UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL SiHa
SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh : Nur’aniyah NIM : 048114040
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL SiHa
SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh : Nur’aniyah NIM : 048114040
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
HALAMAN PERSEMBAHAN
Sesungguhnya sesudah kesulit an it u ada kemudahan
(Surat Al I nsyirah : 5)
Anggaplah set iap st ep dalam hidup ini adalah proses unt uk mencapai
suat u kebahagiaan
Barang siapa berbuat kebaikan seberat benda yang t erkecilpun,
maka ia akan melihat nya dan barang siapa berbuat keburukan
seberat benda yang t erkecilpun, maka ia akan melihat nya
(Surat Al Z alzalah : 7 & 8)
Dan sesungguhnya akhir it u adalah lebih baik bagimu
daripada permulaan (surat Ad Duha : 4)
Kupersembahkan karya ini untuk : Tuhanku Allah SWT ( 4JJI ) M ama, M imi, Teteh Romi, Teteh Tika tercinta atas kasih sayang, do’ a dan dukungannya
Orang-orang yang menyayangiku Teman-teman dan Almamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Nur’aniyah
Nomor Mahasiswa : 048114040
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Uni-versitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &
Pav) Terhadap Kultur Sel SiHa” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Yogyakarta, 19 Juli 2008
Yang menyatakan
vi
PRAKATA
Atas berkat rakhmat Allah SWT dan karunia – Nya skripsi yang berjudul ”Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel SiHa” ini dapat diselesaikan.
Selesainya skripsi ini tidak lepas dari bantuan banyak pihak untuk itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga, dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.
3. Yohanes Dwiatmaka, M. Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan atas segala arahan, saran, kritik, dan waktunya.
4. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan atas segala arahan, saran, kritik, dan waktunya.
5. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S. J., M. Sc., yang telah memberikan bimbingan dalam pengolahan data statistik dan memberikan banyak masukan dan saran.
6. Mbak Yuli dan segenap teknisi Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada yang telah membantu jalannya penelitian sehingga dapat terselesaikan dengan baik.
7. Mama, mimi, teteh romi & mas wendy, teteh tika & mas arief, atas kasih sayang, dorongan motivasi, do’a dan dukungannya selama ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
8. Mas Ardiansyah yang senantiasa memberi dorongan motivasi, do’a, serta berbagi suka dan duka.
9. Rissa, Tika, Nophie, Rinta, Rina, Made ayu, Wida, Anna, Atin, Amanda, dan Novi buat persahabatan yang indah. Aku tak merasa sendiri karena kalian semua. 10.Ririt, Sisca, Meri, Eva, atas canda tawa, keluh kesah, kebersamaan dan
kerjasamanya selama penelitian.
11.Teman-teman kosku : Fitri, Nancy, Agnes, Nita, Presty, dan teman-teman kelas FKK 2004 buat kebersamaan yang indah selama ini.
12.Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.
Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Penulis juga menyadari sepenuhnya penulisan skripsi ini tidak terlepas dari keterbatasan dan kekurangan penulis. Oleh karena itu, diharapkan kritik dan saran yang membangun demi penyempurnaan skripsi ini. Besar harapan penulis bahwa skripsi ini dapat bermanfaat dan dapat mendorong mahasiswa untuk berkarya lebih baik bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan kemajuan dunia farmasi di Indonesia.
Penulis
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
INTISARI
Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang ditakuti karena banyak mengakibatkan kematian di seluruh dunia. Banyak studi telah dikembangkan untuk memperoleh senyawa antikanker dari bahan alam, salah satunya yaitu daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap sel SiHa.
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memberi perlakuan terhadap sel SiHa dengan ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar tertentu. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode direct counting (perhitungan langsung). Data yang diperoleh berupa persen kematian sel dan harga LC50 yang kemudian diolah dengan analisis probit dan anova satu arah.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel SiHa. Harga LC50 yang diperoleh dari ekstrak etanolik daun sirih merah adalah 200,6 µg/ml. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah diperkirakan mengandung senyawa yang memiliki aktivitas antikanker.
x
ABSTRACT
Cancer is one of the most frightened disease because it causes death in all of the world. A lot of studies have been done to gain a new anticancer compound, one of them is the leaves of celebes pepper (Piper crocatum Ruiz & Pav). The objective of the research is to find out whether the ethanolic extract of celebes pepper leaves have cytotoxic against SiHa cells.
