75
Gambar 1. Skema penggolongan HIV-1 [Sumber: Korber dkk. 2001: 22--25.]
Gambar 2. Struktur virus HIV-1 [Sumber: Henriksen 2003: 12.]
Gambar 3. Struktur genom HIV-1[Sumber: Bohne dkk. 2005: 826.]
Gambar 4. Siklus hidup HIV-1 [Sumber: Henriksen 2003: 14.]
Keterangan:
5’ LTR : daerah 5’ Long Terminal Region gag : gen gag HIV-1 pol : gen pol HIV-1 vif : gen vif HIV-1 vpr : gen vpr HIV-1 vpu : gen vpu HIV-1 tat 1 : gen tat ekson 1 tat 2 : gen tat ekson 2 rev 1 : gen rev ekson 1 rev 2 : gen rev ekson 2 nef : gen nef
RRE : Rev Responsive Element 3’ LTR : daerah 3’ Long Terminal Region
77
Gambar 5. Pola pemotongan mRNA primer dan regulasi ekspresi gen HIV-1 [Sumber: Bohne dkk. 2005: 826.]
Gambar 6. Skema overlapping extension PCR [Sumber: Roche 2002: 4.]
79
5821 gagcaagaaa tggagccagt agatcctaga ctagagccct ggaagcatcc aggaagtcag 5881 cctaaaactg cttgtaccaa ttgctattgt aaaaagtgtt gctttcattg ccaagtttgt
5941 ttcatgacaa aagccttagg catctcctat ggcaggaaga agcggagaca gcgacgaaga 6001 gctcatcaga acagtcagac tcatcaagct tctctatcaa agcagtaagt agtacatgta
8341 gcagggatat tcaccattat cgtttcaga c ccacctccca atcccga ggg gacccgacag 8401 gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca ttcgattagt
Keterangan:
cccggg : situs restriksi XmaI atcaaagcag : overlap region primer Ex2-TatpNL4 gtcgac : situs restriksi SalI gggtggaggg :overlap region primer Ex1-TatpNL4C
Gambar 8. Sekuen fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1, posisi primer Ex1-TatpNL4, Ex1-TatpNL4C, Ex2-TatpNL4 & Ex2-TatpNL4C, dan posisi situs restriksi XmaI dan SalI pada peta plasmid pNL43 [Accession number M19921.1]
a tggagccagt agatcctaga tccccccgggg XmaI Ex1-TatpNL4 tgtct c tg tc taggtaagctaatccagctgccct SalI Ex2-TatpNL4C atcaa agcag c ccacctcccaatcccga Ex2-TatpNL4 ttcgaagagatagtt tc gtc Ex1-TatpNL4C gggtggaggg 79
Gambar 9. Skema cara kerja Verifikasi plasmid rekombinan XmaI SalI XmaI SalI
Digesti DNA vektor dan sisipan
Ligasi dengan T4 DNA ligase
Sintesis fragmen gen tat HIV-1
pNL 43
PCR overlapping untuk mendapatkan fragmen gen tat HIV-1
Visualisasi pada gel agarosa 1,5%, 100V, 45 menit Purifikasi produk PCR
pQE- 80L
Isolasi alkali lisis
Elektroforesis gel agarosa 0,8%, 100V, 45 menit Isolasi vektor pQE-80L
Spektrofotometri DNA sisipan dan vektor
Transformasi heat shock
Isolasi koloni transforman
81
Gambar 10. Skema PCR overlapping fragmen gen tat HIV-1.
Ex2-TatpNL4C 3’ 5’ 3’ 5’ Ex2-TatpNL4 Ex1-TatpNL4C 3’ 5’ 5’ 3’ Ex1-TatpNL4 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ PCR pertama Ex2-TatpNL4C Ex1-TatpNL4 Arah ekstensi primer Arah ekstensi primer PCR kedua 81
Gambar 11. Hasil elektroforesis produk PCR standar fragmen gen tat HIV-1 ekson 1 dan 2.
