BAB III
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, skrining fitokimia, pemeriksaan karakteristik, pembuatan ekstrak, fraksinasi secara Kromatografi Lapis Tipis(KLT), isolasi secara Kromatografi Kolom (KK) dan KLT preparatif, uji kemurnian isolat dan identifikasi isolat secara spektrofotometri UV dan spektrofotometri IR. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, blender (Panasonic), eksikator, mikroskop (Olympus), seperangkat alat destilasi, seperangkat alat penetapan kadar air, seperangkat alat kromatografi kolom, oven listrik (Stork),hair dryer (Maspion), neraca analitik (Vibra AJ), neraca kasar (Saherand), penangas air (Yenaco), seperangkat alat kromatografi lapis tipis, lemari pengering, spektrofotometer UV (Shimadzu) dan spektrofometer IR (IR-Prestige 21).
3.2 Bahan-bahan
klorida, timbal (II) asetat, kalium iodida, asam asetat glasial, asam sulfat pekat, asam klorida pekat, asetat anhidrida, serbuk magnesium, bismuth (III) nitrat, plat pra lapis silika gel GF254, silika gel 60H, kloralhidrat dan n-heksana.
3.3 Pembuatan Pereaksi
3.3.1 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida P dilarutkan dalam air secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium P kemudian ditambahkan air hingga 100 ml (Ditjen POM RI, 1995).
3.3.2Pereaksi Mayer
Larutan raksa (II) klorida P 2,266% b/v sebanyak 60 ml dicampur dengan 10 ml larutan kalium iodida P 50% b/v, kemudian ditambahkan air secukupnya hingga 100 ml (Ditjen POM RI, 1995).
3.3.3 Pereaksi Dragendorff
Larutan bismut nitrat P 40% b/v dalam asam nitrat P sebanyak 20 ml dicampur dengan 50 ml kalium iodida P 54,4% b/v, didiamkan sampai memisah sempurna. Lalu diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml (Ditjen POM RI, 1995).
3.3.4 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g alfa naftol P, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml (Ditjen POM RI, 1995).
3.3.5Larutan asam klorida 2 N
3.3.6 Larutan asam sulfat 2 N
Larutan asam sulfat pekat sebanyak 9,8 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml (Ditjen POM RI, 1995).
3.3.7 Larutan asam nitrat 0,5 N
Sebanyak 3,4 ml asam nitrat pekat diencerkan dengan air suling hingga volume 100 ml (Ditjen POM RI, 1995).
3.3.8 Larutan timbal (II) asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal (II) asetat P dilarutkan dalam air bebas karbon dioksida hingga 100 ml (Ditjen POM RI, 1995).
3.3.9Larutan besi (III) klorida 1% b/v
Sebanyak 1 g besi (III) klorida dilarutkan dalam air secukupnya hingga 100 ml(Ditjen POM RI, 1995).
3.3.10 Larutan pereaksi kloralhidrat
Sebanyak14 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam air sulinghinggga 20 ml (Ditjen POM RI, 1995).
3.4 Pengumpulan dan Pengolahan Tumbuhan
3.4.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
3.4.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Diah Ramadhanidi Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi LIPI, Bogor. Tumbuhan yang digunakan untuk penelitian adalah sama dengan tumbuhan yang digunakan oleh Diah Ramadhani.Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 50.
3.4.3Pembuatan simplisia
Herba pugun tanohdibersihkan dari kotoran dengan cara mencuci di dalam air mengalir hingga bersih lalu ditiriskan, kemudian dikeringkan di dalam lemari pengering pada suhu 40oC. Tumbuhan dianggap kering apabila sudah rapuh, selanjutnya tumbuhandiserbukkan dengan menggunakan blender.
3.5Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaanmakroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut air, penetapan kadar sari yang larut etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut asam (Ditjen POM RI, 1989).
3.5.1Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksan makroskopik dilakukan dengan mengamati bahan segar dan simplisia yang menjadi karakteristiknya.Hasil pemeriksaan makroskopik dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 52 dan 53.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
mikroskop. Hasil pemeriksaan mikroskopik dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 54.