This research is pure experimental with complete random and one way design. The cytotoxic test was obtained by applying a series concretation of ethanolic extract of celebes pepper leaves to SiHa cells. The cytotoxicity effect was determined using direct counting. The data were collected by counting the percentage of death cells and the LC50 value were analyzed using probit statistic analysis and one way Anova.
The result indicated that the ethanolic extract of celebes pepper leaves had cytotoxic effect to SiHa cells. The LC50 value obtained from the ethanolic extract of celebes pepper leaves is 200,6 µg/ml. Therefore, the ethanolic extract of celebes pepper leaves might contains of compound that has anticancer activity.
Keyword: celebes pepper leaves, cancer, SiHa cell, citotoxicity, LC50 value.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ... .. ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii
HALAMAN PENGESAHAN ... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ... v
PRAKATA... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... viii
INTISARI... ix
ABSTRACT... x
DAFTAR ISI... xi
DAFTAR TABEL... xv
DAFTAR GAMBAR ... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ... xvii
BAB I PENGANTAR ... 1
A. Latar Belakang ... 1
1. Permasalahan ... 3
2. Keaslian penelitian... 4
3. Manfaat penelitian... 4
B. Tujuan ... 4
1. Tujuan umum…… ... 4
xii
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ... 5
A. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) ... 5
1. Keterangan botani ... 5
2. Sinonim ... 5
3. Nama daerah ... 5
4. Deskripsi ... 5
5. Kandungan kimia ... 6
6. Khasiat dan penggunaan ... 7
7. Penelitian mengenai tanaman sirih merah ... 8
B. Metode Penyarian... 9
1. Definisi ekstrak ... 9
2. Cairan pelarut ... 10
3. Maserasi ... 10
C. Kanker………. ... 11
D. Sel SiHa………... 13
E. Uji Sitotoksisitas ... 14
1. Metode MTT... 15
2. Metode direct counting... 16
F. Landasan Teori... 17
G. Hipotesis ... 17
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 18
A. Jenis dan Rancangan Penelitian... 18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional... 18
1. Variabel bebas... 18
2. Variabel tergantung... 18
3. Variabel pengacau terkendali... 18
4. Definisi operasional ... 19
C. Alat dan Bahan... 19
1. Alat ... 19
2. Bahan ... 20
D. Tata Cara Penelitian... 20
1. Determinasi tanaman... 20
2. Pengumpulan daun sirih merah... 21
3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah ... 21
4. Sterilisasi alat dan bahan... 22
5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh ... 22
6. Preparasi sel SiHa ... 23
7. Pembuatan larutan uji... 24
8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah ... 24
E. Analisis Hasil... 25
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 27
A. Determinasi Tanaman... 27
B. Pengumpulan Daun Sirih Merah... 27
xiv
D. Sterilisasi Alat dan Bahan... 29
E. Uji SitotoksisitasEkstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa... 30
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 42
A. Kesimpulan ... 42
B. Saran... 42
DAFTAR PUSTAKA ... 43
LAMPIRAN ... 47
BIOGRAFI PENULIS ... 68
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel I. Nilai absorbansi ekstrak etanolik daun sirih merah
dengan metode MTT... 33 Tabel II. Potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah
terhadap kultur sel SiHa... 35 Tabel III. Jumlah sel SiHa yang hidup dari tiap sumuran hasil
perhitungan langsung (Direct Counting) pada
Haemocytometer... 48
Tabel IV. Hasil perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dari
masing- masing sumuran... 48 Tabel V. Persentase kematian sel SiHa... 49 Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level
xvi
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Reaksi pembentukan kristal formazan... 31 Gambar 2. Foto kristal formazan di bawah mikroskop... 31 Gambar 3. Grafik hubungan kadar ekstrak etanolik daun sirih merah
terhadap persen kematian sel SiHa penetapan I... 35 Gambar 4. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah
vs angka probit penetapan I ... 37 Gambar 5. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah
vs angka probit penetapan II ... 37 Gambar 6. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah
vs angka probit penetapan III... 38 Gambar 7. Foto penampakan morfologi sel SiHa dalam sumuran
pada jam ke-24... 40 Gambar 8. Foto tanaman sirih merah... 47 Gambar 9. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah
vs angka probit pada sel SiHa... 62 Gambar 10. Foto alat dan bahan... 66
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)... 47
Lampiran 2. Data uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa... 48
Lampiran 3. Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov pada sel SiHa dan Analisis Hasil dengan One Way Anova... 50
Lampiran 4. Cara perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dalam tiap sumuran hasil perhitungan langsung (direct counting)... 51
Lampiran 5. Cara perhitungan persentase kematian sel SiHa………...…. 54
Lampiran 6. Cara perhitungan harga LC50………...…. 56
Lampiran 7. Perhitungan nilai korelasi LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel SiHa pada taraf kepercayaan 95%………...…... 59
Lampiran 8. Grafik hubunga n antara log kadar dengan angka probit……...……….…. 51
Lampiran 9. Harga probit sesuai dengan persentasenya...………….… 63
Lampiran 10. Foto alat dan bahan yang digunakan...……….… 64
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kanker termasuk penyakit yang sangat ditakuti karena penyakit ini sulit disembuhkan, bahkan bisa menyebabkan kematian. Kanker merupakan penyakit yang disebabkan karena adanya sel abnormal. Hingga kini penyebab pertumbuhan sel tubuh yang abnormal tersebut belum dapat diketahui secara pasti.
Penderita kanker semakin meningkat setiap tahunnya. Di negara yang telah maju yang telah berhasil membasmi penyakit infeksi, kanker merupakan penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskular. Di Amerika Serikat kanker merupakan penyebab utama kematian pada wanita antara 30-54 tahun dan anak-anak antara 3-14 tahun (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995). Di Indonesia setiap tahunnya terdapat 100 penderita kanker baru dari setiap 100.000 penduduk (Anonim, 2007a). Saat ini kanker cervix menjadi kanker pembunuh nomor satu di Indonesia. Jumlah penderita kanker cervix adalah 90 hingga 100 per 100.000 penduduk, atau sekitar 230.137 orang yang 63% diantaranya sudah berada di stadium 3-4 dan 50% diantaranya meninggal (Angel, 2008).
Antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif artinya menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Pada umumnya antineoplastik menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas, karena menghambat jumlah pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat misalnya sumsum tulang, epitel germinativum, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
jaringan limfosit. Terapi hanya dapat dikatakan berhasil baik, bila dosis yang digunakan dapat mematikan sel tumor yang ganas dan tidak terlalu mengganggu sel normal yang berproliferasi (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995).
Karena itu sangat diharapkan suatu antikanker yang memiliki toksisitas selektif menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel normal. Untuk mencari pengobatan kanker yang selektivitas aksinya ini, maka dilakukan berbagai penelitian yang terus dikembangkan sampai ke tingkat molekuler. Pada tingkat molekuler kelainan atau kerusakan sel yang mengubah sel normal menjadi sel kanker yang ganas terlihat jelas (Sofyan, 2000).
Kesadaran akan bahaya bahan-bahan kimiawi hasil sintesis yang terkandung dalam obat-obatan modern menyebabkan obat-obatan tradisional yang diwariskan secara turun-temurun menjadi lebih penting dan bernilai. Bahan-bahan untuk itupun telah disediakan secara melimpah oleh alam Indonesia (Soedibyo, 1998). Merebaknya kecenderunga n atau tren hidup kembali ke alam (back to nature) semakin menambah keingintahuan masyarakat tentang khasiat tanaman obat.
3
Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel kanker untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah mempunya i aktivitas terhadap sel kanker. Jenis sel kanker yang berbeda dapat mempunyai sensitivitas dan selektivitas yang berbeda pula terhadap obat-obat antikanker, oleh sebab itu perlu dilakukan penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap berbagai sel kanker. Pada penelitian ini dilakukan uji efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.
Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa ini penting untuk mendapatkan informasi ilmiah tambahan tentang efek sitotoksik ekstrak daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa yang bisa mendukung pencarian obat antikanker dari bahan alam dan dapat digunakan sebagai dasar untuk mengembangkan suatu senyawa antikanker.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang yang ada maka dirumuskan permasalahan sebagai berikut :
a. apakah ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa?
b. seberapa besar harga LC50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Keaslian penelitian
Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan informasi ilmiah dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat, kegunaan, dan efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.
b. Manfaaat praktis
Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai pembuktian secara ilmiah penggunaan ekstrak etanolik daun sirih merah sebagai obat antikanker dari bahan alam.
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan umum
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik.
2. Tujuan khusus
5
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Tanaman Sirih Merah
1. Keterangan botani
Famili : Piperaceae
Genus : Piper
Spesies : Piper crocatum Ruiz & Pav. (Anonim, 2007b)
2. Sinonim
Piper ornatum N. E. Br.
3. Nama daerah
Sirih merah
4. Deskripsi
Tanaman sirih merah tumbuh menjalar. Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap dan tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap buku tumbuh bakal akar.
Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak terkena sinar matahari. Jika terkena sinar matahari langsung pada siang hari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
secara terus- menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram dan kurang menarik (Sudewo, 2005).
5. Kandungan Kimia
Berdasarkan penelitian yang dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).
Flavonoid
Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol yang umumnya ada dalam bentuk terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon. Yang terdapat pada tanaman biasanya merupakan bentuk kombinasi glikosida (Harbone, 1987). Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6 – C3 – C6 yang artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzen tersubsitusi) disambungkan oleh rantai alifatik 3 karbon.
7
Alkaloid
Istilah alkaloid pada umumnya mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dari sistem siklik (Harborne, 1987). Alkaloid sebagai golongan dibedakan dari sebagian besar komponen tumbuhan lain berdasarkan sifat basanya (kation). Senyawa ini biasanya terdapat dalam tumbuhan sebagai garam berbagai asam organik (Robinson, 1995).
6. Khasiat dan penggunaan
Tumbuhan sirih merah digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain sebagai anti diabetes, jantung koroner, radang prostat, TBC, asam urat dan antikanker (Sudewo, 2005).
Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit. Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat merangsang saraf pusat dan daya pikir. Di samping itu, juga memiliki efek pencegah ejakulasi dini, antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, pelindung organ hati, antidiare, antikoagulan, mempertahankan kekebalan tubuh, dan penghilang bengkak. Daun sirih merah juga mampu mengatasi penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, tifus, leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag kronis, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7. Penelitian tanaman sirih merah
Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).
Beberapa dari flavonoid terlihat efektif menaikkan antikanker dan agen kemopreventif kanker (Grotewold, 2006). Diet tinggi flavonoid, buah-buahan, dan sayuran melawan berbagai macam penyakit, terutama penyakit kadiovaskular dan beberapa tipe dari kanker (Ness and powles, 1997). Salah satu studi menunjukkan bahwa flavonoid menghambat karsiogenesis in vitro dan diindikasikan juga substansi in vivo (Caltagirone et al., 2000; Miyagi et al., 2000). Genistein dan daidzein dapat menghambat perkembangan dari kanker yang berkenaan dengan hormon dan non hormon maupun keduanya, termasuk kanker payudara, kanker prostat dan kanker kulit pada tikus. Banyak flavonoid dapat menghambat proliferasi dari berbagai tipe kultur sel kanker manusia (Grotewold, 2006). Penghambatan proliferasi sel kanker payudara pada manusia dan keterlambatan dari tumorigenesis oleh flavonoid juga ditemukan (So et al., 1996).
9
kemungkinan aksinya sebagai senyawa kimia yang mampu menghambat kanker dan diantaranya melalui penghambatan angiogenesis.