110 pb 236 pb 100 pb 200 pb 2.652 pb 800 pb 350 pb M 1 2 K- Keterangan: M : Marka 50 pb
1 : Produk PCR ekson 1 tat HIV-1 2 : Produk PCR ekson 2 tat HIV-1 K- : Kontrol negatif PCR
83
Gambar 12. Hasil elektroforesis optimasi kondisi annealing PCR overlapping fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1
(a) (b) 2072 pb 600 pb 326 pb 300 pb 100 pb M 1 2 3 M 4 5 6 7 326 pb
(b) : Hasil optimasi kondisi annealing 4 : Annealing 64° C; 15 detik 5 : Annealing 64° C; 30 detik 6 : Annealing 64° C; 45 detik 7 : Annealing 64° C; 1 menit Agarosa 1,5%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml Keterangan:
(a) : Hasil optimasi suhu annealing M : Marka 100 pb
1 : Suhu annealing 64° C; 30 detik 2 : Suhu annealing 66° C; 30 detik 3 : Suhu annealing 68° C; 30 detik
(b) (a)
Gambar 13. Hasil elektroforesis PCR fragmen gen tat HIV-1
Keterangan:
(a) : Hasil PCR overlapping fragmen gen tat HIV-1 (b) : Hasil purifikasi produk PCR overlapping M : Marka 100 pb 1 : produk PCR overlapping K : kontrol negatif PCR 1500 pb 2072 pb 600 pb 1500 pb 2072 pb 600 pb (b) M 1 326 pb 300 pb (a) 326 pb 300 pb M 1 K- Agarosa 1,5%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml 100 pb 100 pb
85
Gambar 14. Pola migrasi vektor pQE-80L Gambar 15. Purifikasi
Hasil isolasi hasil digesti DNA vektor dan
sisipan
Gel agarosa 0,8%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml a
b
1
Keterangan:
1 : plasmid pQE-80L a : bentuk closed circular b : bentuk nicked circle
Keterangan: M : Marka 1 kb
1 : pQE-80L hasil digesti 2 : fragmen gen tat HIV-1
hasil digesti Gel agarosa 1,2%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml 316 pb 250 pb 4700 pb 3000 pb 1000 pb M 1 2
Gambar 16. Koloni Escherichia coli TOP10 setelah ditransformasi dengan vektor pembawa fragmen tat HIV-1
Keterangan:
87
Gambar 17. Analisis perbandingan pola migrasi plasmid rekombinan dengan pQE-80L (wild type)
Keterangan:
a : bentuk closed circular atau supercoiled b : bentuk linear
c : bentuk nicked circle
WT : plasmid pQE-80L tanpa DNA sisipan Lajur 1--15 : plasmid rekombinan no. 1--15
Gel agarosa 0,8%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml
c b a WT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 a c b WT 10 11 12 13 14 15 Pola migrasi plasmid lebih tinggi
Gambar 18. Skema pQE-80L rekombinan yang tepat [Sumber: QIAGEN 2003: 33.]
BamHI XmaI SalI HindIII
Fragmen gen tat HIV-1 316 pb
pQE80-L rekombinan
Keterangan:
Menunjukkan pita fragmen gen tat HIV-1 berukuran 316 pb pada hasil elektroforesis analisis digesti dan orientasi plasmid rekombinan
89
Gambar 19. Visualisasi hasil analisis plasmid rekombinan melalui digesti SalI dan XmaI
250 pb 1000 pb 4700 pb
12 : plasmid rekombinan no. 12 14 : plasmid rekombinan no. 14 15 : plasmid rekombinan no. 15 Keterangan:
M1 : Marka DNA 100 pb M2 : Marka DNA 1 kb
WT : pQE-80L tanpa DNA sisipan 10 : plasmid rekombinan no. 10 11 : plasmid rekombinan no. 11
Gel agarosa 1,5%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml
M1 10 11 12 14 15 WT M2
3000 pb
300 pb 316 pb
Gel poliakrilamid 8%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml
M2 WT 15 14 12 11 10 M1 316 pb 100 pb 300 pb 250 pb 1000 pb 3000 pb
Gambar 20. Hasil verifikasi PCR terhadap plasmid rekombinan
Keterangan:
M : Marka DNA 100 pb
10 : plasmid rekombinan no. 10 K1 : Kontrol negatif PCR 12 : plasmid rekombinan no. 12 K2 : Kontrol negatif verifikasi 14 : plasmid rekombinan no. 14
15 : plasmid rekombinan no. 15
1 = pQE-80L dengan DNA sisipan klon no.3 2 = pQE-80L dengan DNA sisipan klon no.4 3 = pQE-80L dengan DNA sisipan klon no.5 4 = pQE-80L dengan DNA sisipan klon no.6
Gel agarosa 1,5%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml
581 pb M 10 12 14 15 K1 K2 2072 pb 1500 pb 600 pb 500 pb 300 pb 100 pb
91
Gambar 21. Prediksi translasi asam amino fragmen gen tat HIV-1 yang diklona ke dalam plasmid pQE-80L.
