DAYA ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI
KULIT BATANG KAYU MANIS (Cinnamomum burmannii Bl.) TERHADAP Streptococcus mutans PENYEBAB KARIES GIGI
SKRIPSI
Disusun untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Kadek Risna Dwijayanti NIM : 078114092
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
i
DAYA ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI
KULIT BATANG KAYU MANIS (Cinnamomum burmannii Bl.) TERHADAP Streptococcus mutans PENYEBAB KARIES GIGI
SKRIPSI
Disusun untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Kadek Risna Dwijayanti NIM : 078114092
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
ii
Persetujuan Pembimbing
DAYA ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI
KULIT BATANG KAYU MANIS (Cinnamomum burmannii Bl.) TERHADAP Streptococcus mutans PENYEBAB KARIES GIGI
Skripsi yang diajukan oleh : Kadek Risna Dwijayanti
NIM : 078114092
telah disetujui oleh:
Pembimbing
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
DAYA ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI
KULIT BATANG KAYU MANIS (Cinnamomum burmannii Bl.) TERHADAP Streptococcus mutans PENYEBAB KARIES GIGI
Oleh :
Kadek Risna Dwijayanti NIM : 078114092
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma pada tanggal :24 Januari 2011
Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta Dekan
Ipang Djunarko, M.Sc.,Apt.
Panitia Penguji : Tanda tangan
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Berbuat kesalahan adalah kelemahan manusia.
Belaj ar dari kesalahan adalah kekuatan manusia.
Karya ini kupersembahkan kepada:
Sang H yang W idhi W asa
Bapak dan mama tercinta
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Nama : Kadek Risna Dwijayanti
Nomor Mahasiswa : 078114092
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
DAYA ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI
KULIT BATANG KAYU MANIS (Cinnamomum burmannii Bl.) TERHADAP Streptococcus mutans PENYEBAB KARIES GIGI
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal 7 Januari 2011 Yang Menyatakan
vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian dari orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 10 Januari 2011 Penulis,
vii PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas anugrah dan bimbingan-Nya yang penuh Kasih, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi berjudul ” Daya Antibakteri Minyak Atsiri Kulit Batang Kayu Manis (Cinnamomum Burmannii Bl.) Terhadap Streptococcus mutans Penyebab Karies Gigi”.
Penulis menyadari bahwa penulis tidak dapat menyelesaikan skripsi ini sendiri tanpa bantuan, dukungan, bimbingan, arahan, kritik, dan saran dari berbagai pihak. Maka pada kesempatan ini, penulis hendak menyampaikan ungkapan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Kedua orangtua penulis atas bantuan, bimbingan, motivasi, dukungan dan kasih sayangnya yang telah diberikan kepada penulis.
2. Bapak Ipang Djunarko M.Sc., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
3. Ibu C.M. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm.,Apt selaku dosen pembimbing skripsi yang telah memberikan bimbingan, saran dan evaluasi kepada penulis sejak penyusunan proposal hingga selesainya penulisan skripsi ini. 4. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si selaku dosen penguji, atas
bimbingan, arahan, dan penjelasannya.
viii
6. Ibu Yustina Hartini, M.Si.,Apt selaku Dosen Mikrobiologi yang sudah memberikan arahan dan bimbingan.
7. Kak Ode, dek Novi dan dek Puput saudara penulis yang telah memberi warna pada hari- hari penulis, dan meramaikan suasana saat berada di rumah.
8. Kak Reno atas segala bantuan, semangat, dukungan, dan perhatian yang diberikan pada penulis
9. Paulina Kartika Chandra Sari dan Fransiska Kurnianingsih yang selalu menemani penulis saat melakukan penelitian, juga memberikan semangat kepada penulis.
10.Sano, Ririn, Dina, Paul, Siska, Sasa, Mami Dewi, Tika, Feni, Yesia, Yossy, dan Tere sahabat yang telah memberikan dukungan terbaiknya, memberikan do’a, dan memberikan hari- hari yang sangat menyenangkan bagi penulis.
11.Mas Anton, Yacob, Mas Rio yang dengan sabar membagikan ilmu Mikrobiologi kepada penulis.
12.Banu Pratistha yang dengan iklhas membagikan ilmu bahasa Inggrisnya kepada penulis.
ix
14.Teman-teman kelas B 2007, teman-teman FKK B, dan seluruh teman seperjuangan angkatan 2007, atas suka duka, kenangan dan kebersamaan yang membuat saat-saat kuliah menjadi saat-saat yang indah.
15.Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, atas segala bantuannya hingga penulis menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa penulis tidak luput dari kekurangan dalam penulisan naskah skripsi ini mengingat segala keterbatasan wawasan dan kemampuan penulis. Untuk itu, penulis memb uka diri untuk adanya kritik dan saran yang membangun sehingga skripsi ini menjadi lebih baik. Akhir kata, dengan segala kerendahan hati penulis berharap semoga tulisan ini berguna bagi semua pihak, terutama untuk kemajuan pengetahuan dalam bidang ilmu Farmasi.
x DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA... vi
B. Tujuan Penelitian ... 5
BAB II. PENELAHAAN PUSTAKA... 6
A. Pengembangan Penemuan Obat ... 6
xi
C. Minyak Atsiri... 10
D. Destilasi Minyak Atsiri ... 12
E. Karakterisasi Minyak Asiri ... 14
1. Uji organoleptis ... 14
2. Bobot jenis ... 14
3. Indeks bias ... 15
F. Kromatografi Lapis Tipis... 15
G. Karies Gigi ... 17
H. Streptococcus mutans ... 18
I. Metode Uji Senyawa Antibakteri... 20
J. Landasan Teori ... 22
K. Hipotesis ... 23
BAB III. METODE PENELITIAN ... 24
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 24
B. Variabel dan Definisi Operasional ... 24
C. Bahan Penelitian ... 26
D. Alat Penelitian ... 27
E. Tata Cara Penelitian ... 27
1. Pengumpulan bahan kulit batang kayu manis ... 27
2. Identifikasi simplisia kulit batang kayu manis ... 27
3. Destilasi uap dan air... 28
xii
manis secara KLT... 30
6. Penyiapan media uji... 31
7. Uji daya antibakteri minyak atsiri dengan difusi sumuran ... 32
8. Penentuan KHM dan KBM minyak atsiri dengan dilusi padat ... 34
E. Analisis Data ... 35
BAB IV . HASIL DAN PEMBAHASAN ... 37
A. Identifikasi Simplisia Kulit Batang Kayu Manis ... 37
B. Penyiapan Bahan Kulit Batang Kayu Manis ... 40
C. Destilasi Uap dan Air ... 40
D. Karakterisasi Minyak Atsiri ... 42
1. Pemeriksaan organoleptis minyak atsiri ... 42
2. Bobot jenis minyak atsiri ... 43
3. Indeks bias minyak atsiri ... 44
E. Identifikasi Kualitatif Kandungan Senyawa Cinnamaldehyde dalam Kulit Batang Kayu Manis Secara KLT... 45
F. Uji Daya Antibakteri Minyak Atsiri dengan Metode Difusi Sumuran dan Dilusi Padat ... 50
1. Uji daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan difusi sumuran ... 51
2. Penentuan KHM dan KBM minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan metode dilusi padat ... 57
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 61
xiii
B. Saran ... 61
DAFTAR PUSTAKA ... 62
LAMPIRAN ... 66
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I Volume minyak atsiri ... 42
Tabel II Pemeriksaan organoleptis... 43
Tabel III Bobot jenis minyak atsiri... 44
Tabel IV Indeks bias minyak atsiri ... 45
Tabel V Nilai Rf minyak atsiri dengan pembanding cinnamomi oil... 49
Tabel VI Nilai Rf minyak atsiri dengan pembanding cinnamaldehyde...50
Tabel VII Diameter zona hambat pertumbuhan bakteri S.mutans oleh minyak atsiri kulit batang kayu manis ... 54
Tabel VIIIDiameter zona hambat pertumbuhan bakteri S.mutans pada penurunan konsentrasi oleh minyak atsiri kulit batang kayu manis ... 55
Tabel IX Hasil analisis diameter zona hambat dengan menggunakan metode LSD test ... 56
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Kulit batang kayu manis... 9
Gambar 2. Struktur cinnamaldehyde... 11
Gambar 3. Kulit batang kayu manis... 38
Gambar 4. Hablur oksalat ... 39
Gambar 5. Periderm ... 39
Gambar 6. Sel minyak... 39
Gambar 7. Serabut sklerenkim ... 39
Gambar 8. Serabut sklerenkim pada sel minyak ... 39
Gambar 9. Sel minyak ... 39
Gambar 10. Minyak atsiri kulit batang kayu manis hasil destilasi uap dan air ... 41
Gambar 11. Profil minyak atsiri kulit batang kayu manis kulit batang kayu manis pada deteksi UV 254 ... 47
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Identifikasi makroskopik simplisia kulit batang kayu manis ... 66
Lampiran 2. Data volume minyak atsiri kulit batang kayu manis hasil destilasi ... 67
Lampiran 3. Data karakterisasi minyak atsiri kulit batang kayu manis... 68
Lampiran 4. Hasil uji daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis terhadap S.mutans dengan metode difusi sumuran... 71
Lampiran 5. Hasil uji daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis terhadap S.mutans dengan dilusi padat ... 74
Lampiran 6. Hasil uji streak penentuan KHM dan KBM... 75
Lampiran 7. Hasil analisis statistik One Way ANOVA... 76
Lampiran 8. Hasil analisis LSD Test ... 77
xvii
bersifat acidogenic yaitu Streptococcus mutans (Marsaban, 2007; Madigan, Martinko & Parleer, 2000 ). Minyak atsiri kulit batang kayu manis (Cinnamomum burmannii Bl.) yang mengandung cinnamaldehyde diketahui memiliki daya antibakteri terhadap bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Oenococcus oeni dan Lactobacillus hilgardii
(WHO, 1999; Figueiredo et al, 2007). Penelitian daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis dilakukan untuk mengetahui Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) terhadap Streptococcus mutans
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni yang dianalisis statistik dan deskriptif. Kulit batang kayu manis didestilasi dengan destilasi uap dan air untuk mengisolasi minyak atsiri, dan kemudian dilakukan penentuan diameter zona hambat pertumbuhan bakteri S.mutans dengan menggunakan metode difusi sumuran. Data hasil pengukuran diameter zona hambat diuji distribusi normalnya dengan Kolmogorov-Smirnov dilanjutkan analisis statistik one way ANOVA dan dilanjutkan dengan LSD test. Penentuan KHM dan KBM dilakukan dengan metode dilusi padat, kemudian dianalisis secara eksploratif deskriptif.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa minyak atsiri kulit batang kayu manis mempunyai daya antibakteri terhadap S.mutans dengan KHM sebesar 5% dan KBM sebesar 20%.
