BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini bersifat eksperimental yang meliputi penyiapan sampel, hidrolisis sampel serta pengujian aktivitas antibakteri. Penelitian ini merupakan proses hidrolisis trigliserida dari CPO dan PKO dengan menambahkan enzim lipase sebagai katalisator pada suhu 40oC. Selanjanjutnya hasil hidrolisis dengan bilangan asam tertinggi diuji aktivitas bakteri trehadap bakteri gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan gram negatif (Pseudomonas aeruginosa Rancangan penelitian dilakukan dengan variasi akuades sebagai agen penghidrolisis dan waktu reaksi.
3.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium oleopangan Pengolahan Hasil dan Mutu (PAHAM), Pusat Penelitian Kelapa Sawit Medan dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.2 Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai dari masa orientasi sampai selesai dimulai mulai bulan Agustus 2016 sampai Maret 2017.
3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat
digital, kertas perkamen, krus porselin, laminar air flow cabinet, lemari pendingin, neraca listrik, oven, penangas air, pinset, pipet mikro, spatula, stirer, vial.
3.3.2Bahan
Bahan kimia yang digunakan adalah bahan kimia yang bersifat pro analisis. Bahan baku penelitian yang digunakan adalah akuades, Cruder Palm Oil (CPO), enzim lipozime, KOH, Palm Kernel Oil (PKO), Na2SO4 anhidrat, n-heksan, fenolftalein, etanol, nutrient agar, nutrient broth.
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi KOH 0.1 N
Sebanyak 5.6 g kalium hidroksida ditimbang dan dilarutkan ke dalam akuades secukupnya, kemudian dicukupkan dengan akuadest sampai volume 1000 ml (Depkes RI, 1995).
3.4.2 Pereaksi fenolftalein 1% (pereaksi pp)
Larutkan 318,33 g fenolftalein dalam etanol secukupnya, kemudian cukupkan etanol sampai 1000 ml (Depkes, RI. 1995).
3.4.3 Pereaksi etanol netral
Masukkan etanol dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan pereaksi pp 3 tetes kedalam etanol lalu dititrasi dengan pereaksi KOH sampai etanol berubah warna menjadi pink jernih (AOCS, 2009).
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1Hidrolisis Crude Palm Oil dan Palm Kernel Oil
variasi volume akuades 30 ml, 60 ml, 90 ml serta 120 ml. Campuran ini diaduk dengan stirer menggunakan magnetik stirer dengan variasi lama pengandukkan 6, 12, 18 serta 24 jam pada suhu 40o C. Setelah masing-masing waktu hidrolisis tercapai kemudian campuran dipindahkan ke corong pisah dan ditambahkan air panas sampai enzim yang digunakan rusak. Penambahan air panas ini juga menghasilkan dua lapisan.
Lapisan atas (fraksi n-heksan) dipisahkan sebagai filtrat I (ditampung dalam erlenmeyer) dan lapisan bagian bawah dipisah sebagai filtrat II (dibuang). kemudian ditambahkan 50 mg Na2SO4 anhidrat dan digoyangkan selama 15 menit. Selanjutnya diuapkan menggunakan alat rotary evaporator. Asam lemak yang diperoleh digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri dan penentuan bilangan asam.
3.5.2 Penentuan bilangan asam
Penentuan asam lemak bebas dilakukan dengan penentuan bilangan asam yaitu minyak yang akan diuji ditimbang 1 gram di dalam erlenmeyer 20 ml, kemudian ditambahan 20 ml alkohol netral 95% dan dipanaskan. Larutan ini kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,1 N dengan indikator larutan fenolftalein sampai larutan tepat terlihat berwarna merah jambu stabil selama beberapa menit sebelum warnanya menghilang. Setelah itu dihitung bilangan asam dan kadar asam dari minyak (AOCS, 2009).
Bilangan asam (acid value) =
G
A x N x BM KOH
3.6 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas yang bersifat kuantitatif dan media pertumbuhan bakteri disterilkan di otoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit dan alat-alat gelas lainnya disterilkan didalam oven pada suhu 170oC selama 1 jam. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan menggunakan api bunsen (Ditjen POM, 1995).
3.7 Pembuatan Media 3.7.1 Media nutrient agar Komposisi:
− Lab-lemco powder 1 g
− Yeast extract 2g
− Peptone 5 g
− Sodium chloride 5 g
− Agar 15 g
Cara Pembuatan:
Sebanyak 28 g media nutrient agar (NA) yang sudah jadi ditimbang, disuspensikan ke dalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna. Media kemudian dimasukkan dalam labu dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Oxoid, 1982).