1 atg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac gga tcc gca tgc gag 45 1 M R G S H H H H H H G S A C E 15
6x Histidin tag
46 ctc ggt acc ccg gga tgg agc cag tag atc cta gac tag agc cct 90 16 L G T P G W S Q * I L D * S P 30
ccc gggatg gag cca gta gat cct aga cta gag ccc P G M E P V D P R L E P
91 gga agc atc cag gaa gtc agc cta aaa ctg ctt gta cca att gct 135 31 G S I Q E V S L K L L V P I A 45 tgg aag cat cca gga agt cag cct aaa act gct tgt acc aat tgc tat tgt aaa W K H P G S Q P K T A C T N C Y C K 136 att gta aaa agt gtt gct ttc att gcc aag ttt gtt tca tga caa 180 46 I V K S V A F I A K F V S * Q 60 aag tgt tgc ttt cat tgc caa gtt tgt ttc atg aca aaa gcc tta
K C C F H C Q V C F M T K A L
181 aag cct tag gca tct cct atg gca gga aga agc gga gac agc gac 225 61 K P * A S P M A G R S G D S D 75 ggc atc tcc tat ggc agg aag aag cgg aga cag cga cga aga gct G I S Y G R K K R R Q R R R A 226 gaa gag ctc atc aga aca gtc aga ctc atc aag ctt ctc tat caa 270 76 E E L I R T V R L I K L L Y Q 90 cat cag aac agt cag act cat caa gct tct cta tca aag cag ccc
H Q N S Q T H Q A S L S K Q P
271 agc agc cca cct ccc aat ccc gag ggg acc cga cag gcc cga agg 315 91 S S P P P N P E G T R Q A R R 105 acc tcc caa tcc cga ggg gac ccg aca ggc ccg aag gaa tag aag T S Q S R G D P T G P K E * K 316 aat aga aga aga agg tgg aga gag aga cag aga cag atc cat tcg 360 106 N R R R R W R E R Q R Q I H S 120 aag aag gtg gag aga gag aca gag aca gat cca ttc gat tag gtc gac K K V E R E T E T D P F D * V D 361 att agg tcg acc tgc agc caa gct taa tta gct gag 396
121 I R S T C S Q A * L A E
Keterangan:
A: Alanin F : Fenilalanin L : Leusin Q : Glutamin W : Triptofan C: Sistein G : Glisin M : Metionin R : Arginin Y : Tirosin D: As. aspartat H : Histidin N : ASparagin S : Serin * : Stop E: As. glutamat I : Isoleusin P : Prolin T : Treonin
Start codon pQE-80L
93
Tabel 1
Pasangan primer untuk sintesis fragmen gen tat HIV-1 full length dari cetakan pNL43
Ekson Forward (5’3’) Reverse (5’3’) Ekson 1 Ex1Tat-pNL4 TCCCCCCGGGATGGAGCCA GTAGATCCTAGA Ex1Tat-pNL4C GGGAGGTGGGCTGCTTTGA TAGAGAAGCTT Ekson 2 Ex2Tat-pNL4 ATCAAAGCAGCCCACCTCC CAATCCCGA Ex2Tat-pNL4C TCCCGTCGACCTAATCGAAT GGATCTGTCTCTGT
Keterangan: : situs restriksi XmaI; : situs restriksi SalI : sekuen nukleotida yang overlap
Tabel 2
Pengukuran konsentrasi DNA plasmid pQE-80L dan fragmen gen tat HIV-1
Sampel DNA Λ260 Λ280 Konsentrasi (ng/µl)
PQE-80L hasil
isolasi 0,014 0,010 70
Fragmen gen tat
HIV-1 hasil PCR 0,016 0,012 80
Tabel 3
Pengukuran konsentrasi DNA plasmid pQE-80L dan fragmen gen tat HIV-1 yang telah didigesti
Sampel DNA Λ260 Λ280 Konsentrasi
(ng/µl)
pQE-80L 0,036 0,036 180
Fragmen gen tat
95
Lampiran 1
Komposisi bahan kimia dan pembuatan larutan, buffer, dan medium yang digunakan dalam penelitian
Larutan, buffer, dan
medium Komposisi bahan kimia dan pembuatan Medium Luria Bertani
(LB) padat 250 ml Sebanyak 2,5 g tripton, 1,25 g yeast extract, 1,25 g NaCl, dan 3,75 g agar dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 250 ml. Medium kemudian disterilisasi dan ditambahkan ampisilin sebanyak 125 µl.
Medium Luria Bertani
(LB) 100 ml Sebanyak 1 g tripton, 0,5 g yeast extract, dan 0,5 g NaCl dicampur dan dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 250 ml, kemudian disterilisasi dan disimpan di dalam lemari pendingin.
Medium Super Optimal
Catabolite (SOC) Sebanyak 10 g bakto tripton, 5 g yeast extract, 0,5 g NaCl, dan 10 ml KCl 250 mM ditambahkan akuades hingga mencapai volume 1000 ml. pH larutan diukur (pH 7). Medium kemudian
disterilisasi, MgCl2 dan 20 ml glukosa ditambahkan sesaat sebelum digunakan.
Buffer TAE 50X Sebanyak 48,4 g Tris base, 7,4 g EDTA dan 11,42 ml asam asetat glasial ditambahkan akuades hingga mencapai volume 200 ml.