Fraksi alkaloid daun jarong (Achyrantes aspera linn) diketahui dapat menghambat siklus pembelahan sel pada stadium metafase (Adyana, 2006). Alkaloid yang berasal dari tanaman vinka bekerja spesifik pada siklus sel dengan menghambat proses mitosis. Alkaloid dari tanaman juga mempunyai kemampuan mengikat tubulin yaitu suatu protein yang menyusun mikrotubulus dengan menghambat atau memblokade polimerasi protein ke dalam mikrotubulus (Chabner et al., 2001).
Golongan alkaloid tanaman dapat menyebabkan gangguan pada membran sel sehingga berakibat komponen penyusun membran akan berubah dan proses fisiologi membran akan terganggu dengan terjadi kerusakkan dan pengkerutan pada membran tersebut (Gill et al., 2001; Jujena et al., 2001).
B. Metode Penyarian
Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Faktor yang dapat mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan- lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim, 1986).
1. Definisi ekstrak
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dari massa atau serbuk yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 1995).
2. Cairan pelarut
Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik (optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau yang aktif, dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa kandungan lainnya, serta ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa kandungan yang diinginkan. Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah sebagai berikut : selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan, dan keamanan (Anonim, 2000). Etanol dapat melarutkan alkaloid, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin, dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).
3. Maserasi
11
C. Kanker
Kanker adalah segolongan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan biologis lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (Anonim, 2007c). Kanker adalah suatu penyakit di mana terjadi pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal, cepat, dan tidak terkendali. Dalam keadaan normal, sel hanya akan membelah diri bila tubuh membutuhkannya seperti mengganti sel-sel yang rusak atau mati. Sebaliknya, sel kanker akan membelah diri meskipun tidak dibutuhkan sehingga terjadi kelebihan sel-sel baru (Dalimartha, 2006).
Dikenal beberapa jenis kanker, seperti karsinoma, sarkoma, limfoma (neoplasma sistem limfatik) atau leukemia (neoplasma ganas sel darah putih). Karsinoma merupakan tumor ganas yang berasal dari sel epitel, misalnya kanker payudara, kanker kulit, dan kanker lambung. Sarkoma merupakan tumor ganas yang berasal dari jaringan mesodermal, misalnya fibrosarkoma (tumor ganas jaringan ikat), limfosarkoma (tumor ganas sistem limfatik), dan osteosarkoma (tumor ganas pada tulang) (Dalimartha, 2006). Kanker dibedakan menjadi dua macam jenis kanker yaitu kanker jinak (benigna) dan kanker ganas (maligna) (Macdonald and Ford, 1997). Disebut kanker jinak apabila kanker membentuk suatu massa sel tunggal dan belum mempengaruhi sel atau jaringan sekitarnya. Jika sel telah menginvasi jaringan disekitarnya dan masuk ke dalam aliran darah atau limfa maka disebut kanker ganas (Albert et al, 1994).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kanker timbul dari sel tunggal yang mengalami mutasi. Mutasi gen dapat menyebabkan pertumbuhan sel meningkat dibandingkan yang lain dan membiarkan sel-sel tersebut tidak terkendali perkembangannnya (Macdonald and Ford, 1997). Sejalan dengan pertumbuhan dan perkembangbiakannya, sel-sel kanker membentuk suatu massa dari jaringan ganas yang menyusup ke jaringan di dekatnya dan bisa menyebar ke seluruh tubuh. Kanker pada dasarnya merupakan sel dengan proliferasi yang tidak terkendali dengan kerusakan gen pada regulator siklus sel. Pertumbuhan kanker merupakan proses mikroevolusioner yang dapat berlangsung dalam beberapa bulan atau beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini dinamakan karsinogenesis di mana dimulai dari satu sel kanker yang memperbanyak diri dan membentuk satu koloni kecil dalam jaringan yang sama dan mengakibatkan terjadinya perubahan genetik (Sherr, 1996).