3.7.2 Media nutrient broth Komposisi:
− Lab-lemco powder 1 g
− Peptone 5 g
− Sodium chloride 5 g
Cara Pembuatan:
Sebanyak 13 g media nutrient broth (NB) yang sudah jadi ditimbang, disuspensikan ke dalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna. Media kemudian dimasukkan dalam labu dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Oxoid, 1982).
3.7.3 Pembuatan Agar Miring
Ke dalam tabung reaksi steril dimasukkan 5 ml media NA steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan memadat pada posisi miring kira-kira 45oC. Media kemudian disimpan dalam lemari pendingin (Ditjen POM, 1995).
3.8.Peremajaan Bakteri
Satu koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media NA miring dengan cara menggores. Kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36-37oC selama 24 jam (Ditjen POM, 1995).
3.9.Penyiapan Inokulum Bakteri
tabung reaksi yang telah berisi larutan nutrient broth (NB) sebanyak 9,9 ml dan dihomogenkan sehingga konsentrasi suspensi bakteri sama dengan 106 CFU/ml. (Difco and BBL Manual, 2009).
3.10. Pembuatan Bahan Uji
Bahan uji dibuat dalam konsentrasi 100%, 75%, 50%, dan 25% (v/v) dengan menggunakan en-heksan sebagai pelarut. Sejumlah bahan uji diukur volumenya sesuai konsentrasi, dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml, kemudian dicukupkan dengan etanol hingga garis tanda, kemudian dikocok hingga homogen (Loung, 2014).
3.11. Pengujian Antibakteri
Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15-20 ml nutrient agar dicawan petri, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Pada media yang telah padat ditanam pencadang kertas yang sebelumnya telah direndam dalam bahan uji selama 15 menit. Kultur kemudian diikubasi pada suhu 36-37oC selama 18-24 jam untuk Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosae. Diameter daerah bening di sekitar pencadang diukur menggunakan
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Hidrolisis Crude Palm Oil dan Palm Kernel Oil
Crude Palm Oil (CPO) dan Palm Kernel Oil (PKO) dihidrolisis dengan
menggunakan enzim lipase dengan variasi akuades 30, 60, 90, dan 120 ml (dapat dilihat pada Lampiran 2 dan Lampiran 3), dan pengamatan dilakukan dengan menghitung bilangan asamnya pada waktu 6, 12, 18 dan 24 jam. Menurut Puguh (2012), bahwa kenaikan jumlah air dan semakin lama waktu hidrolisis dapat mengeser konversi reaksi ke arah pembentukan asam lemak bebas. Pergeseran konversi reaksi ini meningkatkan jumlah asam lemak bebas yang dihasilkan pada proses hidrolisis CPO dan PKO.
Proses hidrolisis membutuhkan katalis untuk membantu mempercepat reaksi. Pada penelitian ini, katalis yang digunakan yaitu enzim lipase. Prinsip pada reaksi hidrolisis mengunakan enzim lipase yaitu, dengan memecah rantai poliunsaturated dan polisaturated menjadi asam lemak bebas monosaturated dan monounsaturated (Aehle, 2004). Banyaknya jumlah asam lemak bebas yang terbentuk dapat dinyatakan dalam bilangan asam.
Data hasil perhitungan bilangan asam dapat dilihat pada Tabel 4.1 sedangkan uraian bilangan asam dari CPO dan PKO dapat dilihat pada Lampiran 7 halaman 58 dan Lampiran 8 halaman 59.
Tabel 4.1 Hasil uji bilangan asam dan waktu hidrolisis pada CPO dan PKO. Sampel Volume
Hidrolisis 30 6 133,1063 142,7126
12 160,8920 178,1355
Berdasarkan hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades 30 ml dengan waktu pengadukan 6, 12, 18 dan 24 jam menghasilkan bilangan asam tertinggi pada hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam, yaitu 186,8268 mg KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 220, 1475 mg KOH/gram minyak.
KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 223,973 mg KOH/gram minyak.
Pada hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades 90 ml dengan waktu pengadukan yang sama menghasilkan bilangan asam tertinggi pada hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam, yaitu 199,6255 mg KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 230,4333 mg KOH/gram minyak.
Pada hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades 120 ml dengan waktu pengadukan yang sama menghasilkan bilangan asam tertinggi pada hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam, yaitu 204,6275 mg KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 246,8405 mg KOH/gram minyak.
