BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di kebun percobaan Cikabayan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari Oktober 2011 sampai Juni 2012.
Perbanyakan Inokulum BCMV
Isolat BCMV asal Cirebon diperoleh dari koleksi Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman. Inokulum diperbanyak pada tanaman kacang panjang kultivar Parade sesuai petunjuk Djikstra dan De Jager (1998). Kacang panjang berumur 7 hari setelah tanam (HST) diinokulasi dengan BCMV secara mekanis. Prinsip dari metode ini adalah menularkan virus dengan mengoleskan cairan perasan pada permukaan daun sehingga virus dapat masuk ke dalam sel tanaman. Cairan perasan dibuat dengan cara menggerus daun terinfeksi BCMV dalam 0.01 M bufer fosfat pH 7.0 yang mengandung merkaptoetanol 1% dengan perbandingan 1:5 (b/v). Daun digerus pada mortar steril. Daun yang akan diinokulasi virus dilukai dengan karborundum 600 mesh. Cairan perasan yang mengandung virus kemudian dioleskan pada permukaan atas daun dengan tangan. Serbuk karborundum yang masih menempel pada daun dibersihkan menggunakan air mengalir.
Persiapan Lahan dan Tanaman Uji
Lahan yang digunakan berupa lahan kering berukuran 100 m2. Pengolahan lahan dilakukan 60 hari sebelum tanam. Bedengan dibuat dengan panjang 250 cm, lebar 150 cm, dan tinggi 30 cm. Jarak antara bedengan 50 cm. Jumlah bedengan sebanyak 15 bedengan. Pupuk kompos disebar pada alur pertanaman dengan dosis 75 ton/ha. Pemberian pupuk kompos dilakukan satu bulan sebelum tanam.
Benih kacang panjang yang digunakan adalah kultivar Parade yang diperoleh dari toko pertanian Kabupaten Subang, Jawa Barat. Penanaman dan pemupukan dilakukan sesuai petunjuk Adijaya et al. (2005). Benih ditanam pada
kedalaman 4-5 cm sebanyak 3 benih per lubang dengan jarak tanam 20 x 50 cm. Pupuk anorganik disebar di samping alur pertanaman dengan jarak 5-10 cm dari alur pertanaman. Pemupukan dilakukan 2 kali yaitu pada saat tanam dan pada saat tanaman berumur 2 minggu setelah tanam (MST). Pada pemupukan pertama digunakan urea, SP-36, dan KCl masing-masing dengan dosis 50 kg/ha, 100 kg/ha, dan 200 kg/ha. Pada pemupukan kedua digunakan pupuk urea dengan dosis 50 kg/ha. Penjarangan dilakukan pada 2 MST dengan memilih salah satu tanaman kacang panjang yang menunjukkan pertumbuhan yang sehat.
Inokulasi BCMV ke Tanaman
Inokulasi BCMV pada tanaman uji dilakukan secara mekanis yaitu melalui luka halus pada permukaan tanaman. Prinsipnya sama dengan penularan mekanis pada saat perbanyakan inokulum. Inokulasi BCMV pada tanaman dilakukan pada waktu yang berbeda-beda yaitu 1, 2, 3 dan 4 MST. Pada perlakuan kontrol, tidak dilakukan inokulasi pada tanaman uji hingga tanaman panen. Tiap perlakuan terdiri atas 3 ulangan masing-masing terdiri atas 20 tanaman.
Pemeliharaan Tanaman dan Pemanenan Kacang Panjang
Tanaman kacang panjang disiram setiap hari hingga tanaman berumur 2 MST. Penyiraman selanjutnya hanya dilakukan 3 hari sekali. Penyiangan gulma dilakukan pada saat 2 dan 4 MST. Ajir dengan tinggi 2 meter dipasang di samping tanaman pada saat 2 MST. Pemantauan hama dan penyakit tanaman dilakukan setiap hari khususnya untuk hama Aphis craccivora yang merupakan vektor BCMV. Pengendalian A. craccivora secara mekanis dilakukan sejak tanaman berumur 1 MST. Saat tanaman berumur 4 MST pengendalian secara kimiawi dilakukan menggunakan insektisida berbahan aktif imidaklorpid 5% dengan volume cairan semprot 725 l/ha.