13
Sel kanker memiliki karakteristik sebagai berikut :
a. Sel kanker mampu mencukupi kebutuhan sinyal pertumbuhannya sendiri. Sinyal pertumbuhan diperlukan agar sel dapat terus membelah. Berbeda dari sel normal, sel kanker dapat tetap dan terus tumbuh.
b. Tidak sensitif terhadap sinyal anti-pertumbuhan. Sel kanker tidak merespon adanya sinyal yang dapat menghentikan terjadinya pertumbuhan dan pembelahan sel, dengan demikian, sel kanker dapat terus membelah.
c. Sel kanker mampu menghindar dari mekanisme apoptosis. Apoptosis merupakan program bunuh diri sel ketika sel tersebut mengalami kerusakan, baik struktural maupun fungsional, yang tidak dapat ditolerir lagi. Namun sel kanker dapat menghindar dari kematian dengan mengeblok jalur terjadinya apoptosis di dala m sel.
d. Sel kanker memiliki potensi tak terbatas untuk mengadakan replikasi.
e. Sel kanker mampu menginduksi angiogenesis untuk mencukupi kebutuhannya akan oksigen dan nutrisi. Akan terbentuk cabang baru pada pembuluh darah yang menuju sel kanker yang kemudian akan mensuplai kebutuhan nutrisi dan oksigen dari sel kanker.
f. Sel kanker mampu menginvasi jaringan di sekitarnya dan membentuk anak sebar. (Hanahan dan Weinberg, 2000)
D. Sel SiHa
Sel SiHa adalah salah satu kanker cervix yang menyebabkan kematian yang tinggi pada wanita. Sel SiHa diperoleh dari fragmen sampel jaringan primer dari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
suatu karsinoma cervix dan merupakan squamosa yang tidak terdiferensiasi. Morfologi sel SiHa mirip denga n sel epitelial dan sel ini me ngandung Human Papilloma Virus 16 (HPV-16) (Anonim, 2007d).
Kanker serviks berkembang secara bertahap, tetapi progresif. Proses terjadinya kanker ini dimulai dengan sel yang mengalami mutasi lalu berkembang menjadi sel displastik sehingga terjadi kelainan epitel yang disebut displasia (Dalimartha, 2006). Kanker cervix kebanyakan terjadi sebagai squamosa karsinoma yaitu sekitar 95% dan sedikit terjadi pada sel endocervical columnal sebagai adenosquamosa karsinoma yaitu sekitar 5%. Faktor- faktor penyebab kanker cervix
antara lain berhubungan seks pada usia dini, pasangan seks berganti-ganti, perokok dan terpapar oleh Human Papilloma Virus (HPV) dan virus herpes simplek II. Pada metastasis melalui sistem limfatik, jarang terjadi metastasis yang jauh (King, 2000).
E. Uji Sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan, pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplastik dari suatu senyawa (Freshney, 1986). Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia (Doyle and Griffiths, 2000).
15
yakni metode in vitro lebih ekonomis, lebih mudah dan ditinjau dari segi kemanusiaan atau moralitas percobaan, metode in vitro lebih manusiawi daripada in vivo. Namun kerugian in vitro adalah kadang-kadang tidak memberikan efek senyawa
uji yang sama dengan bila diberikan secara in vivo (Freshney, 1986).
1. Metode MTT
Uji sitotoksik dilakukan dengan metode mikrotitrasi yang merupakan metode uji yang efisien, dalam satu plate terdapat 96 sumuran sehingga lebih banyak data yang didapatkan. Tiap sumuran memiliki luas 28 – 32 mm2 dengan kapasitas medium sebanyak 0,1 atau 0,2 ml. Dengan metode uji ini semua populasi sel terpapar sampel uji (Freshney, 2000).
Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada uji sitotoksisitas adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT, garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil- tiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazolium bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di mitokondria untuk membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel karena tidak dapat menembus membran sel (Barille, 1997). Kemampuan sel untuk mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel . Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan microplate reader (Castell & Gomez-Lechon, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur sampel dalam jumlah banyak (Doyle & Griffiths, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Metode Direct Counting
Metode yang paling umum dilakukan untuk penghitungan sel yang akurat dan efisien adalah denga n menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan persegi untuk mempermudah penghitungan. Menggunakan zat warna seperti trypan blue, penghitungan sel yang hidup dan sel yang tidak hidup dapat dilakukan. Sampling yang akurat, pengenceran dan pengisian bilik secara tepat sangat penting. Pengisian yang berlebihan, adanya gelembung udara dan bilik hitung yang kurang bersih menyebabkan kesalahan penghitungan. Kesalahan statistik dapat dikurangi dengan menghitung cukup sel dengan replikasi yang tetap.
