34 METODOLOGI
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di laboratorium Biokimia Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Laboratorium Hewan Percobaan dan Kimia,Seafast Centre dan ITP, IPB, Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan-IPB. Penelitian ini dilakukan dari bulan Juli 2008 sampai Desember 2008.
Bahan
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini termasuk sorgum putih varietas kawali, yang diperoleh dari petani di Gunung Kidul-Jawa Tengah dan jewawut (milet) dari kios pakan burung di Bogor.
Pakan standar terdiri dari kasein sebagai sumber protein dari toko bahan kimia di Bogor, minyak jagung sebagai sumber lemak, tepung maizena (alpha corn starch) merk Honig sebagai sumber karbohidrat dari toko kue di Bogor, ampas tebu sebagai sumber selulosa dari pasar Anyar di Bogor, multivitamin (vitamin mix) dari toko obat di Bogor dan campuran mineral (mineral mix) dari laboratorium Biokimia Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB.
Komposisi campuran vitamin terdiri dari vitamin A (1000 IU), vitamin B1 (1.4 mg), vitamin B2 (1.6 mg), vitamin B6 (2 mg), vitamin B12 (3 mg), vitamin C (60 mg), vitamin D3 (100 IU), vitamin E (5 mg), nikotinamida (9 mg), kalsium pantotenat (5 mg). Campuran mineral dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6 Komposisi campuran mineral pakan tikus
Jenis Mineral Jumlah (100 g)
NaCl 139.300 KI 0.790 KH2PO4 389.000 MgSO4. 7H2O 57.300 CaCO3 381.400 FeSO4. 7H2O 27.000 MnSO4. 7H2O 4.010 ZnSO4. 7H2O 0.548 CuSO4. 5H2O 0.477 CoCl2. 6H2O 0.023
Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) galur (strain) Sprague Dawley. Tikus Sprague Dawley jantan berumur 2 bulan,
dengan berat badan 250-300 gram sebanyak 35 ekor, diperoleh dari Laboratorium Balai Pengawasan Obat dan Makanan (BPOM) Jakarta.
Bahan kimia yang digunakan untuk analisa air aquabides, air destilat steril, alkohol 70% dan 90%, phosphat buffer salin (PBS) (Aplichem, A09649010), RPMI (Roswell Park Memorial Insitute) 1640 (Gibco, 22400-013), NaHCO3 (Sigma,
S5763), NH4CL (Merk, A810845), penicilin-streptomisin (Sigma), biru trifan
(tryphane blue), Lipopolisakarida (LPS) Salmonella typhimurium (Sigma, L6366), Fetal Bovine Serum (FBS), MTT (3-( 4.5- dimethylthiazol-2 yl)-2.5 diphenyl-tetrazolium bromide) (Sigma, M2128), HCL pekat, Isopropanol, gas CO2 dan O2,
1.1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) (Sigma D-9132), etanol, tokoferol, KCL, asam tiobarbutirat (TBA), asam tiokloroasetat (TCA), BHT, BSA, tetraetoksipropana /TEP (Sigma T9869), NBT (Sigma D8130), xanthin oksidase (grade IV, Sigma X-4875), xanthin (Sigma, X-7375), NaEDTA, H2O2, glutation tereduksi (Sigma),
NADPH (Sigma), KH2PO4 H20, Na2HCO3 H20.
Alat
Alat yang digunakan untuk pembuatan tepung sorgum dan jewawut sebagai pakan tikus percobaan adalah alat penyosoh serealia (Satake Grain Testing Mill) timbangan, pengayakan dan mesin penepungan (Dish mill).
Alat untuk analisis terdiri dari neraca analitik, peralatan gelas seperti cawan petri, pipet volume, erlenmeyer, beaker, tabung reaksi, pengaduk gelas, botol-botol tempat reagen, laminar hood steril (Hitachi), pipet mikro 100 µl dan 1000 µl (Effendorf), tips biru dan kuning, syringe 5 ml steril tabung sentrifuse 15 ml (Coning), sentrifuse, hemasitometer, mikroskop biasa (Nikkon, Jepang) dan mikroskop inverted (Axiovest 25), lempengen kultur sel 96 sumur (Costar), incubator CO2 (Napco 5400), ELISA reader (BioRad), membran steril 0,22 µm (Coning),
vortex, spektrofotometer, spektrofotometer UV-Vis (Ishimatsu, UV- 160) kuvet, pH-Meter (Orion, 210 A), water bath (GFL 1083), toples, dan peralatan bedah tikus.