Buffer TAE 1X Sebanyak 4 ml buffer TAE 50X ditambah dengan
196 ml akuades.
Buffer P1 Sebanyak 800 µl Tris-Cl 10 mM (pH 8,0), 80 µl
EDTA 1 mM (pH 8,0) dan 400 µl RNaseA 10 mg/ml ditambahkan akuades hingga mencapai volume 40 ml.
Buffer P2 Sebanyak 0,32 g NaOH padat dan 4 ml Sodium
Dodecyl Suphate (SDS) 1% dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 40 ml.
Lampiran 1 (lanjutan)
Buffer P3 Sebanyak 11,7 g KCl dan 4,6 ml asam asetat
glasial dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 40 ml.
Larutan fenol: kloroform:
isoamilalkohol Sebanyak 25 ml fenol dicampur dengan 24 ml kloroform dan 1 ml isoamilalkohol Larutan agarosa 0,8%
(b/v) 100 ml Sebanyak 0,8 g agarosa dilarutkan dengan 100 ml buffer TAE 1x Larutan agarosa 1,5%
(b/v) 100 ml Sebanyak 1,5 g agarosa dilarutkan dengan 100 ml TAE 1x Larutan MgCl2 0,1M Sebanyak 2,033 g MgCl2 ditambah dengan
akuades hingga mencapai volume 100 ml. Larutan kemudian disterilisasi dan disimpan di dalam ruang pendingin.
Larutan CaCl2 0,1M Sebanyak 1,665 g CaCl2 ditambah dengan akuades hingga mencapai volume 150 ml. Larutan kemudian disterilisasi dan disimpan di dalam ruang pendingin.
Marka 100 pb Sebanyak 10 µl stok marka 100 pb, 17 µl loading buffer 6X dan 73 µl buffer TE 1X dicampur dan dihomogenasi, kemudian disentrifus beberapa detik.
Marka 1 kb Sebanyak 10 µl stok marka 1 kb, 17 µl loading buffer 6X dan 73 µl buffer TE 1X dicampur dan dihomogenasi, kemudian disentrifus beberapa detik.
Loading buffer 6X Sebanyak 1,5 g bromfenol biru dan 3 ml gliserol ditambah akuades hingga mencapai volume 10 ml. Buffer TE 10X dan 1X Sebanyak 10 µl stok marka 1 kb, 17 µl loading
buffer 6X dan 73 µl buffer TE 1X dicampur dan dihomogenasi, kemudian disentrifus beberapa detik.
97
Lampiran 1 (lanjutan) Larutan Sodium Dodecyl Suphate (SDS) 10% (b/v)
Sebanyak 100 g SDS dilarutkan dengan 1000 ml akuades.
Larutam SDS 1% (b/v) Sebanyak 100 ml larutan SDS 10% dicampurkan dengan 1000 ml akuades.
EDTA 0,5 M Sebanyak 22,334 g bubuk EDTA dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 60 ml. Larutan TBE 10X Sebanyak 108 g Tris base, 55 g boric acid, dan 40
ml EDTA 0,5 M dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 1000 ml.
Larutan akrilamid Sebanyak 29 g akrilamid dan 1 g bisakrilamid ditambahkan dengan akuades hingga volume 80 ml. Larutan didiamkan pada suhu 37° C selama 10 menit, kemudian ditambahkan akuades hingga mencapai volume 100 ml.
Gel poliakrilamid 8% Sebanyak 500 µl TBE 10X dicampur dengan 1350 µl larutan akrilamid, 3150 µl akuades, 60 µl
amonium persulfat 10% (b/v) dan 10 µl TEMED.
Lampiran 2
Perhitungan konsentrasi DNA sisipan untuk reaksi ligasi
ng sisipan = ng vektor x ukuran sisipan x 3 ukuran vektor x 1 ng sisipan = 180 x 322 x 3
4700 x1 = 36,77 ng/µl
Konsentrasi DNA sisipan = 150 ng/ µl
Volume DNA sisipan untuk reaksi ligasi = 0,245 ~ 0,25 µl Volume DNA vektor = 1 µl
99
Lampiran 3
Perhitungan efisiensi transformasi sel Escherichia coli TOP10 kompeten
Transforman cfu = Jumlah koloni transforman x faktor pengenceran x volume kultur total/volume kultur ditransformasi
= 642 x 1 x (200/50)
= 2,568 x 103
Efisiensi transformasi = transforman cfu/konsentrasi plasmid = 2,568 x 103/0,01
= 2,568 x 105 cfu/µg [Sumber: Zhiming Tu dkk. 2005: 118.]
![Gambar 4. Siklus hidup HIV-1 [Sumber: Henriksen 2003: 14.]](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123dok/4574149.3330118/3.918.171.818.128.1000/gambar-siklus-hidup-hiv-sumber-henriksen.webp)