xviii ABSTRACT
Dental caries is the main problem in dental disease which may interrupt daily activities. Dental caries begins when there is a dental plaque containing lots of bacteria (Marsaban, 2007; Madigan, Martinko & Parleer, 2000 ). The essential oil of cinnamon tree bark (Cinnamomum burmannii Bl.) containing
cinnamaldehyde are reported to provide antibacterial effect against Bacillus
subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa,Oenococcus oeni and Lactobacillus hilgardii (WHO,1999; Figueiredo
et al,2007). A study of antibacterial potency of cinnamon tree bark essential oil to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) against Streptococcus mutans
This was pure experimental study which was analyzed statistically and descriptively. The cinnamon tree bark was distilled by using steam and water distillation in order to get the essential oil this oil was then observed of its bacterial growth inhibition zone diameter by well diffusion method. The data of measurement result of inhibition zones then distribution normal were analyzed with Kolmogorov-Smirnov to ANOVA’s one way statistic analysis LSD test. The fixation of MIC and MBC was determined by using solid dilution method. The data was analyzed in descriptive explorative.
Result showed that the essential oil of cinnamon tree barks provide antibacterial potency on Streptococcus mutans with 5% MIC and 20% MBC Keywords: Cinnamon tree bark, cinnamon (Cinnamomum burmannii Bl.),
1
A. Latar Belakang
Karies gigi merupakan masalah utama dalam penyakit gigi yang dapat mengganggu aktivitas sehari- hari. Gula (sukrosa) dan makanan yang mengandung gula adalah salah satu pencetus terjadinya karies gigi secara jelas dibuktikan pada binatang percobaan. Makanan yang mengandung gula sangat disukai oleh anak-anak, oleh karena itu prevalensi tertinggi penderita karies gigi adalah anak-anak. Hal ini ditunjukkan dari hasil survey di Amerika yang menunjukkan hampir 100 % anak-anak menga lami karies gigi (Koswara, 2007).
Karies gigi disebabkan karena adanya penumpukan plak gigi yang banyak mengandung bakteri. Bakteri terbanyak pada plak gigi yang bersifat
acidogenic yaitu Streptococcus mutans. Bakteri ini merupakan flora normal rongga mulut, tetapi apabila terjadi peningkatan populasi bakteri akan dapat berubah menjadi pathogen (Marsaban, 2007; Madigan, Martinko & Parleer, 2000).
Pencegahan akumulasi plak dilakukan guna menghindari sakit gigi sekaligus menjaga kesehatan mulut. Untuk itu perlu dilakukan kontrol plak. Kontrol plak gigi dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu mekanis dan kimiawi. Kontrol plak secara mekanis dilakukan menggunakan sikat gigi, sedangkan secara kimiawi menggunakan obat kumur atau pasta gigi (McDonald dan Avery, 2000).
2
industri- industri, baik industri kecil maupun besar yang menggunakan tumbuh-tumbuhan yang banyak terdapat di Indonesia sebagai bahan obat (Miksusanti, 2010). Salah satu tanaman obat tersebut yaitu tanaman kayu manis (Cinnamomum burmannii Bl.). Kayu manis digunakan dalam industri makanan, minuman, farmasi, kosmetika, dan rokok (Kardinan, 2005). Sebagian besar senyawa yang terkandung dalam kulit batang tumbuhan kayu manis adalah minyak atsiri yang dilaporkan memiliki khasiat antibakteri (Bisset & Wichtl, 2001).
Minyak atsiri kulit batang kayu manis dapat menghambat pertumbuhan
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Pseudomonas aeruginosa (WHO, 1999).
Cinnamaldehyde juga dilaporkan memiliki daya antibakteri terhadap
Oenococcus oeni dan Lactobacillus hilgardii (Figueiredoa, Camposa, Freitas, Hogga, & Coutoa,2007). Menurut Kwon (cit. Figueiredoa et al, 2007), walaupun banyak studi dan penelitian yang sudah memperkenalkan cinnamaldehyde sebagai antibakteri ataupun antifungi, sampai saat ini mekanisme antibakteri dari
cinnamaldehyde belum diketahui secara pasti (Figueiredoa et al, 2007). Penginaktifan enzim tertentu adalah mekanisme umum dari senyawa antibakteri, seperti turunan aldehid, dan etilen oksida. (Siswandono, 1995).
Oleh karena itu, perlu dilakukan pembuktian lebih lanjut untuk memberdayakan tanaman penghasil minyak atsiri yaitu kayu manis (C. burmannii
manis terhadap Streptococcus mutans yang merupakan bakteri penyebab karies gigi.
Pada penelitian ini dilakukan karakterisasi minyak atsiri kulit batang kayu manis (C. burmannii Bl.), meliputi : organoleptis, berat jenis, indek bias dan profil kromatogram lapis tipis untuk mengetahui ada tidaknya kandungan
cinnamaldehyde yang diduga merupakan komponen minyak atsiri kulit kayu manis yang berperan sebagai agen antibakteri. Data hasil uji daya antibakteri menggunakan metode difusi sumuran berupa data diameter zona hambat dianalisis secara statistik menggunakan analisis one way ANOVA yang dilanjutkan LSD
test dengan tujuan mengetahui kebermaknaan hasil diameter zona hambat tiap konsentrasi minyak atsiri dibandingkan kontrol negatif. Data hasil penentuan Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) menggunakan metode dilusi padat dianalisis secara deskriptif. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan suatu informasi tentang daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis sehingga dapat diformulasikan menjadi suatu sediaan, baik berupa pasta gigi ataupun obat kumur yang bertujuan untuk pencegahan karies gigi.
1. Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian dalam latar belakang, maka muncul permasalahan sebagai berikut
4
b. Berapa Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) dari minyak atsiri kulit batang kayu manis terhadap S. mutans?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh pengamatan penulis, penelitian berjudul “Daya Antibakteri Minyak Atsiri Kulit Batang Kayu Manis (Cinnamomum burmannii Bl.) Terhadap
Streptococcus mutans Penyebab Karies Gigi” belum pernah dilakukan. Penelitian sebelumnya yang terkait dengan daya antibakteri terhadap S. mutans dari suatu senyawa atau tanaman dan mengenai kayu manis antara lain :
a. Perbandingan Efek Antibakteri Air Seduhan Daun Sirih (Piper betle Linn) Terhadap Streptococcus mutans pada Waktu Kontak dan Konsentrasi yang Berbeda oleh Hidayaningtias (2008).
b. Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri Kulit Batang Kayu Manis (Cinnamomum burmannii Bl.) Terhadap Staphylococcus aureus dan
Pseudomonas aeruginosa Multiresisten Antibiotik oleh Wiya tno (2010). c. Perbandingan Efek Antibakterial Ekstrak Buah Cacao (Theobroma caccao)
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat teoritis. Penelitian ini diharapkan mampu memberi informasi yang berguna bagi pengembangan tumbuhan obat tradisional yang berkhasiat sebagai antibakteri dan menambah khasanah ilmu pengetahuan mengenai pengembangan dan pemanfaatan obat tradisional di masyarakat, khususnya kulit batang kayu manis.
b. Manfaat praktis. Dengan penelitian ini, masyarakat diharapkan dapat mengetahui kegunaan minyak atsiri dari kulit batang kayu manis yang dapat dikembangkan menjadi obat tradisional yang penggunaannya untuk mencegah karies gigi yang disebabkan oleh Streptococcus mutans.