Panen pertama kacang panjang dilakukan pada saat tanaman berumur 8 MST. Panen dilakukan sebanyak 3 kali dengan interval panen 1 kali seminggu. Setelah panen, bobot polong ditimbang. Selanjutnya, polong kacang panjang
dijemur di bawah sinar matahari hingga kering. Benih kacang panjang kemudian dikelompokkan berdasarkan perlakuan.
Deteksi BCMV dari Tanaman dan Benih
Deteksi BCMV dari lapangan dilakukan untuk mengetahui perbedaan titer virus untuk masing-masing perlakuan. Daun diambil pada saat tanaman berumur 4 minggu setelah inokulasi (MSI). Daun diambil menggunakan tutup eppendorf ukuran 1.5 ml untuk keseragaman sampel uji (bobot daun 1 tutup eppendorf = 0.01 g). Setiap ulangan dari masing-masing perlakuan (inokulasi 1, 2, 3, dan 4 MST) dikompositkan sehingga terdapat 12 sampel komposit (SK) (tiap perlakuan terdiri atas 3 ulangan, 1 komposit mewakili 1 ulangan).
Sebanyak 100 benih kacang panjang hasil inokulasi BCMV pada umur tanaman yang berbeda ditanam untuk mengetahui persentase BCMV terbawa benih. Benih ditanam pada media tanah dalam nampan persemaian. Jumlah benih yang ditanam sebanyak 100 benih dari masing-masing perlakuan inokulasi. Daun kacang panjang diambil saat tanaman berumur lebih dari 3 MST. Daun diambil dengan menggunakan tutup eppendorf ukuran 1.5 ml. Tiap 5 sampel daun dari 5 tanaman uji dibuat menjadi 1 SK sehingga total SK berjumlah 20 untuk setiap perlakuan. Sampel tanaman dan sampel asal benih kemudian dideteksi secara serologi menggunakan antiserum BCMV dengan metode indirect ELISA sesuai dengan protokol yang dibuat oleh produsen antiserum (Agdia). SK benih yang positif kemudian dideteksi lanjut secara individu untuk mengetahui persentase BCMV terbawa benih.
Cairan perasan tanaman (antigen) disiapkan dengan menggerus daun yang
diberi bufer ekstraksi [1.59 g Na2CO3, 0.293 g NaHCO3, 0.20 g NaN3,
20 g polivinilpirrolidon (PVP) yang dilarutkan dalam 1 L air steril, pH 9.6] dengan perbandingan 1:100 (b/v). Daun digerus pada plastik bening ukuran 15 x 10 cm. Sebanyak 100 μl cairan perasan diisi ke dalam sumuran ELISA. Plat ELISA diinkubasi semalam pada suhu 4 ºC. Setelah itu, plat dicuci sebanyak 4-8 kali dengan phosphate buffer saline Tween-20 (PBST) [8 g NaCl, 2 g KH2PO4,
1.15 g Na2HPO4, 0.2 g KCl 0.5 ml, Tween 20 yang dilarutkan dalam 1 L air steril,
dalam bufer ECI [2 g bovine serum albumin, 20 g PVP, 0.2 g NaN3 yang
dilarutkan dalam 1 liter air steril, pH 7.4]. Setelah itu, plat diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 ºC, kemudian plat dicuci 4-8 kali dengan PBST.