3.5.3Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (destilasi toluen). Prosedur kerja:
1. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan kedalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam. Kemudian toluen didinginkan selama 30 menit dan volume air pada tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml (WHO, 1992). 2. Penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan kedalam labu alas bulat berisi toluen tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit, selanjutnya setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes perdetik, sampai bagian air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar. Bilamana air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air yang dihitung dalam persen (WHO, 1992).
3.5.4 Penetapan kadar sari yanglarut air
kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Ditjen POM RI, 1989).
3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan, direndam selama 24 jam
dalam 100 ml etanol 96% dalam labu tersumbat sambil dikocok sesekali selama 6
jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk
menghindari penguapan etanol, selanjutnya 20 ml filtrat diuapkan sampai kering
dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada
suhu 105oC, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap.
Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan
(Ditjen POM RI, 1989).
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama
dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan
dan dipijarkan pada suhu 600oC sampai arang habis. Kemudian didinginkan dan
ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang
telah dikeringkan (WHO, 1992).
3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total, dididihkan
dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600oC sampai
bobot tetap. Kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam
asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan (WHO, 1992).
3.6 Skrining fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloida, glikosida, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, dan tanin.
3.6.1 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia 0,5 g ditambah 1 ml HCl 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtratnya dipakai untuk uji alkaloida sebagai berikut:
a. filtrat 3 tetes ditambah 2 tetes larutan pereaksi Mayer, terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning
b. filtrat 3 tetes ditambah 2 tetes larutan pereaksi Bauchardat, terbentuk endapan coklat sampai hitam
c. filtrat 3 tetes ditambah 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff terbentuk warna merah atau jingga
Alkaloida disebut positif jika endapan atau kekeruhan paling sedikit duadari tiga tabung reaksi dari percobaan diatas (Ditjen POM RI, 1979).
3.6.2 Pemeriksaan glikosida
dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform (2:3) dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan dan sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dimasukkan dalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan diatas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan pereaksi Molish. Tambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat melalui dinding tabung sedikit demi sedikit, hingga terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya glikosida. (Ditjen POM RI, 1989).
3.6.3 Pemeriksaan steroid/triterpenoid
Sejumlah 1 g serbuk direndam dengan 20 ml eter selama 2 jam. Disaring, filtrat diuapkan dicawan penguap, sisanya ditambahkan asam asetat anhidrida- H2SO4 pekat (pereaksi Lieberman-Burchard), apabila terbentuk warna biru hijau menunjukkan adanya triterpenoid, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya steroid (Farnsworth, 1966).
3.6.4 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas.Kedalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1966).
3.6.5 Pemeriksaan tanin
(III) klorida 1%, jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth, 1966).
3.6.6 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat–kuat selama 10 Molish.Amati perubahan yang terjadi, jika terbentuk buih yang mantap setinggi 1–10 cm, tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin (Ditjen POM RI, 1979).
3.7 Pembuatan ekstrak
Pembuatan herba pugun tanoh dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etil asetat. Sebanyak 500 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam sebuah bejana, dituangi dengan 3,8liter (75 bagian) etil asetat, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk lalu diserkai. Ampas diremaserasi dengan etil asetat secukupnya hingga diperoleh 5 liter(100 bagian). Pindahkan maserat ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari, enap tuangkan. Pemekatan ekstrak dilakukan menggunakan alat rotary evaporator pada temperatur ± 40oC sampai diperoleh ekstrak kental.
3.8 Pencarian fase gerak etil asetat secara KLT
gel GF254 dan fase gerak campuran n-heksana–etilasetat dengan perbandingan (80:20), (70:30), (60:40), (50:50) dan (40:60), sebagai penampak bercak digunakan sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm dan diamati bercak fluoresensi yang timbul.