B. Tujuan Penelitian
1. Memastikan daya antibakteri pada minyak atsiri kulit batang kayu manis terhadap Streptococcus mutans.
6 BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Pengembangan Penemuan Obat
Produk alam merupakan salah satu bahan utama yang berperan dalam penemuan dan pengembangan obat baru. Dalam industri farmasi, penelitian menggunakan produk alam terutama untuk kombinasi kandungan kimia dilakukan dengan teknik High Troughput Screening (HTS). Teknik dengan HTS secara efisien dilakukan untuk skrining berjuta sampel tanaman obat dan hewan hingga pada jaringan dan kultur selnya. Senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman obat yang biasanya memiliki aktivitas biologi yaitu golongan alkaloida, kardenolida, bufadienolida (glikosida jantung), flavonoida, antrakinon, saponin, tanin (polifenolat), minyak atsiri, glikosida sianogenik, dan lain- lain (Samuelsson, 1994).
Obat baru juga dapat ditemukan berdasarkan penelitian terhadap penggunaan obat dalam pengobatan tradisional. Penemuan obat baru dengan metode ini termasuk dalam ethnopharmacology. Penelitian ethnopharmacology
dapat dimulai dengan mengobservasi penggunaan obat tradisional. Observasi dilakukan terhadap khasiat produk alam yang digunakan sebagai obat tradisional untuk mengobati penyakit tertentu dan efek sampingnya (Samuelsson, 1994).
tumbuh-tumbuhan yang banyak terdapat di Indonesia sebagai bahan obat (Miksusanti, 2010).
B. Tanaman Kayu Manis (Cinnamomum burmannii Bl.) 1. Keterangan botani
Kayu manis (Cinnamomum burmannii Bl.) termasuk dalam famili Lauraceae. Nama umum tanaman ini yaitu Java Cinnamon (kayu manis jawa),
Indonesian Cassia dan Padang Cassia. Di Indonesia biasa disebut dengan nama Kayu Manis Padang (Departemen Kesehatan RI, 1977). Tanaman ini memiliki sinonim yaitu : Cinnamomum chinese Bl., Cinnamomum dulce Ness. dan
Cinnamomumkiamis Ness. (Agusta, 2000).
Berbagai macam nama daerah dari tanaman kayu manis, antara lain: di Sumatra adalah holim, holim manis, modang siak-siak (Batak), kanigar, kayu manis (Melayu), madang kulit manih (Minangkabau). Di Jawa adalah huru mentek, kiamis (Sunda), ksnyegar (Kangean) dan di Nusa tenggara adalah kesingar, kecingar, cingar (Bali), onte (Sasak), kaninggu (Sumba), puu ndinga (Flores) (Departemen Kesehatan RI, 1977).
2. Uraian tanaman kayu manis (Cinnamomum burmannii, Bl)
8
manis terdapat sel-sel yang mengandung minyak atsiri (Departemen Kesehatan RI, 1977).
Dikenal 2 varietas kayu manis, varietas pertama yang berdaun muda berwarna merah pekat dan varietas ke dua berdaun hijau ungu. Varietas pertama terdiri dari 2 tipe, yaitu tipe pucuk merah tua dan tipe pucuk merah muda. Varietas pertama adalah varietas yang banyak ditanam di daerah pusat produksi di Sumatra Barat dan Kerinci sedangkan varietas ke dua hanya didapat dalam jumlah populasi yang kecil. Kayu manis pucuk merah mempunyai kualitas yang lebih baik, tetapi produksinya lebih rendah daripada kayu manis yang berpucuk hijau ungu (Departemen Kesehatan RI, 1977).
3. Deskripsi kulit batang kayu manis
Kulit batang kayu manis memiliki bau khas aromatik : rasa agak manis, agak pedas dan kelat. Pada pengamatan secara makroskopik, potongan kulit berbentuk gelondong, agak menggulung membujur, agak pipih atau berupa berkas yang terdiri dari tumpukan beberapa potong kulit yang tergulung membujur; panjang sampai 1 m, tebal kulit 1 mm sampai 3 mm atau lebih (Departemen Kesehatan RI, 1977).
kemerahan tua sampai coklat kehitaman. Bekas patahan tidak rata (Departemen Kesehatan RI, 1977).
Pada pengamatan secara mikroskopik, kulit yang lapisan luarnya belum dibuang akan tampak lapisan epidermis dengan kutikula berwarna kuning ; lapisan gabus terdiri dari beberapa sel berwarna coklat, dinding tangensial dan dinding radial lebih tebal dan berlignin ; kambium gabus jernih tanpa penebalan dinding. Korteks terdiri dari beberapa lapis sel parenkim dengan dinding berwarna coklat, di antaranya terdapat kelompok sel batu, sel lendir dan sel minyak (Departemen Kesehatan RI, 1977).
Gambar 1. Kulit batang kayu manis
4. Kegunaan
10
C. Minyak Atsiri
Minyak atsiri, atau dikenal juga sebagai minyak eteris (aetheric oil), minyak esensial, minyak terbang, serta minyak aromatik, adalah kelompok besar minyak nabati yang berwujud cairan kental pada suhu ruang, namun mudah menguap sehingga memberikan aroma yang khas. Minyak atsiri merupakan bahan dasar dari wangi- wangian atau minyak gosok (untuk pengobatan) alami (Robbers, Marylin,& Varro, 1996).
Pada umumnya minyak atsiri dalam keadaan segar tidak berwarna atau berwarna pucat, berbau sesuai dengan bau tanaman penghasilnya dan larut dalam pelarut organik, tetapi sukar larut dalam air. Minyak atsiri larut dalam etanol namun kurang larut dalam etanol yang kadarnya kurang dari 70%. Kelarutannya akan lebih rendah apabila minyak atsiri tersebut mengandung fraksi terpen dalam jumlah besar. Minyak atsiri menguap pada suhu kamar, penguapan makin banyak bila suhu dinaikkan. (Robbers et al, 1996 ; Departemen Kesehatan RI, 1985).
Minyak atsiri kayu manis dapat diperoleh dari kulit, batang, ranting, atau daunnya dengan cara penyulingan. Kandungan minyak atsiri dalam kulit kayu manis (Cinnamomum burmannii Bl.) yang berasal dari Indonesia sebanyak 1,3-2,7%. Kandungan utama minyaknya adalah cinnamaldehyde (65-80%) (Kardinan, 2005).
sebanyak mungkin, sehingga minyak dapat dengan mudah diuapkan (Guenther, 1987).
1. Kandungan kimia minyak atsiri kulit batang kayu manis
Pada kulit batang kayu manis mengandung paling banyak cinnamic aldehyde atau cinnamaldehyde, sedangkan pada daun lebih banyak mengandung eugenol dibandingkan cinnamaldehyde (Bisset dan Wichtl, 2001). Minyak pada kulit batang kayu manis mengandung cukup banyak aldehid, termasuk di dalamnya yaitu : cinnamaldehyde (70-88%), (E)-o-methoxy-cinnamaldehyde (3-15%), benzaldehyde (0,5 – 2%), salicylaldehyde (0,2 – 1%), cinnamyl acetate (0 – 6%), eugenol (< 0,5 %) dan coumarin (1,5 – 4 %) (Bruneton, 1999).
Gambar 2. Struktur cinnamaldehyde pada minyak atsiri kulit batang kayu manis (Nainggolan, 2008)
Selain itu, kulit batang kayu manis juga mengandung phenylpropanes lainnya meliputi hydroxycinnamaldehyde, o-methoxycinnamaldehyde, cinnamyl alcohol dan asetatnya, dan terpena di antaranya limonene, a-terpineol, tanin, mucilage,oligomeric procyanidins, dan kumarin (Bisset dan Wichtl, 2001).
2. Kegunaan dan khasiat minyak atsiri kulit batang kayu kanis
Minyak atsiri digunakan pada penyakit dysmenorrhoea (nyeri haid) dan
12
manis juga berkhasiat sebagai antibakteri dan fungisidal karena adanya kandungan dari cinnamaldehyde (Bisset & Wichtl, 2001). Adanya sifat menghambat dan merusak dari minyak atsiri dalam proses kehidupan dapat digunakan sebagai bakterisidal dan fungisidal, tetapi tidak semua minyak atsiri dapat menghambat pertumbuhan semua jenis bakteri (Guenther, 1987).