Penghitungan dengan haemocytometer adalah metode yang paling sederhana dan versatile dengan keuntungan yaitu memberikan pengukuran langsung (aktual sel) (Doyle and Griffiths, 2000).
17
F. Landasan Teori
Penelitian yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavanoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri.
Genistein dan daidzein dapat menghambat perkembangan dari kanker yang berkenaan dengan hormon dan non hormon maupun keduanya, termasuk kanker payudara, kanker prostat dan kanker kulit pada tikus. Banyak flavonoid dapat menghambat proliferasi dari berbagai tipe kultur sel kanker manusia. Alkaloid yang berasal dari tanaman vinka bekerja spesifik pada siklus sel dengan menghambat proses mitosis.
Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain. Etanol dapat melarutkan alkaloid, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin, dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas.
G. Hipotesis
Ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian tentang sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian eksperimental
murni yang mengikuti rancangan acak lengkap pola satu arah.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel
a. Variabel bebas
Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml; 750 µg/ml; dan 1000 µg/ml.
b. Variabel tergantung
Persentase kematian sel SiHa. c. Variabel pengacau terkendali
1. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum.
2. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.
19
2. Definisi Operasional
a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.
b. Ekstrak etanolik adalah ekstrak etanolik daun sirih merah dan dinyatakan dalam µg/ml.
c. Sel SiHa adalah salah satu sel kanker cervix yang menyebabkan kematian yang tinggi pada wanita dan mengandung Human Papilloma Virus 16 (HPV-16).
d. LC50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel SiHa dan dinyatakan dalam µg/ml.
C. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat gelas, autoklaf, alumunium foil, Waterbath, Oven, Blender, Ayakan, inkubator CO2 (Memmer), timbangan analitik (Mettler Toledo), tissue, glove, masker, yellow tips, blue tips, effendorf, tabung conical (Nunc), tissue culture flask (Nunc), swing rotor sentrifuge, mikropipet, membran dialisis (Sigma), lemari pendingin (Sharp), cell
counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2), haemocytometer (Neubauer), ELISA reader.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : a. Bahan utama : daun sirih merah segar
b. Bahan untuk ekstraksi : etanol 70 % c. Uji sitotoksisitas :
1. Kultur sel SiHa yang diperoleh dari stok Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
2. Medium pencuci sel : RPMI 1640 (Sigma), Natrium bikarbonat, dan hepes.
3. Medium penumbuh sel : RPMI 1640 (Sigma), FBS (Fetal Bovine Serum) 10 %, Penisilin-Streptomisin 1 % (Gibco), Fungison 0,5 % (Gibco).
4. Pewarna Trypan blue (Sigma) 5. DMSO (Dimetil Sulfoksidase)
6. Reagen Stopper : SDS (sodium dodesil sulfat) dalam HCl 0,01 N (Merck) 7. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)
(Sigma) 8. Tripsin 0,5 % 9. Aquabidest
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
21
Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya me nggunakan acuan baku ( Backer dan Van den Brink, 1965).
2. Pengumpulan daun sirih merah
Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman sirih merah di daerah Mantenan, Mertoyudan, Magelang, Jawa Tengah.
3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah
a. Pembuatan serbuk
Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air menghilang. Daun kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 65-70°C. Setelah kering, lalu diserbuk dengan blender sampai halus dan diayak menggunakan ayakan 0,75 mm.
b. Pembuatan ekstrak daun sirih merah
Serbuk simplisia diekstrak secara maserasi memakai etanol 70%. Untuk tiap 100 gram serbuk digunakan 700 ml etanol 70%. Maserasi yang digunakan adalah secara remaserasi, yakni dengan menambahkan 100 gram serbuk simplisia dengan 500 ml etanol 70% dalam Erlenmeyer, kemudian ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari untuk mencegah reaksi yang dikatalisis oleh cahaya atau perubahan warna. Setelah 24 jam sari diserkai, dis aring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari sebanyak 200 ml, diaduk dan diserkai. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman harus dikocok berulang-ulang
(kira-PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kira 3 x sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65oC, dibantu dengan kipas angin sampai kental.