Cara kerja: Ekstrak dilarutkan dalam metanol, kemudian ditotolkan dengan penotol pada plat pra lapis sampai plat jenuh, kemudian dimasukan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan uap fase gerak, ketika mencapai batas pengembangan plat dikeluarkan dan dikeringkan, plat diamati dibawah sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm. Hasil analisis KLT ekstrak etilasetat dapat dilihat pada Lampiran 14, halaman 63.
3.9 Isolasi senyawa flavonoidasecaraKromatografi Kolom
Kromatografi kolom dipakai untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah yang memadai (mg sampai g) dalam keadaan murni sehingga komponen itu dapat dicirikan lebih lengkap atau dapat dipakai pada reaksi berikutnya (Gritter, et al., 1985). Kandungan kimia yang terdapat dalam ekstrak etil asetat dipisahkan secara kromatografi kolom menggunakan pelarut landaian n -heksana-etilasetat dengan perbandingan (100:0), (90:10), (80:20), (70:30), (60:40), (50:50), (40:60), (30:70), (20:80), (10:90), (0:100) dan metanol.
kolom diketuk-ketuk dan fase gerak tetap dialiri sampai silika gel turun, lalu didiamkan sampai kolom kompak, selanjutnya fase gerak turun sampai setinggi lebih kurang 1cm diatas fase diam, kran ditutup, kemudian fraksi etil asetat yang sebelumnya telah dicampur dengan silika gel 60 H dimasukkan kedalam bejana kromatografi kolom sambil fase gerak ditambah sedikit demi sedikit, setelah sampel turun kran dibuka perlahan-lahan sambil fase gerak terus ditambah. Eluat yang keluar ditampung dalam vial, masing-masing sebanyak 10 ml. Hasil dipantau dengan kromatografi lapis tipis menggunakan fase gerak n -heksana-etilasetat (60:40), sebagai penampak bercakdigunakan sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm. Hasil eluat yang mempunyai pola kromatogram yang sama digabung menjadi satu.Hasil kromatografi kolom dapat dilihat pada Lampiran 15, halaman 64.
3.10 Isolasi senyawa Flavonoida secara KLT preparatif
Fraksiyang mengandung bercak berwarna ungu kebiruan dilakukan isolasi secaraKLT preparatif. Penampak bercak yang digunakan adalah sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm dan sebagai fase gerak digunakan n-heksana-etilasetat (40:60) dan fase diam silika gel GF254.
yang sejajar dengan bercak berwarna ungu dikerok dan dikumpulkan, direndam dengan metanol satu malam lalu disaring kemudian pelarutnya diuapkan. Kemudian dilakukan uji kemurnian dengan KLT terhadap isolat yang diperoleh.Hasil KLT preparatif dapat dilihat pada Lampiran 16, halaman 65.
3.11 Uji kemurnian isolat
Isolat yang diperoleh dilakukan uji kemurnian dengan KLT menggunakan beberapa fase gerak yang berbeda yaitu, toluen-etil asetat (7:3); kloroform-etil asetat (5:5); n-heksana-etil asetat (8:2); metanol-etil asetat (1:9) dan diamati dengan visual dengan sinar UV 254 nm, serta sinar UV 366 nm.
Cara kerja:Isolat ditotolkan pada plat pra lapis silika gel GF254ukuran 10 x 2 lalu dielusi memakai masing-masing fase gerak yaitu, toluen-etil asetat (7:3); kloroform-etil asetat (5:5); n-heksana-etil asetat (8:2); metanol-etil asetat (1:9) hingga mencapai batas pengembangan, kemudian plat dikeluarkan dari dalam bejana dan dikeringkan, setelah plat kering diamati noda yang terbentuk secara visual dengan sinar UV 254 nm, dan 366 nm. Hasil uji kemurnian isolat dapat dilihat pada Lampiran 17, halaman 66.