D. Destilasi Minyak Atsiri
Minyak atsiri dapat diisolasi dengan menggunakan beberapa metode, yaitu: destilasi, ekstraksi dengan minyak dingin (enfleurage), ekstraksi dengan lemak panas (maserasi), dan ekstraksi dengan pelarut yang mudah menguap (Tyler, Brady & Robbers , 1988). Pada umumnya minyak atsiri diperoleh dengan cara destilasi dari bahan tumbuhan. Destilasi adalah proses pemisahan komponen yang berupa cairan atau padatan dari dua macam campuran, berdasarkan titik uapnya dan proses ini dilakukan terhadap minyak atsiri yang tidak larut terhadap air (Guenther, 2006). Metode destilasi yang digunakan tergantung pada jenis bahan tanaman.
Ada 3 jenis destilasi, yaitu: 1. Destilasi air
2. Destilasi uap air
Pada destilasi uap air bahan yang akan didestilasi hanya berhubungan dengan uap air panas yang biasanya bertekanan lebih dari 1 atmosfir yang dialirkan dari ketel penghasil uap (Departemen Kesehatan RI, 1985 dan Tyler et al.,1988 ). Destilasi uap air digunakan untuk bahan yang mengandung minyak atsiri dengan titik didih tinggi (Guenther, 2006; Samhoedi, 1976).
3. Destilasi uap dan air
Bahan yang bisa digunakan pada destilasi uap dan air adalah bahan kering atau segar yang mungkin rusak pada pendidihan. Bahan kering, misalnya kayu manis dan cengkeh (Tyler et a., 1988).
Pada destilasi uap dan air, bahan yang didestilasi diletakkan di dalam angsang alat destilasi, sehingga tidak mengalami kontak langsung dengan alas dasar ketel (Guenther, 2006; Samhoedi, 1976). Suhu yang digunakan pada destilasi uap dan air tidak pernah lebih dari 110 oC. Dengan alasan itu, maka kerusakan minyak menjadi lebih kecil dibandingkan dengan minyak yang diperoleh dari hasil penyulingan uap langsung, terutama uap bertekanan tinggi (Guenther, 2006).
14
E. Karakterisasi Minyak Atsiri Kulit Batang Kayu Manis
Setiap jenis minyak atsiri memiliki sifat khas dan sifat ini tergantung dari persenyawaan kimia yang menyusunnya. Sifat-sifa t khas minyak atsiri dapat berubah-ubah mulai dari minyak masih terkandung dalam simplisia, pada tahap pembuatan, penyimpanan maupun pengedarannya.
1. Uji organoleptik
Uji organoleptik merupakan cara yang penting dilakukan dalam menilai kualitas minyak yang tidak dipalsukan. Penilaian berdasarkan bau, warna dan rasa akan memberikan ciri khas minyak atsiri. Minyak atsiri kulit batang kayu manis memiliki bau aromatik kuat dengan warna kuning jernih (Guenther, 2006).
2. Bobot jenis
Bobot jenis suatu zat adalah perbandingan bobot zat terhadap air suling dengan volume sama yang ditimbang di udara pada suhu yang sama, dengan menggunakan alat piknometer pada suhu 25o C. Piknometer merupakan alat penetapan bobot jenis yang praktis dan tepat digunakan (Guenther, 2006). Bobot jenis minyak pada umumnya di antara 0,800 – 1,180. Penentuan bobot jenis adalah salah satu dari cara analisa yang dapat menggambarkan kemurnian minyak (Departemen Kesehatan RI, 1985).
Rumus penentuan bobot jenis suatu zat adalah: (Voigt, 1995)
(1)
3. Indeks bias
Indeks bias suatu zat adalah perbandingan kecepatan cahaya dalam hampa udara dengan kecepatan cahaya dalam zat tersebut. Indeks bias berguna untuk identifikasi zat dan deteksi ketakmurnian (Departemen Kesehatan RI, 1985 dan Departemen Kesehatan RI, 1995). Untuk mencapai ketelitian teoritis ± 0,0001, perlu dilakukan kalibrasi alat terhadap baku yang disediakan dan dilakukan pengecekan terhadap pengendalian suhu dan kebersihan alat dengan menetapkan indeks bias air (Departemen Kesehatan RI, 1995).
F. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah cara pemisahan dengan absorpsi pada lapisan tipis adsorben. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan berbagai senyawa organik, kompleks senyawa organik alam maupun sintetik. Keuntungan dari metode pemisahan dengan kromatografi lapis tipis yaitu waktu lebih cepat dan diperoleh pemisahan yang lebih baik dibandingkan kromatografi kertas (Sastrohamidjojo, 2002).
16
cara, yaitu secara kimia dan fisika. Secara fisika dilakukan dengan sinar ultraviolet, sedangkan secara kimia digunakan pereaksi warna khusus (Stahl, 1985).
Pada umumnya yang sering digunakan sebagai fase diam adalah silika gel, selulosa, tanah diatome dan kieselguhr. Saat ini telah tersedia fase diam dan platnya yang siap pakai dapat berupa gelas kaca yang telah terlapisi dan kromatube (Kopkhar, 1990).
Fase gerak dapat dipilih dengan pencobaan (orientasi fase gerak). Sistem yang paling sederhana ialah dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran ke dua pelarut ini mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Beberapa kriteria pemilihan fase gerak antara lain : fase gerak perlu kemurnian yang tinggi dan daya elusi fase gerak diatur agar harga Rf solut terletak antara 0,2 – 0,8 (Rohman, 2009).
Harga Rf dapat ditentukan sebagai berikut :
pelarut
G. Karies Gigi
Karies gigi adalah penyakit keropos yang dimulai pada lokasi tertentu pada bagian gigi, dan diikuti proses kerusakan atau pembusukan gigi secara cepat. Karies gigi terjadi dimulai dengan adanya penumpukan plak dan produksi asam kemudian dilanjutkan dengan pengikisan mineral- mineral dari permukaan atau enamel gigi karena adanya asam hasil fermentasi karbohidrat dari bakteri
asidogenik (Koswara, 2007; Madigan, Martinko & Parleer, 2000 ).
Bakteri mulut yang paling banyak berada di gigi adalah Streptococcus mutans, bakteri ini di temukan pada mulut saat gigi sudah mulai tumbuh yang kebanyakan hidup secara anaerob fakultatif (Madigan et al., 2000). Kemampuan
S.mutans dalam menghasilkan asam mengakibatkan penurunan pH cairan di sekitar gigi atau bersifat sangat asam, sehingga kondisi ini cukup kuat untuk melarutkan mineral- mineral dari permukaan gigi, sehingga gigi menjadi keropos atau berlubang (Koswara, 2007).
Hal-hal yang mendukung terjadinya karies gigi:
1. Gigi yang peka, yaitu gigi yang mengandung sedikit fluor atau memiliki lubang, lekukan maupun alur yang menahan plak.
2. Bakteri, yaitu mulut mengandung sejumlah besar bakteri, tetapi hanya bakteri jenis tertentu yang menyebabkan pembusukan gigi.
3. Sisa makanan, yaitu makanan yang mengandung banyak sukrosa
18
H. Streptococcus mutans
Sel bakteri S. mutans berbentuk bulat atau lonjong dengan diameter 2 mikrometer merupakan kokus gram positif, koloni berpasangan atau berantai, tidak berspora dan tidak bergerak. Metabolisme bakteri ini bersifat anaerob fakultatif (Collier, Balows, & Sussman, 1998).
Pada tahun 1924, Clarke mengisolasi genus Streptococcus yang sering ditemukan pada lesi karies manusia yang diberi nama Streptococcus mutans.
Newbrun 1983 mengatakan bahwa kuman ini melekat erat pada permukaan gigi (Mangundjaja, 1999 ; Todar, 2007). Bakteri S.mutans mampu melekatkan diri di permukaan gigi dengan sangat kuat karena S.mutans dapat menghasilkan dextran polisakarida yang bersifat adhesive (daya perekat) kuat. S. mutans menghasilkan dextran hanya ketika ada sukrosa dengan bantuan enzim dextransucrase (Madigan
et al., 2000 ).
menjadi dua molekul dengan tiga karbon yaitu glyceraldehydes 3- phosphate
(Madigan et al., 2000 ).
Pada tahap II, terjadi reaksi oksidasi. Reaksi ini berlangsung selama konversi glyceraldehydes 3- phosphate menjadi 1,3-bisphosphoglyceric acid,
koenzim dari reaksi oksidasi adalah NAD+, ketika menerima dua atom hidrogen NAD+ akan dikonversi menjadi enzim NADH, sedangkan enzim yang berperan pada reaksi ini adalah glyceraldehydes-3-phosphate dehidrogenase. Sintesis dari ATP terjadi saat molekul 1,3-bisphosphoglyceric acid dikonversi menjadi 3-phosphoglyceric acid dan glikolisis tahap II ini berakhir ketika beberapa molekul dari phosphoenol pyruvate dikonversi menjadi asam piruvat (Madigan et al., 2000).