Alat untuk perawatan dan pemeliharaan hewan percobaan adalah kandang tikus (kandang biasa) dari bahan plastik, tempat pakan dari bahan gelas dan tempat minum (botol berwarna 50 ml), timbangan tikus dan alat pembersih kandang.
Metode Penelitian
Penelitian ini dibagi atas 2 kegiatan yaitu: (1) persiapan pakan tikus dan penanganan tikus dan (2) analisis proliferasi limfosit, malondialdehida (MDA) aktivitas antioksidan (DPPH) dan aktivitas enzim antioksidan.
1. Persiapan Pakan dan Penanganan Tikus Sprague Dawley a. Persiapan PakanTikus Sprague Dawley
Pembuatan Tepung Sorgum dan Jewawut untuk Pakan Tikus Sprague Dawley Biji sorgum dan jewawut disosoh, sorgum 20 detik/200 gram dan jewawut 100 detik/200 gram mengacu pada penelitian Yanuar 2009, kemudian dilakukan pengayakan dengan nampan agar didapatkan biji sosoh sorgum dan jewawut yang bersih dari sisa-sisa kotoran. Biji sorgum dan jewawut yang bersih dihaluskan (tepung) dengan alat Dish mill, saringan 80 mesh, kemudian tepung sorgum dan jewawut dianalisis proksimat. Tepung sorgum dan jewawut ini yang digunakan sebagai sumber karbohidrat pada pakan tikus sesuai perlakuan.
Persiapan Pakan Tikus (Standar dan Perlakuan)
Pakan yang diberikan pada tikus mengacu pada pakan standar America Institute of Nutrition (AIN 1976) yang sesuai dengan kebutuhan gizi tikus. Komposisi pakan standar dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6 Komposisi pakan standar tikus (AIN 1976)
Bahan Penyusun Jumlah (%)
Protein (kasein)
Lemak (minyak jagung) Selulosa (ampas tebu) Campuran vitamin Campuran mineral Karbohidrat (maizena) Air (aqua) 20 5 5 1 3.5 55.5 10
Pakan perlakuan dibuat mengacu pada Tabel 6. Perbedaan pakan perlakuan dengan pakan standar terletak pada perbedaan sumber karbohidrat (maizena). Pakan perlakuan sumber karbohidrat (maizena) disubstitusi atau diganti dengan sejumlah karbohidrat yang dapat dicerna (available carbohydrate) dari tepung sorgum atau
jewawut. Karbohidrat yang dapat dicerna (available carbohydrate) disini adalah karbohidrat yang tidak termasuk kandungan serat atau karbohidrat yang sudah dikoreksi dengan kadar serat. Penentuan pakan tikus percobaan secara isokalori dan isonitrogen. Komposisi pakan perlakuan dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7 Komposisi pakan perlakuan selama masa pemeliharaan (dalam 100 gram ransum)
Jenis Pakan Kelompok
kontrol Kelompok sorgum 100% Kelompok Sorgum 50% Kelompok jewawut 100% Kelompok jewawut 50% Kasein (protein) 22.22 13.92 13.92 13.62 13.62
Minyak jagung (lemak) 5.83 3.51 4.33 4.33 4.33
Campuran vitamin 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Campuran mineral 3.18 2.54 2.54 2.86 2.86
Ampas tebu (selulosa) 4.42 2.02 2.02 2.72 2.72
Air Karbohidrat: Maizena 10.00 55.35 10.00 10.00 33.50 10.00 10.00 32.73 Tepung Sorgum Tepung Jewawut 67.01 33.50 65.47 32.73
b. Penanganan Tikus Sprague Dawley
Tikus mengalami masa adaptasi selama dua minggu kemudian sebanyak 35 ekor tikus dibagi menjadi lima kelompok perlakuan (Tabel 8). Setiap kelompok terdiri dari tujuh ekor tikus sebagai ulangan. Perlakuan diberikan selam tujuh minggu. Kandang tikus yang digunakan jenis kandang biasa dan bersifat individu atau setiap ekor menempati satu kandang dalam ruangan ber-AC dengan suhu diatur 23 oC, pengaturan gelap terang secara alami. Pakan yang diberikan pada semua tikus selama masa adaptasi adalah sama yaitu pakan standar atau pakan kelompok kontrol. Pakan dan minum (air) diberikan pada tikus secara ad libitum.
Tabel 8 Pakan perlakuan tikus Sprague Dawley
Perlakuan Keterangan
Kontrol (KO)
Pakan dengan sumber karbohidrat (available carbohydrate) standar yaitu maizena
Sorgum 50% (S-50)
Pakan dengan sumber karbohidrat (available carbohydrate) dari 50% sorgum dan 50% maizena.