3.12 Identifikasi isolat
3.12.1 Identifikasi isolatsecara Spektrofotometri UV
a. setelah mengukur spektrum cuplikan dalam metanol (spektrum MeOH), tambahkan tiga tetes NaOH ke dalam kuvet (1 ml, volume 2 ml) , campur, lalu rekamlah spektrum NaOH. Untuk memeriksa apakah ada penguraian, sprektrum NaOH direkam lagi setelah kira-kira lima menit. Kemudian cuplikan dibuang dan kuvet yang telah dicuci diisi lagi dengan larutan flavonoid persediaan.
b. Enam tetes pereaksi AlCl3 ditambahkan ke dalam larutan flavonoid, campur lalu ukur spektrum AlCl3. Selanjutnya ditambahkan tiga tetes HCl, campur dan ukur spektrum AlCl3/HCl. Akhirnya cuplikan dibuang dan kuvet dicuci.Sekarang tambahkan serbuk natrium asetat ke dalam larutan flavonoid persediaan dalam kuvet sedemikian rupa sehingga terdapat kira-kira 2 mm lapisan natrium asetat pada dasar kuvet. Campuran harus dikocok baik-baik sebelum spektrum natrium asetat diukur. Lalu spektrum natrium asetat/asamborat diukur setelah ditambahkan asam borat dan dicampur (banyaknya asam borat kira-kira setengah dari natrium asetat).
Hasil identifikasiisolatsecara Spektrofotometri UV dapat dilihat padaLampiran 18 - Lampiran 23, halaman 67- 72.
3.12.2 Identifikasi isolat secara Spektrofotometri IR
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil identifikasi tumbuhan
Hasilidentifikasi tumbuhan yang dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor menunjukkan bahwa tumbuhan yang diteliti termasuk suku Scrophulariaceaespesies Curanga fel-terrae(Lour.)Merr.
4.2 Hasil karakterisasi bahan tumbuhan dan serbuk simplisia
Hasil pemeriksaan makroskopik herba pugun tanoh segar menunjukkan berwarna hijau muda sampai hijau tua, berbentuk bulat telur dengan tinggi 2-7 cm dan lebar 2-4 cm, ujung daun agak melancip, tepi daun beringgit dan permukaan daun bertekstur kasar.Daun terasa sangat pahit di lidah dan bila diremas daunnya tidak mengeluarkan bau.
Hasil pemeriksaan mikroskopik simplisia herba pugun tanoh dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 54. Daun pugun tanoh memiliki fragmen pengenal seperti trikoma, tulang daun, berkas pembuluh, rambut bersel banyak, kristal kalsium oksalat bentuk prismadan stomata dengan dua tipe yaitu diasitik dan anomositik.
Tabel 4.1 Hasil karakterisasi simplisia dari herba pugun tanoh No. Karakterisasi Simplisia Hasil
1. Kadar air 7,82 %
2. Kadar sari yang larut dalam air 13,29 % 3. Kadar sari yang larut dalam etanol 8,78 %
4. Kadar abu total 10,34 %
5. Kadar abu yang tidak larut dalam asam 1,94 %
Hasil penetapan kadar air yang diperoleh lebih kecil dari 10% yaitu 7,81%memenuhi persyaratan yang ditetapkan, kadar air yang melebihi 10% dapat menjadi media yang baik untuk pertumbuhan jamur. Perubahan senyawa kimia berkhasiat dan aktivitas enzim karena enzim tertentu dalam sel masih dapat bekerja dalam menguraikan senyawa aktif setelah sel mati dan selama bahan simplisia masih mengandung jumlah air tertentu (Ditjen POM RI, 1999). Penetapan kadar sari larut air bertujuan untuk mengetahui kadar senyawa kimia bersifat polaryang terkandung di dalam simplisia herba pugun tanoh seperti asam, garam, glikosida, dan gula.Sedangkan kadar sari larut dalam etanol dilakukan untuk mengetahui kadar senyawa larut dalam etanol.Persyaratan kadar sari larut air lebih tinggi daripada kadar sari larut etanol, hal ini disebabkan karena etanol lebih sedikit dalam melarutkan zat-zat yang terkandung di dalam simplisia dibandingkan air. Penetapan kadar abu total dilakukan untuk mengetahui kadar senyawa anorganik dalam simplisia, misalnya logam K, Ca, Na, Pb, Hg, silika, sedangkan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam dilakukan untuk mengetahui kadar senyawa yang tidak larut dalam asam, misalnya silikat.