Gambar 4.1 Hasil uji bilangan asam terhadap waktu hidrolisis secara enzimatik Pada CPO
Gambar 4.2 Hasl uji bilangan asam terhadap waktu hidrolisis secara enzimatik pada PKO
4.2 Pengujian Aktivitas Antibakteri Crude Palm Oil
Aktifitas antibakteri dari asam lemak bebas hasil dari hidrolisis Crude Palm Oil (CPO) terhadap Gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan Gram
negatif (Pseudomonas aeruginosa) dapat dilihat pada Lampiran 9 dan Lampiran 10 serta zona hambatnya dapat dilihat pada Tabel 4.2; 4.3; 4.4 dan 4.5.
Tabel 4.2Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 30 ml. Bahan uji Kadar minyak
(ml/100ml)
Rata-rata SD zona hambat (mm) n=3
S. Epidermidis P. aeruginosa
CPO 0 - -
25 - -
50 - -
75 7,25 -
100 8,3 7,6
Berdasarkan hasil pengukuran yang terlihat pada Tabel 4.2, bahwa kadar minyak yang dapat memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Ditjen POM RI (1995), adalah konsentrasi zat dengan zona hambatan yang efektif lebih kurang 14-16 mm. Berdasarkan hasil penelitian diatas didapatkan bahwa asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam dengan volume akuades 30 ml tidak efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Gram positif yaitu Staphylococcus epidermidis dan bakteri Gram negatif yaitu Pseudomonas
aeruginosa karena zona hambat yang dihasilkan asam lemak bebas tersebut lebih
kecil dari syarat yang telah ditetapkan yaitu 14 mm.
Hal tersebut ditunjukkan dengan diameter zona hambat terbesar yang dihasilkan pada kadar minyak 100 ml/100 ml sebesar 8,3 mm untuk bakteri Staphylococcus epidermidis dan 7,6 mm untuk bakteri Pseudomonas aeruginosa
Tabel 4.3Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 60 ml.
Bahan uji Kadar minyak (ml/100ml)
Rata-rata sd zona hambat (mm) n=3
S. Epidermidis P. aeruginosa
CPO 0 - -
25 - -
50 - -
75 7,6 7,35
100 8,725 8,3
Berdasarkan hasil pengukuran yang dapat dilihat pada Tabel 4.3, diameter zona hambat dari asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam dengan volume akuades 60 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan
zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 8,725 mm dan zona hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 8,3 mm
Hasil pengukuran diameter zona hambat dari asam lemak tersebut terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa tidak efektif sebagai antibakteri karena zona hambat terbesar yang dihasilkan dari asam lemak bebas tersebut lebih kecil dari 14 mm.
Tabel 4.4 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 90 ml.
Bahan uji Kadar minyak (ml/100ml)
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis P. aeruginosa
CPO 0 - -
25 - -
50 7,85 -
75 8,75 7,8
Berdasarkan hasil pengukuran yang dapat dilihat pada Tabel 4.4, diameter zona hambat dari asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam dengan volume akuades 90 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan
zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 11,65 mm dan zona hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 9,85 mm
Hasil pengukuran diameter zona hambat dari asam lemak tersebut terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa tidak efektif sebagai antibakteri karena zona hambat terbesar yang dihasilkan dari asam lemak bebas tersebut lebih kecil dari 14 mm.
Tabel 4.5 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 120 ml. Bahan uji Kadar minyak
(ml/100ml)
Rata-rata sd zona hambat (mm) n=3
S. Epidermidis P. aeruginosa
CPO 0 - -
25 - -
50 7,9 7,4
75 8,6 7,75
100 11,8 10,75
Berdasarkan hasil pengukuran yang dapat dilihat pada Tabel 4.5, diameter zona hambatan pada asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam dengan volume akuades 120 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan
tetapi hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa kurang dari 14 mm sehingga tidak efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri tersebut. Hasilnya dapat dilihat pada Gambar 4.3 dan Gambar 4.4.
Gambar 4.3 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas CPO terhadap Staphylococcus epidermidis
Gambar 4.4 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas CPO Pseudomonas aeruginosa
Struktur ampifatik pada asam lemak bebas yang memberikan sifat detergen mengakibatkan rusaknya membran sel pada sel bakteri sehingga menyebabkan asam lemak bebas dapat memasuki bagian dalam sel bakteri. Asam lemak yang memasuki bagian dalam sel bakteri meyebabkan penghambatan pertumbuhan bakteri atau kematian sel bakteri. Tetapi dengan adanya karoten dan sterol menyebabkan menurunkan kerusakan membran sel pada bakteri. Hal ini menyebabkan turunnya aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh asam lemak bebas yang dihasilkan dari hasil hidrolisis CPO. Hal itu disebabkan karena adanya kandungan karotenoid didalam CPO. Karotenoid dalam CPO menyebabkan stabilnya membran sel dengan menurunkan fluiditasnya pada sel bakteri. Dengan demikian, karotenoid dapat melawan efek produk degradasi asam lemak bebas yang reaktif atau peningkatan fluiditas membran (Chamberlain, et al 1991.). Begitu juga dengan sterol pada CPO yang dapat menstabilkan membran sel sehingga dapat menurunkan kerentanan asam lemak bebas pada sel bakteri (Debois, et al., 2010).