Sorgum 100% (S-100)
Pakan dengan sumber karbohidrat (available carbohydrate) dari 100% sorgum.
Jewawut 50% (J-50)
Pakan dengan sumber karbohidrat (available carbohydrate) dari 50% jewawut dan 50% maizena.
Jewawut 100% (J-100)
Pakan dengan sumber karbohidrat (available carbohydrate) dari 100% jewawut.
Pemberian pakan pada tikus selama pemeliharaan dilakukan setiap hari pada waktu yang sama yaitu pukul 06 : 00 – 08 : 00 WIB. Pakan yang diberikan setiap hari per ekor sebanyak 20 g dan minum ad libitum. Penimbangan jumlah pakan yang tersisa dilakukan setiap hari. Penimbangan berat badan setiap dua hari, dan pembersihan kandang setiap empat hari.
Pengambilan Organ Tikus Sprague Dawley
Setelah tujuh minggu masa perlakuan, tikus SD diterminasi/dieuthanasi secara dislocatio os cervical (cervical dislocatio) yang dilakukan dengan steril dan cepat. Organ limfa diambil langsung digunakan untuk analisis proliferasi limfosit, sedangkan organ hati dilakukan pencucian dengan buffer fosfat sallin (PBS), setelah ditiriskan ditimbang beratnya, selanjutnya dibungkus alumunium foil dan disimpan dalam frezeer pada suhu -20 oC untuk dianalisis aktivitas antioksidan dengan metode DPPH, kadar malondialdehida (MDA), dan aktivitas enzim antioksidan yang terdiri dari enzim superoksida dismutase (SOD), enzim katalase (CAT) dan enzim glutation peroksidase (GPx).
2. Analisis
a. Pengukuran Proliferasi Sel limfosit Limfa Isolasi Limfosit Limfa (Prangdimurti 1999)
Tikus yang sudah dieutiasi secara dislocasio os cervicalis diambil organ limfanya secara steril, kemudian dicuci dengan 5 ml PBS dalam botol steril selanjutnya dipindahkan kedalam cawan petri steril yang berisi 5 ml RPMI-1640. Limfa tersebut digerus sampai homogen diatas kain saring steril dengan syringe steril, selanjutnya dimasukkan dengan pipet pasteur ke dalam tabung sentrifuse 15 ml. Pengerjaan dilakukan di dalam laminar flow hood steril, kemudian disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet (bagian bawah) dijentik-jentikkan, ditambah 2 ml NH4CL 0.85% steril, didiamkan selama 2
menit, kemudian ditambahkan 3 ml RPMI-1640, selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Supernatan yang berisi sel darah merah yang lisis dibuang. Pelet dijentik-jentikkan, ditambah 5 ml RPMI, disentrifuse kecepatan
2500 rpm selama 5 menit. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Endapan sel limfosit disuspensikan dengan 3-5 ml RPMI-1640 lengkap (yang sudah ditambah antibiotik).
Penghitungan Sel Limfosit Limfa
Sebelum dilakukan pengkulturan suspensi sel limfosit, dilakukan perhitungan sel limfosit dengan biru trifan. Suspensi sel limfosit sebanyak 50 µl ditempatkan dalam sumur microplate, ditambah 50 µl biru trifan (perbandingan 1:1). Perhitungan sel limfosit dilakukan dengan hemasitometer di bawah mikroskop pada pembesaran 400 kali, perhitungan dilakukan pada sel yang hidup sel (sel hidup lebih besar 95%). Sel hidup tampak terang, jernih berbentuk bulat sedangkan sel yang mati akan berwarna biru mengkerut. Berdasarkan hasil perhitungan pada area 2 kotak besar (@ 16 kotak kecil) kemudian ditentukan jumlah sel yang hidup setiap milimeter suspensi dengan rumus :
N = V/2 x F X 104 sel/ml Keterangan
N = jumlah sel/ml
V/2 = rata-rata jumlah sel terhitung dari 2 bagian bidang pandang F = faktor pengenceran (2)
104 = jumlah sel per luas bidang pandang (1.0 mm x 1.0 mm x 0.1 mm)