4.3 Hasil skrining fitokimia
Tabel 4.1 Hasil karakterisasi simplisia dari herba pugun tanoh No. Karakterisasi Simplisia Hasil
1. Kadar air 7,82 %
2. Kadar sari yang larut dalam air 13,29 % 3. Kadar sari yang larut dalam etanol 8,78 %
4. Kadar abu total 10,34 %
5. Kadar abu yang tidak larut dalam asam 1,94 %
Hasil penetapan kadar air yang diperoleh lebih kecil dari 10% yaitu 7,81%memenuhi persyaratan yang ditetapkan, kadar air yang melebihi 10% dapat menjadi media yang baik untuk pertumbuhan jamur. Perubahan senyawa kimia berkhasiat dan aktivitas enzim karena enzim tertentu dalam sel masih dapat bekerja dalam menguraikan senyawa aktif setelah sel mati dan selama bahan simplisia masih mengandung jumlah air tertentu (Ditjen POM RI, 1999). Penetapan kadar sari larut air bertujuan untuk mengetahui kadar senyawa kimia bersifat polaryang terkandung di dalam simplisia herba pugun tanoh seperti asam, garam, glikosida, dan gula.Sedangkan kadar sari larut dalam etanol dilakukan untuk mengetahui kadar senyawa larut dalam etanol.Persyaratan kadar sari larut air lebih tinggi daripada kadar sari larut etanol, hal ini disebabkan karena etanol lebih sedikit dalam melarutkan zat-zat yang terkandung di dalam simplisia dibandingkan air. Penetapan kadar abu total dilakukan untuk mengetahui kadar senyawa anorganik dalam simplisia, misalnya logam K, Ca, Na, Pb, Hg, silika, sedangkan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam dilakukan untuk mengetahui kadar senyawa yang tidak larut dalam asam, misalnya silikat.
4.3 Hasil skrining fitokimia
Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia dari simplisia herba pugun tanoh
No. Nama Senyawa Hasil
1. Alkaloid -
2. Flavonoid +
3. Steroid/Triterpenoid +
4. Tanin +
5. Glikosida +
6. Saponin +
Penentuan golongan senyawa kimia terhadap simplisia herba pugun tanoh dilakukan untuk mendapatkan informasi golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat di dalamnya. Serbuk simplisia herba pugun tanohyang ditambah dengan pereaksi Dragendorff tidak memberikan endapan warna jingga kecoklatan, dengan pereaksi Bouchardat tidak memberikan endapan warna kuning kecoklatan dan dengan pereaksi Mayer tidak terbentuk endapan putih dan kekeruhan, ini menunjukkan tidak adanya alkaloid. Alkaloid dianggap positif jika terjadi endapan pada paling sedikit dua atau tiga dari pereaksi yang ditambahkan (Ditjen POM RI, 1995). Flavonoid dengan penambahan serbuk Mg, HCl 2N dan amil alkohol memberikan warna jingga pada lapisan amil alkohol. Ini dianggap bahwa flavonoid positif pada herba pugun tanoh (Farnsworth, 1966).
Penambahan Liebermann-Burchard memberikan warna merah ungu menunjukkan adanya senyawa steroid (Harborne, 1987), sedangkanskrining pada tanin dengan penambahan FeCl3 memberikan warna biru kehitaman yang menunjukkan adanya tanin yaitu pirogalol(Farnsworth, 1966).
Skrining saponin menghasilkan busa yang stabil dengan tinggi busa 3 cm dan tidak hilang dengan penambahan HCl 2 N, sifat busa saponin disebabkan adanya struktur amfifilik dari saponin, penambahan HCl 2 N mengakibatkan kestabilan busa semakin lama sesuai dengan sifat sabun (Ditjen POM RI, 1995).