Tahap III terjadi terjadi reaksi reoksidasi di mana NADH kembali menjadi NAD+. kemudian dilanjutkan reaksi reduksi dan menghasilkan produk fermentasi. Pada bakteri asam laktat, piruvat direduksi menjadi laktat dengan bantuan dari enzim laktat dehidrogenase yang dimiliki bakteri untuk menghasilkan asam laktat (Madigan et al., 2000 ). Dengan adanya produksi asam laktat ini akan terjadi penurunan pH plak gigi yang kemudian menyebabkan demineralisasi email dan terbentuknya karies gigi (Marsaban, 2007).
20
parah, bakteri dapat memicu kerusakan pembuluh jantung dan menyebabkan gagal jantung kongestif (Richard dan Huemer, 2008).
I. Metode Uji Senyawa Antibakteri
Tujuan dari uji senyawa antibakteri adalah untuk mengetahui apakah suatu senyawa uji dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan mengukur respon pertumbuhan populasi mikroorganisme terhadap agen antibakteri. Obat yang digunakan untuk membasmi bakteri penyebab infeksi pada manusia harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin, bersifat sangat toksik untuk bakteri, tetapi relatif tidak toksik untuk hospes (Pratiwi, 2008; Setiabudy dan Gan, 1995).
1. Metode Difusi
Prinsip metode difusi adalah pengukuran potensi antibakteri berdasarkan pengamatan diameter daerah hambatan bakteri karena berdifusinya obat dari titik awal pemberian ke daerah difusi (Jawetz, Melnick, & Adelberg, 1996). Metode difusi dapat dilakukan dengan cara Kirby Bouwer (McKane and Kandel, 1996).
2. Metode Dilusi
Prinsip metode dilusi adalah larutan uji diencerkan hingga diperoleh beberapa konsentrasi, kemudian masing- masing konsentrasi larutan uji ditambahkan suspensi bakteri dalam media. Pada dilusi padat, tiap konsentrasi larutan uji dicampurkan ke dalam media agar. Setelah padat kemudian ditanami bakteri (Hugo & Russel, 1987). Prosedur uji dilusi digunakan untuk mencari Konsentrasi Hambat Minimum (KHM), yaitu konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM), yaitu konsentrasi terendah yang dapat membunuh bakteri (Universitas Gajah Mada, 1993).
22
J. Landasan Teori
Sebagian besar senyawa yang terkandung dalam kulit batang tanaman kayu manis (Cinnamomum burmannii Bl. ) adalah minyak atsiri. Minyak atsiri kulit batang kayu manis memiliki khasiat sebagai daya antibakteri. Kandungan terbanyak dari minyak atsiri kulit batang kayu manis adalah cinnamaldehyde
(Bisset & Wichtl, 2001).
Metode destilasi uap dan air digunakan untuk mendapatkan destilat dengan jumlah banyak dan melindungi minyak atsiri dari paparan langsung air panas, sehingga kualitas minyak tetap terjaga.
Streptococcus mutans adalah bakteri yang berada dalam mulut, secara anaerobik mampu mencerna atau menghidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa serta menghasilkan dextran lengket dan membentuk plak. Glukosa akan mengalami fermentasi secara anaerob melalui jalur glikolisis. Produk akhir dari proses glikolisis adalah asam laktat yang menyebabkan penurunan pH plak gigi kemudian terbentuk karies gigi. Jika tidak ditangani, infeksi S.mutans akan meluas hingga mencapai bagian pulpa yang banyak terdapat pembuluh darah dan saraf, sehingga bakteri S. mutans patogen dapat masuk ke dalam pembuluh darah dan menginfeksi jantung dan menyebabkan infeksi endokarditis. Pada kasus yang parah, bakteri dapat memicu kerusakan pembuluh jantung dan menyebabkan gagal jantung kongestif (Richard dan Huemer, 2008; Madigan et al., 2000).
manis dapat menghambat pertumbuhan S.mutans serta mengetahui konsentrasi terendah minyak atsiri kulit batang kayu manis dalam menghambat bakteri
S.mutans. Apabila diketahui zona hambat terhadap pertumbuhan bakteri uji maka minyak atsiri dapat dikatakan memiliki daya antibakteri. Pengujian dilakukan dengan metode difusi dan dilusi.
Data hasil uji daya antibakteri menggunakan metode difusi sumuran berupa data diameter zona hambat dianalisis secara statistik menggunakan analisis
one way ANOVA yang dilanjutkan LSD test dengan tujuan mengetahui kebermaknaan hasil diameter zona hambat tiap konsentrasi minyak atsiri dibandingkan kontrol negatif. Data hasil penentuan Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) menggunakan metode dilusi padat dianalisis secara deskrip tif. Dengan adanya penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis, sehingga dapat diformulasikan menjadi suatu sediaan baik berupa pasta gigi ataupun obat kumur yang bertujuan untuk pencegahan karies gigi.
K. HIPOTESIS
Terdapat perbedaan bermakna antara daya antibakteri yang diberikan oleh berbagai konsentrasi minyak atsiri kulit batang kayu manis (Cinnamomum burmannii Bl.) dengan kontrol negative dalam menghambat pertumbuhan
24 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian analisis statistik one way ANOVA yang dilanjutkan dengan LSD test untuk mengetahui adanya kebermaknaan dalam perbedaan hasil diameter zona hambat tiap konsentrasi uji dengan kontrol negatif serta analisis eksploratif deskriptif untuk menentukan KHM dan KBM. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma dan Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas (LPPT) Gadjah Mada Yogyakarta.
B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas: berbagai kadar ekstrak kulit batang kayu manis 100; 50; 25; 20; 15; 10; 5; 3,5 dan 2,5%
b. Variabel tergantung: diameter zona hambat pertumbuhan S. mutans
(cm), nilai KHM dan KBM (%).
dan tempat minyak atsiri, dan asal simplisia kulit batang kayu manis (berasal dari Pasar Beringharjo).
d. Variabel pengacau tak terkendali: umur tanaman dan lingkungan tempat tumbuh tumbuhan kayu manis.
2. Definisi operasional
a. Kulit batang kayu manis (Cinnamomum burmannii Bl.) adalah kulit batang kayu manis yang diperdagangkan dengan nama kayu manis jawa (Java Cinamomum) atau Cassiavera, merupakan kulit batang dengan tebal ± 2 cm, diperoleh dari pasar Beringharjo Yogyakarta yang diidentifikasi keasliannya secara makroskopik dan mikroskopik mengacu pada Materia Medika Indonesia Jilid I (Departemen Kesehatan RI,1977).
b. Destilasi uap dan air adalah proses penyulingan untuk mendapatkan minyak atsiri. Simplisia yang digunakan ditempatkan di atas penampang berlubang dan tidak kontak dengan air yang berada di bawahnya.
c. Minyak atsiri adalah minyak yang dihasilkan dari proses destilasi uap dan air yang berasal kulit batang kayu manis (C. burmanni Bl.) sesuai dengan prosedur yang dilakukan dalam penelitian.
d. Streptococcus mutans merupakan biakan murni yang diperoleh dari Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta
26
f. Kontrol positif dalam penelitian ini adalah minyak atsiri 100% yang digunakan sebagai pengontrol metode dan pembanding.
g. Zona hambat adalah zona jernih yang tidak tampak adanya pertumbuhan koloni S.mutans.
h. Metode difusi dengan sumuran adalah metode yang digunakan untuk mengukur daya hambat minyak atsiri terhadap S.mutans dengan cara mengukur zona jernih (zona hambat) pada sekitar sumuran.
i. Metode dilusi padat adalah metode pengukuran aktivitas antibakteri dengan cara mengencerkan minyak atsiri kulit batang kayu manis pada beberapa konsentrasi, kemudian dicampurkan pada media padat untuk melihat daya hambat minyak atsiri serta menentukan KHM dan KBM. j. KHM adalah Konsentrasi minimum minyak atsiri kulit batang kayu manis
untuk menghambat pertumbuhan S. mutans.
k. KBM adalah konsentrasi minimum minyak atsiri kulit batang kayu manis yang dapat membunuh S. mutans.
C. Bahan Penelitian
D. Alat Penelitian
Microbiological Safety Cabinet, oven (Memmert), piknometer (Pyrex, Iwaki Glass), hand refractometer (Atago) autoklaf (model KT-40, ALP Co. Ltd. Midorigouka Kamurashi, Tokyo, Japan), inkubator (Heraeus), pH meter, sentrifuge (Heraeus Christ), vortex, oven, alat-alat gelas, ose, neraca analitik, mikropipet, pelubang sumuran, seperangkat alat KLT dan seperangkat alat destilasi.