Pengujian Proliferasi Sel Limfosit Limfa menggunakan MTT (mengacu Puspaningrum 2003; Keller et al. 2005)
Tujuannya untuk melihat kemampuan proliferasi sel limfosit melalui teknik kultur. Suspensi sel limfosit ditepatkan menjadi 2 x 106 sel/ml melalui pengenceran dengan RPMI-1640. Selanjutnya dikultur dalam microplate 96 sumur, kedalam tiap sumur dimasukkan 60 µl suspensi sel limfosit, kemudian ditambah 30 µl mitogen LPS S. Thyphi sehingga konsentrasi dalam tiap sumur 12.5 µg/ml. Tiap suspensi sel limfosit limfa tikus di kultur dalam 3 sumur atau dibuat triplo. Sebagai kontrol jumlah mitogen yang ditambahkan diganti dengan media RPMI-1640 lengkap, kemudian ke dalam tiap-tiap sumur ditambah 10 µl FBS sehingga volume tiap sumur berisi 100 µl. Kultur sel diinkubasi pada suhu 37 oC dengan atmosfer 5% CO2, 95% udara dan RH
96% selama 72 jam. Empat jam sebelum masa inkubasi berakhir ke dalam masing-masing sumur ditambahkan 10 µl larutan MTT 0.5%. Setelah masa inkubasi berakhir 80 µl HCL-isopropanol 0.04 N ditambahkan pada setiap sumur. Kemudian absorbansi
masing-masing sumur diukur dengan microplate reader (ELISA reader) pada λ 570 nm. Nilai OD (optical dencity). Hasil pembacaan dengan ELISA reader bersifat proporsional terhadap jumlah sel hidup dengan menentukan indeks stimulus (IS) sebagai penentuan aktivitas proliferasi. IS dihitung dengan menggunakan persamaan berikut :
IS = OD sel perlakuan (dengan mitogen/LPS) OD sel kontrol (tanpa mitogen/LPS)
Persiapan Homogenat Hati (Singh et al. 2000)
Hati sebanyak 1.25 g dicacah dalam kondisi dingin dalam 5 ml larutan PBS yang mengandung 11.5 g/L KCL, kemudian disentrifuse pada 1074 g (4000 rpm), 10 menit pada kondisi dingin (T: 4 oC) sehingga diperoleh supernatan jernih (homogenat). Supernatan jernih (homogenat) ini digunakan untuk analisis aktivitas antioksidan dengan metode DPPH, kadar malondialdehida (MDA), aktivitas enzim antioksidan meliputi enzim superdioksida dismutase (SOD), enzim katalase (CAT) dan enzim glutation peroksidase (GPx).
b. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Hati (Hassan et al. 2006)
Supernatan jernih (hati) sebanyak 20 µl dimasukkan tabung reaksi, kemudian ditambahkan 3 ml serta DPPH (0.06 mM dalam etanol), dikocok kemudian disimpan dalam ruang gelap (tanpa cahaya) selama 30 menit. Absorbansi sampel diukur dengan spektrofotometer pada λ 517 nm. Sebagai kontrol digunakan campuran larutan DPPH dan etanol. Aktivitas antioksidan (antiradikal bebas) hati dapat dihitung :
Aktivitas Antiradikal Bebas (%) = Absorbansi Kontrol – absorbansi sampel x 100 % Absorbansi Kontrol
c. Pengukuran Kadar Malondialdehida (MDA) Hati Prosedur Pengukuran (Singh et al. 2000)
Sebanyak 0.5 ml supernatan jernih (hati) ditambah 2.0 ml HCL dingin (0.25 N) yang mengandung 15% TCA, 0,38% TBA dan 0,5% BHT. Campuran dipanaskan 80 oC selama 1 jam. Setelah dingin, campuran disentrifuse pada 3500 rpm (822g) selama 10 menit. Supernatan diambil diukur absorbansi dengan
spektrofotometer pada λ 532 nm. Sebagai larutan standar digunakan TEP (tetraetoksipropana).
d. Pengukuran Aktivitas Enzim Superoksida Dismutase (SOD) Hati (Wijeratne et al. 2005; Prangdimurti 2007)
Metode pengukuran SOD ini digunakan untuk mengukur kapasitas menangkap radikal anion superoksida. Anion superoksida dihasilkan secara enzimatis oleh sistem xantin-xantin oksidase.