Antiserum RaM-AP (rabbit anti mouse yang telah dilabel enzim alkaline phosphatase) (antiserum kedua) kemudian dimasukkan pada sumuran sebanyak 100 μl setelah dilakukan pengenceran menggunakan bufer ECI (1:200) dan diinkubasi selama 1-2 jam pada suhu 37 ºC. Plat kemudian dicuci dengan PBST sebanyak 4-8 kali. Setelah plat dicuci, tiap sumuran diisi dengan 100 μl substrat p-nitrofenilfosfat (PNP). Setiap 1 tablet PNP (5 mg) dilarutkan dalam 5 ml bufer PNP [97 ml dietanolamin, 0.2 g NaN3, 0.1 g MgCl2, dilarutkan dengan air steril
hingga volume larutan 1 L, pH 9.8] dan diinkubasi pada suhu ruang hingga terjadi perubahan warna menjadi kuning. Hasil ELISA dibaca secara kuantitatif dengan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Sampel dinyatakan positif jika nilai absorbansi ELISA (NAE) sampel uji 1.5 kali lebih besar dibandingkan dengan kontrol negatif (tanaman sehat).
Peubah Pengamatan
Pengamatan yang dilakukan meliputi periode inkubasi, tipe gejala, kejadian penyakit, keparahan penyakit, persentase BCMV terbawa benih, tinggi tanaman, jumlah daun, masa berbunga, dan bobot produksi. Periode inkubasi virus dihitung sejak virus diinokulasi hingga menunjukkan gejala pada tanaman. Kejadian penyakit pada tanaman ditentukan dengan menghitung jumlah tanaman sakit dan membandingkan jumlah tanaman uji yang digunakan. Kejadian penyakit dihitung dengan menggunakan rumus (Cooke 1998):
Keparahan penyakit dihitung setiap minggu dengan mengukur skor penyakit pada masing-masing tanaman uji. Kategori skor yang digunakan (Gambar 1) yaitu:
Jumlah tanaman terinfeksi
KP = X 100%
0 : tidak bergejala 1 : gejala mosaik ringan 2 : gejala mosaik sedang 3 : gejala mosaik berat
4 : gejala mosaik berat dengan malformasi daun yang parah, kerdil, atau mati
Gambar 1 Skor keparahan penyakit berdasarkan gejala visual. (a) Skor 0, (b) skor 1, (c) skor 2, (d) skor 3, (e) skor 4.
Nilai skor yang diukur dikonversi dalam nilai keparahan penyakit (disease severity) berdasarkan rumus Townsend dan Heüberger (1974 dalam Agrios 2005):
I = keparahan penyakit
ni = jumlah tanaman dengan skor ke-i
vi = nilai skor penyakit
N= jumlah tanaman yang diamati V= skor tertinggi
Persentase BCMV terbawa benih diperoleh dari individu benih yang positif BCMV hasil deteksi serologi indirect ELISA. Rumus yang digunakan adalah sebagai berikut.
Pengukuran tinggi tanaman dan jumlah daun dilakukan 2 minggu sekali hingga tanaman berumur 6 MST. Tinggi tanaman diukur mulai dari dari pangkal
∑ (ni x vi)
I = x 100%
N x V
Jumlah benih positif BCMV
Persentase BCMV terbawa benih = x 100%
Jumlah benih uji
a
b
c
d
e
batang hingga titik tumbuh. Masa berbunga tanaman ditentukan dengan mencatat waktu munculnya bunga pertama pada tiap tanaman.
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak kelompok. Perlakuan yang diuji ada 5 yaitu 1, 2, 3, 4 MST, dan kontrol. Masing-masing perlakuan terdiri atas 3 ulangan dan masing-masing ulangan terdiri atas 20 tanaman. Data periode inkubasi, kejadian penyakit, keparahan penyakit, tinggi tanaman, jumlah daun, masa berbunga, dan produksi polong kacang panjang dianalisis dengan sidik ragam menggunakan program SAS for windows versi 9.0. Perlakuan yang memberikan pengaruh nyata diuji dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf α = 5%.