E. Tata Cara Penelitian 1. Pengumpulan bahan kulit batang kayu manis
Kulit batang kayu manis diperoleh dari Pasar Beringharjo Yogyakarta. Kriteria kulit batang yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit batang dengan kulit yang tebal dan warna coklat tua. Kulit batang kayu manis ini dicuci dan dipotong dalam ukuran kecil sekitar ± 2-3 cm dengan lebar 1cm. 2. Identifikasi simplisia kulit batang kayu manis
28
secara mikroskopik dilakukan untuk melihat fragmen khas pada minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan bantuan mikroskop. Pada Materia Medika Indonesia Jilid I disebutkan fragmen pengenal kulit batang kayu manis meliputi: sel minyak, serabut sklerenkim, hablur oksalat dan periderm (Departemen Kesehatan RI,1997).
3. Destilasi minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan cara destilasi uap dan air
Destilasi uap dan air dilakukan dengan cara menimbang kulit batang kayu manis sebanyak 4 kg kemudian didestilasi menggunakan air sebanyak 250 mL selama 4 - 6 jam. Berdasarkan orientasi yang telah dilakukan, waktu 4 – 6 jam optimal untuk dapat mengisolasi minyak atsiri dari kulit batang kayu manis.
Simplisia diletakkan di atas bagian tatagan berlubang-lubang sedangkan air berada di bagian bawah. Kemudian uap air dialirkan melalui pendingin. Setelah itu, hasil destilasi ditampung. Destilat yang dihasilkan berupa minyak atsiri dan air. Pada destilasi ini, minyak dan air akan terpisah dalam dua lapisan. Setelah itu bagian atas yang berupa minyak atsiri diambil dan disentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
4. Karakterisasi minyak atsiri kulit batang kayu manis a. Pemeriksaan organoleptik
b. Pengukuran nilai bobot jenis minyak atsiri
Piknometer dicuci dan dibersihkan dengan hati- hati. Kemudian dibilas berturut-turut dengan etanol dan dietileter. Bagian dalam dikeringkan dengan arus udara kering. Bagian luar diseka dengan kain kering dan disisipkan tutupnya. Piknometer dibiarkan berdiri di dalam lemari timbangan selama 30 menit kemudian ditimbang
Piknometer diisi dengan air suling suhu 25o C yang baru saja dididihkan. Gelembung udara dihindari. Piknometer dicelupkan dalam penangas air pada suhu 25oC ± 0,2 oC selama 30 menit. Suhu penangas air diperiksa dengan termometer dan air suling ditambahkan sampai garis tanda. Penutup disisipkan dan dikeringkan dengan menggunakan kain kering. Pikno dibiarkan berdiri dalam lemari timbangan selama 30 menit dan ditimbang dengan beserta isinya. Piknometer dikosongkan dan dicuci dengan etanol, kemudian dibilas dengan dietileter dan dikeringkan dengan arus udara kering. Piknometer diisi dengan minyak atsiri bersuhu 25o C pada suhu 25o C ± 0,2o C dan dibiarkan selama 30 menit. Piknometer dicelupkan dalam penangas air pada suhu 25oC ± 0,2oC dan dibiarkan berdiri di timbangan selama 30 menit. Permukaan minyak diatur hingga garis tanda (Departemen Kesehatan RI,1985).
c. Pengukuran nilai indeks bias
30
dengan lembut sampai menyentuh prisma utama. Skala di atur 1,2,dan 3 dengan memutar knop sampai tanda “. Jarak jangkauan dari skala tersebut adalah:
“1” :1,333-1,404 (skala sebelah kiri) “2” : 1,404-1,468 (skala tengah)
“3” : 1,468-1,520 (skala sebelah kanan)
Kemudian ujung refraktometer diarahkan ke cahaya terang dan dilihat melalui lensa sambil memutar skala sampai terlihat garis batas gelap dan terang dengan jelas. Akan tampak garis batas yang memisahkan sisi terang pada bagian atas dan bawah. Jika garis batas berwarna sehingga tidak jelas, ring diputar untuk menghilangkan warna hingga garis batas menjadi jelas (jika indeks bias sampel sama sekali tidak dapat diamati,knop diatur pada posisi 1,2,dan 3 dan cari pisisi yang menunjukan perbedaan yang jelas antar bagian yang terang dan gelap). Kalibrasi yang ditunjukan oleh garis batas tersebut memperlihatkan indeks bias (Departemen Kesehatan RI,1985).
5. Identifikasi kualitatif minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan metode KLT
Fase diam yang digunakan adalah silica gel GF254 dan fase gerak yang
digunakan adalah toluene : ethyl asetat (93 : 7). Sebagai pembanding digunakan
cinnamomum oil (teknis) dan cinnamaldehyde. Deteksi menggunakan sinar UV
254 dan 365 nm serta pereaksi semprot vanillin asam sulfat. Pertama, sebanyak 50
larutan minyak atsiri hasil destilasi uap dan air ditotolkan pada plate silica gel 60 GF254. Dilakukan juga penotolan pembanding cinnamaldehyde pada plat yang
sama. Kemudian plate dimasukkan ke dalam chamber jenuh dengan fase gerak toluene : etil asetat (93 : 7) dan dieluasikan hingga batas, lalu diangkat dan dikeringkan. Setelah kering disemprot dengan pereaksi vanillin asam sulfat dan dipanaskan pada suhu 1100 C selama 2 menit, kemudian hitung nilai Rf dan amati warna bercak yang tampak.
6. Sterilisasi peralatan dan media
Peralatan yang digunakan dalam penelitian, terutama yang berhubungan dengan bakteri uji seperti: tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, pipet ukur, dan lain- lain disterilisasikan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 20 menit dengan tekanan 1 atm, sedangkan untuk media TSA dan TSB disterilisasikan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. 7. Penyiapan media uji
32
8. Uji daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan metode difusi sumuran.
a. Penyiapan larutan uji
Dari hasil destilasi dibuat berbagai variasi pengenceran dengan cara melarutkan destilat murni dengan etanol 99,9%. Dibuat beberapa variasi konsentrasi destilat minyak atsiri, meliputi konsentrasi 100 % (sebagai kontrol positif), 50, 25, dan 20%, kemudian diturunkan menjadi 10%,5% dan 2,5% dengan cara melarutkan minyak atsiri ke dalam etanol 99,9% hingga mencapai konsentrasi yang diinginkan.
b. Pembuatan suspens i bakteri
Diambil 1-3 ose isolat murni bakteri S.mutans yang sudah dibiakkan, diinokulasikan ke dalam 5 ml TSB dan divortex supaya tercampur merata, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Dibuat suspensi bakteri uji dan disetarakan dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml) dengan cara menyetarakan kekeruhan suspensi bakteri dengan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml), jika kekeruhannya melebihi kekeruhan Mc Farland II, maka dilakukan penambahan media TSB steril sampai didapat kekeruhan yang sama.
c. Penanaman isolat S.mutans secara pour plate.
memadat terlebih dahulu. Tiga bagian digunakan sebagai layer atas, yang dituang setelah diinokulasi dengan bakteri uji.
Untuk layer atas, diambil 0,1 mL dari stok suspensi bakteri uji yang sudah disetarakan dengan larutan standar Mc Farland II, diinokulasikan ke media TSA secara pour plate. Media TSA yang mengandung bakteri dibiarkan beberapa saat supaya memadat.
d. Uji daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis terhadap S.mutans dengan difusi sumuran.
Dengan menggunakan pelubang sumuran, dibuat lubang-lubang pada media TSA yang telah memadat dengan diameter 6 mm, sebagai tempat minyak atsiri dengan berbagai variasi konsentrasi, kontrol negatif (etanol 99,9%) dan kontrol positif (minyak atsiri 100%). Pembuatan lubang hanya menembus layer atas, layer bawah digunakan sebagai alas supaya destilat tidak menyebar pada dasar cawan petri.
Minyak atsiri dengan berbagai konsentrasi (20 – 50%) diinokulasikan pada lubang sumuran yang tersedia. dan kontrol negatif yang digunakan adalah etanol 99,9% dan kontrol positif adalah minyak atsiri 100%. Volume yang diinokulasikan adalah 30 µl. Diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37o C, kemudian diamati diameter zona jernih yang dihasilkan.
34
KHM dan KBM. Daya antibakteri diamati berdasarkan diameter zona hambat yang terbentuk dibandingkan dengan kontrol negatif etanol 99,9%.
