EFISIENSI KOLOM. Bentuk-bentuk kromatogram

(1)

EFISIENSI KOLOM

Pertemuan 3

Bentuk-bentuk kromatogram

- Linier (simetris, bentuk gaus), ideal

(puncak sempit)

- Tidak linier dan tidak ideal

K = CS/Cm

K < CS/Cm K > CS/Cm

CS CS CS

(2)

K = CS/Cm _{K < C} S/Cm

K > CS/Cm

CS CS CS

Cm _Cm _C_m

Isoterm ideal isoterm konveks

Isoterm Konkaf

Simetris

peak tailing peak leading

(overload)

Faktor yang mempengaruhi

efisiensi kolom



Difusi Eddy (A)



Difusi longitudinal (B/V)



Transfer massa (CV)

4

HETP = A + B/V + CV

(3)

Persamaan Van Deemter:

Suku A

dp = diameter partikel isis kolom

(4)

7

Packing kolom tidak seragam, jalur yang dilalui analit berbeda, sampai di ujung kolom dalam waktu yang berbeda

1. Faktor Difusi Eddy

Suku B/V (difusi longitudinal)

Dg = koef difusi analit pada fasa pembawa (gas)

= 10

5

_D

(5)

2. Faktor Difusi Longitudinal

9

Arah aliran fasa gerak berbeda dengan

arah aliran (gas)

Suku C.V

(efek perpindahan massa)

k’= faktor kapasitas

d

_f

= tebal lapisan cairan fasa diam

D

_l

= koef difusi komponen dalam fasa diam

ω = tetapan gas

Dp = diameter partikel isi kolom

D

_g

= koef difusi komponen dalam fasa gerak

(6)

3. Faktor Efek perpindahan massa

11

Analit yang ada di pusat aliran bergerak

lebih cepat dibandingkan dengan analit

di dekat dinding kolom

12

Fasa diam Fasa gerak

(7)

Grafik Van Deemter

13 V optimal H min HETP V, Laju

Laju alir operasional : 2 Vopt

Berilah penjelasan:



Makna dari grafik Van Deemter:



Suku A ?



Suku B



Suku C

(8)

15

 Mengapa kolom dapat memisahkan campuran komponen ?

Karena perbedaan interaksi

komponen-komponen

dengan kolom/fasa diam

Komponen

2

_{keluar dari kolom}

Dalam waktu yang berbeda-beda

Waktu retensi (tr)

Berbeda-beda pula

16 Prinsip Pemisahan

Perbedaan distribusi komponen

diantara fasa gerak dan fasa diam

yang menyebabkan perbedaan migrasi diferensial

komponen-komponen analit dalam kolom

kromatografi

 Selektivitas kolom

Kemampuan kolom untuk membedakan suatu komponen dari komponen lain

Perbedaan k`

dasar

(9)

17 1. Faktor Selektivitas () 1 2 K K 



K adalah Koef partisi komponen

1 dan 2 ) 0 ( ) 1 ( ) 0 ( ) 2 ( ' 1 ' 2 r t r t r t r t r t r t    



Untuk Pemisahan:



>>1

 Apakah parameter menjamin

pemisahan sempurna ??

Tr, menit

I

_3,2

_4,5

T

₀

= 0,99

 :………

 menjamin pemisahan bagian atas (puncak)

kromatogram

 Tidak memperhitungkan overlap

puncak-puncak

(10)

19

2. Resolusi (Rs)

1 2 ) ( ( 2 ) ( 2 1 2 1 ) 1 ( ) 2 ( 2 1 ) 1 ( ) 2 ( w w t t w w t t Rs r r r r      

W = lebar puncak

w 20 w W1/2 ) ( 699 , 1 ) ( 2 ) 2 ( 2 / 1 ) 1 ( 2 / 1 ) 1 ( ) 2 ( w w t t Rs r r   

Rs ideal = 1,25

(97,5% terpisah)

(11)

21

Cara lain menghitung Rs :

memperhitungkan

 selektivitas

 efisiensi

 faktor kapasitas

N

k

R

)(

1 )

`

1 `

(

4

1 









Faktor kapasitas Faktor selektivitas Faktor efisiensi

INSTRUMENTASI

HPLC

(12)

23 KCKT

Teknik untuk pemisahan dan analisis zat yang sukar dipisahkan dan termolabil  Teknik untuk kontrol ketakmurnian

Eluat dikumpulkan

Tempatelue n

pompa injektor kolom

detektor

rekorder

Diagram blok alat KCKT

24 GAMBAR HPLC

(13)

25 1. Tempat eluen/pelarut

Botol terbuat dari bahan yang bereaksi dgn pelarut (gelas)

Dilengkapi dgn penyaring (stainless steel)

Pipa kecil polietilen eluen harus di degassing

Eluen harus disaring dengan saringan

2. Pompa eluen

Gambar Pompa

Gunanya memompa eluen ke dalam kolom Terbuat dari stainless steel/teflon

Seals terbuat dari mas atau teflon/grafit Tekanan sampai 400 bar

(14)

27

Spesifikasi pompa yang baik: Repeatability (keberulangan)

Presisi jangka pendek (short term precision) Noise pompa (menyebabkan pulsa) karena gerakan piston dan check valve

Drift (perubahan kecepatan alir pompa karena waktu alir lama)

3. Injektor Valve Injektor Syringe injection 28 Syarat injektor:

dapat memasukkan contoh ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin untuk menghindari pelebaran puncak

Mudah digunakan Keberulangan tinggi

Dapat bekerja meskipun ada tekanan balik tinggi

4. Kolom

(15)