4.4 Hasil Ekstraksi Simplisia herba pugun tanoh
Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etil asetat, dari hasil maserasi 500 g serbuk simplisia diperoleh ekstrak kental sebanyak 16,013 g, rendemennya adalah 3,2%. Analisis KLT dari ekstrak etil asetatmenunjukkan bahwa fase gerak yang paling baik adalah n-heksana-etilasetat (40:60) karena menghasilkan pemisahan noda yang paling baik. Hasil pencarian fase gerak ditunjukkan pada Tabel 4.3. berikut ini.
Tabel 4.3. Nilai noda kromatogram lapis tipis ekstrak etil asetat dari herba pugun tanoh dengan fase gerak yang berbeda
Kromatogram Fase Gerak Nilai Rf
I n-heksana – etil asetat (8:2) - II n-heksana – etil asetat (7:3) 0,95
III n-heksana – etil asetat (6:4) 0,80;0,95
IV n-heksana – etil asetat (5:5) 0,72;0,81;0,85;0,94 V n-heksana – etil asetat (4:6) 0,6; 0,65;0,74;0,72;0,91
4.5 Hasil Isolasi Flavonoid dari herba pugun tanoh
FraksiE20diisolasi secara kromatografi lapis tipis preparatif dengan fase gerak n-heksana-etilasetat (40:60), fase diam silika gel GF254 dan penampak bercak sinar UV 366 nm. Hasil kromatografi lapis tipis preparatif untuk E20 terdapat pita yang berfluoresensi lembayung biru,lalu dikerok dan direndam selama satu malam dalam metanol kemudian disaring lalu diuapkan dan diperoleh 1 isolat. Selanjutnya direndam dengan metanol dingin sehingga diperoleh kristal amorf yang berwarna putih yang berupa isolat murni.Isolat menunjukkan fluoresensi lembayung biru dengan sinar UV 366 nm, harga Rf 0,38memberikan hasil positif terhadap senyawa flavonoid dengan pemeriksaan kandungan senyawa isolat.
4.6 Hasil Uji Kemurnian
Terhadap isolat dilakukan KLT uji kemurnian dengan beberapa fase gerak yang berbeda yaitu, toluen - etilasetat (70:30), kloroform - etil asetat (50:50), n -heksana - etil asetat (80:20), dan metanol - etil asetat (10:90) lalu diamati dengan sinar UV 366 nm. Nilai Rf noda kromatogram lapis tipis dari isolat terlihat pada Tabel. 4.4.
Tabel 4.4 Nilai Rf noda kromatogram lapis tipis dari isolat ektrak herba pugun tanohdengan fase gerakyang berbeda
Kromatogram Fase Gerak Nilar Rf
I Toluena : etil asetat (7:3) 0,38 II Kloroform : etil asetat (5:5) 0,8 III n-heksana : etil asetat (8:2) 0,24 IV Metanol : etil asetat (1:9) 0,1
4.7 Hasil Penafsiran S
an Spektrum UV dengan pereaksi geser
V senyawa hasil isolasi dari ekstrak herba pug eOH) dan penambahan pereaksi AlCl3, AlC -H3BO3 ditunjukkan pada Gambar 4.1 berikut
um UV senyawa hasil isolasi dari ekstrak etil as un tanoh dengan pelarut (a) MeOH, (b)MeOH+N , (d) MeOH+AlCl3+HCl, (e) MeOH+NaOAc,
+H3BO3
siran spektrum UV pada isolat dalam metanol m lombang maksimum pada 256.60 nm, yang term UV untuk senyawa golongan flavon yaitu
Identifikasi jenis flavonoid dan menentukan pola oksigenasi serta kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid maka dilakukan penambahan pereaksi. Penambahan pereaksi NaOH menghasilkan pita dengan intensitas yang lebih rendah dibandingkan dengan spektrum UV metanol. Hal ini menunjukkan terjadinya penguraian yang disebabkan oleh adanya hidroksil bebas pada posisi 4’ cincin B yang peka terhadap basa (Markham, 1988).