9. Penentuan nilai KHM dan KBM dengan dilusi padat
Pada uji ini menggunakan tiga macam kontrol, yaitu kontrol kontaminasi media, kontrol pertumbuhan bakteri, dan kontrol negatif (kontrol pelarut). Kontrol kontaminasi media dibuat dengan menuang media TSA pada cawan petri steril. Kontrol pertumbuhan bakteri dibuat dengan menambahkan bakteri uji pada media TSA kemudian dilakukan pour plate pada cawan petri steril. Kontrol pelarut dibuat dengan menambahkan pelarut ekstrak, yaitu etanol pada media TSA kemudian dilakukan pour plate pada cawan petri steril.
a. Uji daya antibakteri dengan dilusi padat
Diambil 1-3 ose bakteri uji, kemudian disuspensikan ke dalam 5 ml TSB, divortex sampai rata dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Hasil suspensi dibandingkan dengan standar Mc Farland II hingga kekeruhannya sama, lalu diambil suspensi bakteri 0,1 ml. Destilat dengan kadar tertentu, sesuai dengan hasil pada uji sebelumnya, ditambahkan dalam suspensi tadi dan dicampur rata dengan 10 ml TSA yang dicairkan (suhu 45-50°C), kemudian dituang dalam cawan petri secara pour plate. Diinkubasikan dalam suhu 37°C, dilakukan pengamatan setelah 24 jam diinkubasi.
agak keruh dan (-) jernih. Kekeruhan masing- masing perlakuan dibandingkan dengan kontrol sterilitas dan kontrol pertumbuhan.
b. Penentuan nilai KHM dan KBM
Penentuan nilai KHM dan KBM dilakukan dengan melakukan
streak plate dari hasil uji daya antibakteri secara dilusi padat. Hasil uji yang digunakan adalah semua media yang memberikan kejernihan media secara visual. KHM adalah konsentrasi terkecil yang dapat menghambat bakteri, ditandai dengan S.mutans masih dapat tumbuh pada hasil streak plate,
sedangkan KBM adalah konsentrasi terkecil yang dapat membunuh bakteri, ditandai dengan S.mutans sudah tidak dapat tumbuh pada hasil streak plate
yang menandakan bakteri uji mati karena larutan uji dengan konsentrasi tersebut (McKane & Kandel, 1996; Koneman, Allen & Schreckenbergerr, 1997).
F. Analisis Data
Data diameter zona hambat pada pertumbuhan bakteri diuji distrib usi normalnya dengan Kolmogorov-Smirnov, jika normal maka dianalisis kebermaknaan beda tiap hasil dengan ANOVA satu arah pada taraf kepercayaan 95% dengan H1 yaitu terdapat perbedaan bermakna antar sampel, kemudian
dilanjutkan dengan uji LSD (Least Significant Different). Jika data terdistribusi tidak normal maka data dianalisis menggunakan uji Kruskal Wallis yang kemudian dilanjutkan dengan uji Mann Whitney.
36
37
A. Identifikasi Simplisia Kulit Batang Kayu Manis
Kulit batang kayu manis yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta dalam bentuk simplisia kering. Kulit batang kayu manis yang dipilih adalah kulit batang yang keras dan tebal. Kebenaran simplisia dibuktikan dengan identifikasi simplisia secara makroskopik dan mikroskopik yang mengacu pada ketentuan persyaratan simplisia dalam Materia Medika Indonesia jilid I (Departemen Kesehatan RI,1977).
Identifikasi simplisia dilakukan dengan pemerian secara makroskopik dan mikroskopik, yaitu
38
Gambar 3. Kulit batang kayu manis
Hasil menunjukkan bahwa simplisia yang diteliti memiliki morfologi, ukuran dan warna yang sesuai dengan ketentuan makroskopik kulit batang kayu manis pada Materia Medika Indonesia Jilid I (Departemen Kesehatan RI,1977)
Gambar 4. Hablur oksalat Gambar 5. Periderm
Gambar 6. Sel minyak pada sel periderm
Gambar 7. Serabut sklerenkim
Gambar 8. Serabut sklerenkim pada sel minyak
Gambar 9. Sel minyak
40
Berdasarkan hasil identifikasi makroskopik dan mikroskopik yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa simplisia yang digunakan dalam penelitian ini benar-benar adalah kulit batang kayu manis (C.burmannii,Bl.).
B. Penyiapan Bahan Kulit Batang Kayu Manis
Penyiapan bahan kulit batang kayu manis dilakukan dengan tahapan pemotongan dan pencucian kulit batang kayu manis. Pada proses pemotongan kulit batang kayu manis ini dipotong dengan panjang ± 3 cm. Pemotongan bertujuan untuk memperluas kontak antara uap air dengan bahan yang didestilasi, sehingga minyak atsiri yang terekstrak banyak dan jumlah minyak atsiri yang dihasilkan banyak. Pencucian bertujuan untuk membersihkan simplisia dari debu atau pengotor lainnya agar pengotor dapat diminimalisasi.
Proses destilasi harus terhindar dari kebocoran uap air karena bila hal ini terjadi, maka akan ada minyak yang akan terbuang. Untuk itu proses detilasi dijaga dengan memberi vaselin pada tiap sambungan pipa kaca dan ditutup dengan aluminium foil karena minyak atsiri bersifat fotosensitif. Uap air dan minyak atsiri akan teruap bersama, kemudian masuk ke dalam pendingin Liebigh sehingga mengembun dan dengan adanya gaya gravitasi akan jatuh masuk ke dalam tabung berskala. Pada tabung berskala ini akan terlihat fase minyak dan fase air. Berdasarkan bobot jenisnya, fase minyak dan air akan terpisah di mana fase air berada di bawah dan fase minyak berada di atasnya karena berat jenis air lebih besar daripada minyak.
Gambar 10. Minyak atsiri kulit batang kayu manis hasil destilasi uap dan air
Minyak atsiri setelah dipisahkan dari air lalu disentrifuge untuk menghilangkan kandungan air. Minyak atsiri yang dihasilkan dari hasil destilasi berwarna kuning muda jernih dan berbau aromatis kuat.
42
Data perolehan volume minyak atsiri dari destilasi ditunjukkan sebagai berikut :
Tabel I. Volume minyak hasil destilasi kulit batang kayu manis Replikasi Berat kulit (kg) Volume minyak atsiri
(mL)
Replikasi 1 3,00 7,50
Replikasi 2 4,00 12,60
Replikasi 3 3,80 11,00
Daya tampung maksimal alat penampung kulit batang kayu manis pada alat destilasi (dandang) adalah 4 kg. Dapat dilihat dari Tabel I, volume yang dihasilkan tidak reprodusibel. Hal ini dimungkinkan karena ukuran potongan simplisia yang tidak seragam dan lamanya waktu destilasi yang tidak sama. Namun hasil ya ng demikian tidak mempengaruhi jalannya penelitian karena penelitian ini tidak menitikberatkan pada rendemen minyak atsiri dari kulit batang kayu manis hasil destilasi, melainkan uji antibakteri minyak atsiri yang dihasilkan dari destilasi uap dan air.
D. Karakterisasi Minyak Atsiri Kulit Batang Kayu Manis
Penelitian ini bertujuan untuk menggambarkan karakter khas minyak yang terkandung dalam kulit batang kayu manis secara kualitatif. Karakterisasi yang dilakukan adalah pemeriksaan organoleptis, bobot jenis, indeks bias, dan KLT.
1. Pemeriksaan organoleptis minyak atsiri kulit batang kayu manis
dengan menggunakan indera dengan cara dilihat, diraba dan dibaui untuk mendeskripsikan warna, kejernihan dan bau minyak atsiri. Hasil pemeriksaan organoleptik disajikan dalam tabel II sebagai berikut :
Tabel II. Pemeriksaan organoleptis minyak hasil destilasi Pemeriksaan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Bau Aromatis kuat Aromatis kuat Aromatis kuat Warna Kuning muda Kejernihan Sangat jernih Sangat jernih Sangat jernih
Uji organoleptik bermanfaat untuk mengenal minyak atsiri yang diuji benar-benar berasal dari simplisia kulit batang kayu manis karena minyak atsiri merupakan kandungan yang paling berperan dalam memberikan aroma pada tanamannya. Berdasarkan MMI jilid 1 (Departemen Kesehatan RI,1977), pemeriksaan organoleptis minyak atsiri yang telah dilakukan sudah sesuai, yaitu bau khas aromatik kuat.
2. Bobot jenis minyak atsiri kulit batang kayu manis
44
Berdasarkan penelitian yang dilakukan diperoleh data seperti pada tabel III : Tabel III. Bobot jenis minyak atsiri kuli batang kayu manis
Replikasi Bobot jenis
Replikasi 1 0,98
Replikasi 2 0,96
Replikasi 3 0,98
Rata-rata ±SD 0,97 ± 0,01
Hasil ini bisa dikatakan reprodusibel karena simpangannya kecil. Bisa dilihat bahwa minyak atsiri memiliki bobot jenis yang lebih kecil dibandingkan bobot jenis air. Hal ini juga ditunjukan pada saat penampungan hasil destilasi yaitu terbentuk 2 lapisan (Gambar 10). Fase minyak yang memiliki bobot jenis yang lebih kecil daripada bobot jenis air berada di lapisan atas. Pada buku Cara Pembuatan Simplisia (Departemen Kesehatan RI,1985) disebutkan bahwa BJ minyak pada umumnya berkisar antara 0,80-1,18, dilihat dari rata-rata bobot jenisnya dapat dikatakan minyak yang dihasilkan dari proses destilasi uap dan air benar-benar murni.