29

Kolom yang baik

bahan kolom kuat dan tidak mudah berkarat

partikel Isi kolom berdiameter kecil (5–10m), ukuran

seragam, bulat, berpori

Efisiensi kolom tinggi (N >>, H<<) Tahan terhadap tekanan tinggi

Menghasilkan puncak simetri dan sempit

(16)

31

Jenis kolom

1. Kolom polar : silika, amina 2. Kolom non polar : C-8, C-18

Struktur fasa diam silika Struktur fasa diam C-18 terikat pada silika

silika C-18 yang terikat silika

Si O O Si Si O O H Si O Si O R Si O R Si 32 5. Detektor Syarat detektor

• Tingkat noise dan drift rendah • Sensitivitas tinggi

• respons cepat

•Tidak sensitiv terhadap perubahan tipe pelarut, laju alir pelarut dan temperatur

• mudah pengoperasiannya • awet

Detektor dalam KCKT

•detektor spektrofotometrik (UV/VIS) • detektor fluoresensi

•Detektor indeksrefraksi (Optis) •Detektor elektrokimia

(17)

33

1. Kromatografi fasa terbalik: Fasa diam lebih nonpolar dari fasa gerak

2. Kromatografi fasa normal: Fasa diam lebih polar dari fasa gerak

Pemeliharaan kolom

1. Saring eluen dgn saringan membran

2. Hindari pengaliran eluen ke dalam kolom dari arah yang sebaliknya 3. Gunakan kolom pengaman (column guard)

4. Simpan kolom dalam pelarut yang sesuai jika tidak digunakan (kolom polar dalam metanol, kolom nonpolar dalam kloroform)

5. Jangan sampai kolom jatuh

6. Jangan menggunakan eluen yang terlalu asam 7. Cuci kolom sesudah digunakan.

8. Lakukan regenerasi kolom sesuai prosedur

Trouble shoot

Alat

Hasil pengukuran Trouble Shoot Penanggulangan 1. Pompa berhenti/tekanan

tinggi

Saring kembali fasa gerak Periksa saringan fasa gerak Periksa ujung-ujung kolom periksa klep pompa (harus dgn

ahlinya.)

Bersihkan kolom dengan laju alir minimal

ganti kolom 2. Keberulangan injeksi rendah Cuci kolom

Uji keberulangan pompa Periksa detektor 3. Puncak tidak terpisah Perlambat laju alir

Ubah komposisi fasa gerak Ganti fasa gerak

Ganti kolom 4. Puncak terlalu lebar dan tr >> - Percepat laju alir

(18)

35

TIPE-TIPE PUNCAK KROMATOGRAM

36

(19)

37

1. Dari kromaogram KCKT suatu campuran yang diketahui terdiri dari senyawa A dan B, diperoleh data sbb:

tr (A) = 13 menit, tr (B) = 21,5 menit, to = 2,0 menit W(A)= 2,1 menit, W(B) = 4,1 menit.

Hitung Resolusi dan faktor pemisahannya Soal efisiensi kolom:

Komponen x terelusi dalam KCKT dengan data sbb:

tr(x) = 21,5 menit , W = 4,1 menit, W1/2= 1,85 menit, to= 0,95 menit.

Hitung N , HETP, dan Faktor kapasitas, bila elusi dilakukan dalam kolom 12,5 cm

Analisis kualitatif

-Agak sukar dilakukan terutama bila dalam campuran

-Dapat dilakukan bila pemisahan baik dan tidak ada interferensi

-Dasar: membandingkan waktu retensi analit dengan standar

-Kondisi elusi analit harus sesuai dengan kondisi standar

(20)

39

Analisis Kuantitatif

Tahapan kerja:

*Penyiapan fasa gerak:

Pelarutan, pencampuran, penyaringan, degasing

*Preparasi sampel:

Pemisahan dgn ekstraksi Pengenceran/pelarutan ekstrak penyaringan/degasing

*Penyiapan larutan standar :

Induk : larutan 1000 ppm

pengenceran dengan fasa gerak. pembuatan larutan kerja:

40

*Pengukuran sampel

*Penentuan konsentrasisebenarnya analit dalam sampel

Pengukuran sampel:

-Teknik membandingkan area standar dengan area analit

Area standar = As , konsentrasi = Cs

Area analit = Ac , konsentrasi analit = Cc

(21)

41 C, ppm Area * * * * * Cx

-Teknik kurva kalibrasi

Dibuat beberapa seri larutan standar, dari

konsentrasi kecil sampai besar ( minimal 4 larutan standar)

Dibuat larutan sampelsedemikian sehingga area berada dalam range konsentrasi standar

Larutan standar diinjeksikanmulai dari konsentrasi kecil Larutan sampel diinjeksikan

Plot Area sampeldalam kurva kalibrasi (C vs area standar)

Teknik analisis kuantitatif dengan kalibrasi adisi standar

 Untuk mendekatkan kondisi sampel dengan kondisi

larutan standar

 Caranya: ke dalam sejumlah larutan standar (seri)

ditambahkan sejumlah yang sama sampel, kemudian diperlakukan sesuai prosedur seperti pada cara kalibrasi biasa C, ppm Area * * * * * Cx

(22)

43

Parasetamol adalah obat analgesik dan antipretik

yang biasanya dikemas dalam bentuk cair untuk

konsumsi anak-anak. Selain parasetamol sebagai

zat aktif, biasanya dalam kemasan tersebut

ditambahkan aditif gula dan etanol dalam jumlah

sedikit selain air sebagai pelarut.

OH

HN – C = O CH3

44

Bila senyawa parasetamol akan dianalisis dengan HPLC, teknik mana yang akan dipilih,

a. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerak metanol/air

b. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerak n-heksana/air

c. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerak n-heksana

d. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerak kloroform

Detektor apa yang dapat digunakan dalam analisis ini ?

Bagaimana gambaran kromatogram yang akan dihasilkan ?

(23)