dan PAB1
9. Pita protein hasil uji elektroforesis terhadap PAB1 dari …………... 47
hati ayam (A), bebek (B) dan penanda (marker, P)
10. Hasil reaksi positif uji presipitasi yang diwujudkan dalam bentuk…. 48 garis presipitasi (tanda panah) antara antibodi poliklonal APAB1
(lubang pinggir) antigen PAB1 (lubang tengah) dari protein
hati bebek (A) dan ayam (B)
11. Titer antibodi APAB1 yang diha-silkan oleh kelinci yang ………… 49
disuntik dengan PAB1 melalui v. auricularis
12. Garis presipitasi (tanda panah) dari hasil uji silang antara PAB1 ….. 50
dari organ hati bebek dengan APAB1 yang digertak oleh PAB1
xii APAB1 yang digertak oleh PAB1dari organ hati bebek (b)
13. Gambaran histologik jaringan hati ayam yang sehat ………. 51 (Pewarnaan: HE. Pembesaran: 10x)
14. Gambaran histologik jaringan hati bebek yang sehat ……… 51 (Pewarnaan: HE. Pembesaran: 10x)
15. Hasil pewarnaan imunohistokimiawi terhadap hati ayam (a) dan … 52 bebek (b). Endapan berwarna coklat-kehitaman (tanda panah)
menandakan dilokasi tersebut terdapat PAB1. Pembesaran: 10x.
16. Keberadaan PAB1 di dalam endothelial pembuluh darah vena ……. 52
sentralis (tanda panah) dari hati bebek yang diwarnai dengan teknik imunohistokimiawi. Pembesaran: 20x
17. Posisi protein yang berikatan dengan AFB1 pada sel hati ayam (a) .. 54
dan bebek (b). Lokasi protein (tanda panah) berada di daerah sinusoid. Sedangkan hepatosit tidak terwarnai (h) (Pembesaran 100x)
DAFTAR TABEL
No. Judul Hal 1. Sifat fisik dan kimiawi aflatoksin ……… 8 2. Gen yang terlibat dalam proses biosintesis AFB1 ... 12
3. Kandungan aflatoksin pada sampel kacang tanah dan produk ... 21 olahannya di Indonesia
4. Nilai absorbansi larutan baku BSA yang digunakan untuk ………… 43 membuat kurva baku
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
No. Judul Hal 1. Perhitungan statistika untuk menentukan nilai keragaman ……….. 77