3. Nilai indeks bias minyak atsiri kulit batang kayu manis
Pemeriksaan ini bertujuan untuk mengetahui nilai indeks bias minyak atsiri kulit batang kayu manis. Alat yang digunakan untuk mengukur indeks bias adalah hand refractometer. Prinsip kerja dari refraktometer adalah memanfaatkan refraksi cahaya, sehingga dengan adanya cahaya polikromatis yang masuk mengenai prisma akan diubah menjadi cahaya monokromatis, kemudian dibaca skalanya sebagai indeks bias cairan uji (Guent her,2006).
sebanyak 1-2 tetes, hal ini dikarenakan karena dengan penetesan senyak 1-2 tetes minyak sudah dapat tersebar merata pada prisma dan jika terlalu banyak yang diteteskan, minyak akan tumpah dan kerapatan zat akan semakin tinggi, sehingga akan sulit untuk dilewati cahaya (Departemen Kesehatan RI, 1985).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan, diperoleh data nilai indeks bias minyak atsiri kulit batang kayu manis pada tabel IV :
Tabel IV. Indeks bias minyak atsiri kulit batang kayu manis
Replikasi Indeks bias
Replikasi 1 1,370
Replikasi 2 1,372
Replikasi 3 1,375
Rata-rata±SD 1,372 ± 0,252 x 10-2
Pada pengamatan tidak terlihat adanya garis gelap-terang yang jelas dan dibaca dengan skala 1 dengan rentang pembacaan 1,333 – 1,404. Hasil ini reprodusibel untuk tiap kali replikasi karena simpangan yang kecil.
E. Profil Kromatografi Lapis Tipis Minyak Atsiri Kulit Batang Kayu Manis
Pemeriksaan ini bertujuan untuk membuktikan adanya kandungan
46
Pada uji identifikasi kandungan minyak atsiri kulit batang kayu manis yang dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia digunakan pembanding
cinnamomi oil teknis kadar 80-85% dan pada analisis di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM menggunakan pembanding cinnamaldehyde baku. Tujuan digunakan dua pembanding adalah untuk memastikan minyak atsiri yang diisolasi dengan destilasi uap dan air adalah minyak atsiri kulit batang kayu manis dan kebenaran cinnamaldehyde sebagai kandungan terbesar dari minyak atsiri kulit batang kayu manis.
Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF254, dengan pertimbangan
bahwa fase diam ini bersifat polar agar dapat mengikat komponen-komponen pengotor yang bersifat polar juga, sehingga terjadi pemisahan antara minyak atsiri ataupun cinnamaldehyde dengan pengotor atau komponen lainnya. Hal ini karena silika gel memiliki kerja yang sangat baik terutama untuk pemisahan aldehid.
Setelah dilakukan elusi maka dilakukan deteksi bercak yang dihasilkan dengan pengamatan di bawah sinar UV 254 nm dan dengan pereaksi semprot vanilin asam sulfat pekat. Vanillin asam sulfat akan bereaksi dengan minyak atsiri sehingga menghasilkan warna dan menunjukkan pemisahan. Kemudian plat dipanaskan pada suhu 110o C selama 2 menit di dalam oven. Hal ini bertujuan untuk mengaktivasi pereaksi semprot agar bereaksi dengan sampel dan menghasilkan warna yang jelas untuk melihat pemisahan yang terjadi. Warna yang dihasilkan dari minyak atsiri dan cinnamaldehyde adalah merah muda kecoklatan.
(a) (b) Gambar 11.
48
(b) Kromatogram minyak atsiri hasil destilasi dengan pembanding
cinnamaldehyde pada deteksi UV 254 nm
Keterangan : a = Rf : 0,58 e = Rf : 0,38 b = Rf : 0,56 f = Rf : 0,37 c = Rf : 0,65 g = Rf : 0,59 d = Rf : 0,07
Berdasarkan data kromatogram minyak atsiri (Gambar 11) dengan pembanding cinnamomi oil (teknis) pada pengamatan di bawah sinar UV 254 nm, diketahui bahwa nilai Rf minyak atsiri hasil destilasi = 0,56 dan Rf cinnamomi oil
= 0,58. Ke dua minyak ini memiliki Rf yang hampir sama, secara kualitatif terbukti bahwa minyak atsiri hasil destilasi tersebut sama dengan cinnamomi oil
(a) (b) Gambar 12.
(a) Kromatogram minyak atsiri hasil destilasi dengan pembanding
cinnamaldehyde pada pengamatan UV 365 nm
(b) Kromatogram minyak atsiri hasil destilasi dan pembanding
cinnamaldehyde pada pengamatan visibel
Table V. Nilai Rf minyak atsiri hasil destilasi dengan pembanding cinnamomi oil
Senyawa Nilai Rf
UV 254 UV 365
Minyak atsiri 0,56 Tidak tampak
50
Tabel VI. Nilai Rf dan warna bercak minyak atsiri hasil destilasi dengan pembanding cinnamaldehyde
Senyawa Nilai Rf Warna bercak
UV 254 UV visibel UV 365
Minyak atsiri 0,37 0,37 tidak tampak Merah muda
kecoklatan
Cinnamaldehyde 0,38 0,38 tidak tampak Merah muda
kecoklatan
Pada pengamatan secara visibel dengan pembanding cinnamaldehyde
(gambar 12) terjadi pemisahan senyawa dengan nilai Rf masing - masing minyak atsiri kulit batang kayu manis = 0,37 dan nilai Rf cinnamaldehyde = 0,38. Ke duanya memilki nilai Rf yang sama dan mirip, hal ini membuktikan bahwa kemungkinan besar dalam minyak atsiri hasil destilasi tersebut mengandung
cinnamaldehyde. Pada pengamatan dengan UV panjang gelombang 365 nm, pemisahan bercak pada kedua sampel tidak nampak dan tidak tampak pemisahannya, sehingga Rf tidak dapat diukur. Hal ini terjadi karena minyak atsiri berfluororesensi pada UV 254.
1. Uji daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan difusi sumuran
Uji daya antibakteri secara difusi sumuran bertujuan untuk mengetahui besarnya diameter zona hambat pertumbuhan bakteri. Difusi sumuran dipilih sebagai metode uji antibakteri berdasarkan sifat bahan uji minyak atsiri yang memiliki kepolaran rendah (non polar). Difusi sumuran dilakukan dengan membuat lubang sumuran pada media agar padat dengan menggunakan pelubang sumuran berdiamater 0,6 cm. Kontrol yang digunakan pada metode ini adalah kontrol sterilitas media, kontrol pertumbuhan bakteri uji (S.mutans), kontrol negatif (etanol 99,9%) dan kontrol positif ( minyak atsiri 100%).
Suatu senyawa yang diuji dengan difusi sumuran dikatakan memiliki daya antibakteri jika memiliki diameter zona hambat lebih besar dibandingkan kontrol negatif dan memiliki perbedaan yang bermakna dengan kontrol negatif.
Kontrol sterilitas media dalam uji difusi sumuran berfungsi untuk pengamatan keaseptisan langkah penelitian dan mengetahui tingkat sterilitas media yang digunakan). Media yang tidak steril dapat mengacaukan penelitian karena yang diuji tidak hanya bakteri uji . Kontrol sterilitas media dibuat dengan cara menuang media TSA steril pada cawan petri steril kemudian dilakukan pembuatan sumuran. Hasil pengamatan menunjukan tidak ada pertumbuhan bakteri pada media, maka dapat disimpulkan bahwa media yang digunakan steril dan langkah pelubangan sumuran bebas dari kontaminasi.
52
menambahkan bakteri uji pada media dan dituang pada cawan petri steril secara
pour plate. Hasil pengamatan bakteri dapat tumbuh dengan baik.
Kontrol negatif pada difusi sumuran berfungsi untuk melihat pelarut minyak atsiri yang digunakan memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri atau tidak. Pelarut yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri akan membiaskan hasil penelitian, karena kemungkinan daya antibakteri yang didapat tidak hanya dari minyak atsiri melainkan juga dari pelarutnya. Apabila kontrol negatif tidak memiliki zona jernih atau zona hambat, maka dapat disimpulkan bahwa minyak atsiri kulit batang kayu manis memiliki daya sebagai antibakteri . Kontrol negatif yang digunakan adalah etanol 99,9%. Digunakan etanol 99,9 % sebagai kontrol negatif karena minyak atsiri larut dengan baik (larutan jernih) pada konsentrasi 99,9%. Kontrol negatif dalam metode difusi sumuran ini dibuat dengan memberikan etanol 99,9% pada lubang sumuran.