Spektrum UV dengan pereaksi AlCl3 memperlihatkan λmakspita sebesar 326.50 nm yang menunjukkan bahwa tidak adanya pergeseran puncak pita terhadap spektrum UV AlCl3. Hal ini menyatakan bahwa pada cincin B tidak terdapat subsituen orto-dihidroksil.
Penambahan pereaksi AlCl3-HCl digunakan untuk mendeteksi adanya pengaruh kompleks tahan asam antara gugus hidoksil dengan gugus keton yang bertetangga dan kompleks antara gugus orto-dihidroksil yang akan menghasilkan pergeseran batokromik (Markham, 1988).
Spektrum UV senyawa hasil isolasi dengan pereaksi AlCl3-HCl memperlihatkan pergeseran batokromik pita dari λmaks 256 nm menjadi 296 nm
dimana terjadi penambahan pita sebesar 40 nm. Hal ini menunjukkan bahwa adanya subsituen OH pada C-5 (Markham, 1988).
Penambahan pereaksi NaOAc menghasilkan λmakspita sebesar 256 nm
Penafsiran hasil spektrum diatas, menurut Markham (1988), menunjukkan flavonoid yang diperoleh diduga golongan flavon yang mempunyai gugus hidroksi pada 4’, 5 dan 7.
4.8 Hasil Spektroskopi FT-IR
Spektrum FT-IR memberikan informasi tentang gugus fungsi dari senyawa hasil isolasi herba pugun tanoh. Spektrum FT-IR senyawa hasil isolasi ditunjukkan pada Gambar 4.2 dan intrepetasi spektrum FT-IR ditunjukkan pada Tabel 4.5.
Gambar 4.2 Spektrum IR senyawa hasil isolasi
tersebut dikuatkan oleh serapan C-O-H (1330-1420 cm-1) pada bilangan gelombang 1361,74 cm-1, yang diperkuat oleh puncak pada bilangan gelombang 1148,55 cm-1 menunjukkan adanya gugus metilen (CH3). Pada bilangan gelombang 1635,64cm-1 adanya gugus C=C.
Spektrum FT-IR senyawa hasil isolasi tersebut memperlihatkan adanya gugus-gugus fungsi untuk senyawa flavonoid yaitu adanya pita serapan melebar pada bilangan gelombang 3300-3400 cm-1untuk gugus fenol dan adanya gugus karbonil (C=O) serta adanya stretching C=C pada bilangan gelombang 1635,64cm-1.
Tabel. 4.5 Intepretasi spektrum inframerah senyawa hasil isolasiekstrak etil asetat dari herba pugun tanoh
No. Bilangan Gelombang (cm-1) Gugus Fungsi
1 3414,00 -OH
2 2933,75 -C-H alifatis
3 2063,83 -C=O
4 1635,64 C=C
5 1414,75 O-H (bending)
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
a. Hasil karakterisasi simplisia herba pugun tanoh adalah kadar air 7,82%, kadar sari yang larut dalam air 13,29%, kadar sari yang larut dalam etanol 8,78%, kadar abu total 10,34% dan kadar abu yang tidak larut dalam asam 1,94%. b. Hasil skrining golongan senyawa kimia simplisia herba pugun tanoh (Curanga
fel-terrae (Lour.) Merr) adalah flavonoid, steroid/triterpenoid, tanin, glikosida dan saponin.
c. Hasil isolasi yang diperoleh berflourosensi lembayung biru pada sinar UV 366 nm. Senyawa flavonoida yang diperoleh dari hasil isolasi dapat diidentifikasi yaitu berdasarkan analisis secara spektrofotometri UV-Vis dengan menggunakan pereaksi geser dan fourier transform infra red (FT-IR) menunjukkan bahwa isolat diduga sebagai isolat flavonoida golongan flavon yang memiliki gugus OH pada kedudukan atom C nomor 4’, 5 dan 7. Hasilpengukuran spektrofotometri inframerahmenunjukkan adanya gugus – OH,C-H,C=O, C=C, –CH3 dan C-O-C.
5.2 Saran