4.3 Pengujian Aktivitas Antibakteri Palm Kernel Oil
Palm Kernel Oil (PKO) Aktifitas antibakteri dari asam lemak bebas hasil
PKO hidrolisis terhadap Gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan Gram negatif (Pseudomonas aeruginosa) dapat dilihat pada Lampiran11 dan Lampiran 12 serta zona hambatnya dapat dilihat pada Tabel 4.6; 4.7; 4.8 dan 4.9.
Tabel 4.6Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 30 ml. Bahan uji Kadar minyak
(ml/100ml)
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis P. aeruginosa
PKO 0 - -
25 7,7 7,8
50 11,85 9,3
75 13,115 11,6
100 17,65 14,5
Berdasarkan hasil pengukuran yang terlihat pada Tabel 4.6, bahwa kadar minyak yang dapat memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Ditjen POM RI (1995), adalah konsentrasi zat dengan batas diameter daerah hambatan yang efektif lebih kurang 14-16 mm. Berdasarkan hasil penelitian diatas didapatkan bahwa asam lemak bebas hasil dari hidrolisis PKO selama 24 jam dengan volume akuades 30 ml efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Gram positif yaitu Staphylococcus epidermidis dan bakteri Gram negatif yaitu Pseudomonas
aeruginosa karena zona hambat yang dihasilkan asam lemak bebas tersebut lebih
besar dari syarat yang telah ditetapkan yaitu 14 mm.
Tabel 4.7Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 60 ml. Bahan uji Kadar minyak
(ml/100ml)
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis P. aeruginosa
PKO 0 - -
25 10,75 8,3
50 13,225 12,235
75 15,8 14,425
100 18,4 17,95
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambatan pada asam lemak bebas PKO hasil hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 60 ml bahwa aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100
ml. Hal itu ditunjukkan dengan zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 18,4 mm dan zona hambat pada bakteri
Pseudomonas aeruginosa yaitu 17,95 mm.
Hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada asam lemak bebas tersebut efektif
sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa.
Tabel 4.8Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 90 ml. Bahan uji Kadar minyak
(ml/100ml)
Rata-rata sd zona hambat (mm) n=3
S. Epidermidis P. aeruginosa
PKO 0 - -
25 12,65 10,425
50 13,45 13,115
75 16,115 16,25
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambatan pada asam lemak bebas bebas PKO hasil hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 90 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 18,4 mm dan zona hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 17,95 mm.
Hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada asam lemak bebas bebas hasil hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 90 ml menunjukkan bahwa asam lemak bebas tersebut efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa.
Tabel 4.9Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 120 ml.
Bahan uji Kadar minyak (ml/100ml)
Rata-rata sd zona hambat (mm) n=3
S. epidermidis P. aeruginosa
PKO 0 - -
25 15,4 12,8
50 17,1 14,725
75 18,6 17,35
100 21,9 19,75
Hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada asam lemak bebas hasil hidrolisis
selama 24 jam dengan volume akuades 120 ml menunjukkan bahwa asam lemak bebas tersebut efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa.
Gambar 4.3 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas PKO terhadap Staphylococcus epidermidis
BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN
4.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil hidrolisis Crude Palm Oil (CPO) dan Palm Kernel Oil (PKO) dengan enzim lipase diperoleh;
a. Volume akuades untuk hidrolisis CPO dan PKO adalah 120 ml dan waktu optimum adalah 24 jam.
b. Bilangan asam paling besar yang dihasilkan CPO dan PKO adalah 204, 6275 mg KOH/gram minyak dan bilangan asam tertinggi yang dihasilkan PKO adalah 246,8405 mg KOH/gram minyak.
c. CPO dan PKO memiliki aktivitas antibakteri terhadap gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan gram negatif (Pseudomonas aeruginosa) tetapi aktivitas antibakteri lebih baik ditunjukkan terhadap gram positif (Staphylococcus epidermidis)
d. PKO memiliki potensi antibakteri lebih baik daripada CP,. zona hambat yang untuk PKO pada bakteri Staphylococcus epidermidis (21,9 mm) dan Pseudomonas aeruginosa (19,75mm) lebih besar daripada zona hambat yang
dihasilkan CPO Staphylococcus epidermidis (11,8 mm) dan Pseudomonas aeruginosa (10,75 mm).
4.2 Saran