Supernatan jernih hati sebanyak 0.06 ml direaksikan dengan 2.7 ml buffer natrium-bikarbonat 50 mM yang mengandung 0.1 mM EDTA (pH 10), 0.06 ml xantin 10 mM, 0.03 ml BSA 0.5%, 0.03 ml NBT 2,5 mM. Selanjutnya dilakukan penambahan 0.06 ml xantin oksidase (0,04 unit). Absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada λ 560 nm dari 0-30 menit dengan interval waktu 5 menit. Absorbansi yang digunakan dalam perhitungan pada 30 menit. Sebagai kontrol digunakan larutan yang digunakan pada saat preparasi hati (PBS + KCL). Aktivitas SOD dihitung dengan menggunakan persamaan berikut:
{1-(A/B)} x 100
Dimana, A = Absorbansi larutan sampel , B = Absorbansi larutan kontrol.
e. Pengukuran Aktivitas katalase (CAT) Hati (Iwai et al. 2002)
Supernatan jenih hati sebayak 0.5 ml ditambahkan ke dalam 2.0 ml bufer kalium fosfat 50 mM (pH 7.0) yang mengandung 10 mM H2O2. Perubahan
absorbansi diukur dengan spektrofotometer UV Vis pada λ 240 nm, dicatat setiap 15 detik selama 1 menit. Aktivitas katalase diukur berdasarkan reduksi hidrogen peroksida dan dihitung dengan menggunakan kemiringan (slope) kurva absorbansi larutan sampel (SL) maupun larutan blanko SLb) dengan rumus :
Aktivitas katalase (U/ml) = (SL-SLb) x 2.5 0.436 0.5
f. Pengukuran Aktivitas Glutation Peroksidase (Plagia dan Valentine 1967 modifikasi Flohe & Gunzler 1984)
Prinsipnya adalah glutation peroksidase (GPx) mengkatalis glutation tereduksi (GSH) menjadi glutation teroksidasi (GSSG) yang kemudian direduksi kembali
menjadi glutation tereduksi dengan enzim glutation reduktase dengan ko-faktor NADPH sebagai pereduksi.
Pengukuran Aktivitas Glutation Peroksidase (GPx) Hati
Supernatan jernih (hati) sebanyak 200 µl ditambahkan 200 µl buffer phosfat 0.1 M pH 7.0 yang mengandung 0.1 mM EDTA, 200 µl glutation tereduksi (GSH) 10 mM dan 200 µl enzim glutation reduktase (2.4 unit). Kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37 oC kemudian ditambahkan 200 µl NADPH 1.5 mM. Diinkubasi lagi pada suhu yang sama selama 3 menit, ditambahkan 200 µl H2O2 1.5
mM. Absorbansi diukur diantara waktu 1-2 menit dengan spektrofotometer pada λ 340 nm.
Perhitungan
M Unit GSH-Px = Abs x Vt x 2 x 1000 x 1 6.22 x Vs mg protein Abs = Perubahan absorbansi
Vt = volume total (ml)
6.22 = koefesien ekstrinsik dari NADPH
2 = 2 mol GSH yang setara dengan 1 mol NADPH 1000 = perubahan menjadi miliunit
Vs = volume sampel (ml)
3. Rancangan percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan lima perlakuan dan tujuh kali ulangan dengan persamaan sebagai berikut:
γijk = µ + Ai +Σij
Keterangan:
γijk =variabel respon yang dipengaruhi
µ = nilai tengah perlakuan
Ai = perlakuan pada sumber karbohidrat pakan tikus percobaan ke-i (i=1,2,3...5) Σij =gallat eror perlakuan akibat tujuh kali ulangan
Data yang didapat dianalisis statistik dengan SAS release 6.12, setelah pada uji anova terdapat perbedaan pada taraf signifikan α = 5% dilanjutkan dengan uji Duncan
(DMRT). Diagram alir penelitian kegiatan penelitian dapat dilihat pada Gambar 7.
Biji Sorgum Biji Jewawut Sprague Dawley
Dedak Tepung Sorgum/jewawut Limfa Hati
Gambar 7 Diagram alir kegiatan penelitian. Disosoh dengan Satake Grain Test
(Sorgum 20 dtk/200g; Jewawut 100 dtk/200g)
Dikandangkan
(individual pada kandang biasa)
Dikelompokan (5 kelp @ 7 ekor)
Dibedah
Analisis Proliferasi limfosit : 1. Isolasi limfosit
2. Perhitungan sel limfosit 3. Pengujian proliferasi dengan metode MTT
Analisis:
1. Aktivitas antioksidan (DPPH). 2. Kadar malondialdehida (MDA). 3. Aktivitas enzim SOD.
4. Aktivitas ensim CAT 5. Aktivitas enzim GPx. Penepungan
Dengan Dish Mill
Dicampur
(komposisi ransum lainnya) (d
Diadaptasikan
(semua diberi pakan standar selama 2 minggu)
Perlakuan