4. Sterilisasi alat dan bahan
Alat–alat gelas yang akan digunakan dalam keadaan steril, dicuci sampai bersih dan dikeringkan dalam oven. Setelah kering, alat-alat tersebut dibungkus dengan kertas payung, kemudian di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 20 menit dengan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005).
5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh
a. Pembuatan medium pencuci
Media RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml. Larutan selanjutnya dihomogenkan dengan magnetic stirrer, kemudian di buffer dengan HCL 1 N hingga pH nya 7,2 sampai 7,4 dengan pH meter. Selanjutnya larutan disterilkan dengan penyaringan menggunakan membran filter polietilensulfon steril berdiameter 0,22 µm secara aseptis. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979., Sambrook et al, 1989).
b. Pembuatan medium penumbuh
23
almari es pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook, Fritsch dan Maniatis, 1989).
6. Preparasi sel SiHa
a. Propagasi sel SiHa
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel SiHa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifugasi kembali selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet sel ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
b. Panen sel SiHa
Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh
konsentrasi sel sebesar 2,0x104 sel/100 µl dan siap dipakai untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
7. Pembuatan larutan uji
Ekstrak kental ditimbang, dilarutkan dengan pelarut DMSO dan diaduk dengan homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi 100 mg/ml. Sebelum digunakan sediaan ekstrak disterilkan dengan filter membran. Dari sediaan steril ekstrak induk tersebut dibuat sediaan uji dengan konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml; 750 µg/ml; dan 1000 µg/ml.
8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah
a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT
25
selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing- masing sumuran ditambahkan 10 µl MTT 5 µg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 µl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap
sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
b. Uji Sitotoksisitas dengan Metode Direct Counting
Seratus µl suspensi sel SiHa dengan kepadatan 2,0x104 sel/ 100 µl dimasukkan ke dalam sumuran pada 96-well plate, ditambah ekstrak uji pada kadar masing- masing 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml; 750 µg/ml; dan 1000 µg/ml. Untuk kontrol digunakan 100 µl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh. Selanjutnya plate diinkubasi dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37oC. Pada akhir masa inkubasi tiap sumuran diresuspensi, ditambah 50 µl Trypan blue, diresuspensi lagi untuk homogenisasi diambil 10 µl untuk pengamatan.
Ditempatkan dalam haemocytometer, sel siap dihitung dengan counter dibawah mikroskop.
9. Analisis hasil
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan metode perhitungan langsung (direct counting). Disini harga persentase kematian dapat ditentukan dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
menghitung jumlah sel hidup sebagai kontrol dikurangi dengan jumlah sel hidup dengan adanya perlakuan, kemudian dibagi dengan jumlah sel hidup sebagai kontrol dan dikalikan 100 %.
% kematian sel
= − ×100%
∑
∑
∑
kontrol kelompok
hidup sel
perlakuan kelompok
hidup sel kontrol
kelompok hidup
sel
27
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Penelitian ini menggunakan bahan utama berupa daun sirih merah. Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman sebelum digunakan dalam suatu penelitian. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Unive rsitas Gadjah Mada, Yogyakarta dengan mengacu pada referensi baku (Backer dan Van den Brink, 1965). Hasil yang diperoleh dari determinasi menyatakan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah benar tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).
B. Pengumpulan Daun Sirih Merah
Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian ini diambil pada bulan September tahun 2007 di Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Jawa Tengah. Daun sirih merah diambil dari satu pohon dan dalam waktu sekali panen dengan tujuan untuk menghindari kemungkinan terjadinya perbedaan kualitas dan kandungan kimia yang terdapat pada daun sirih merah. Pengambilan bahan dari daerah yang berbeda dapat mengakibatkan kandungan kimia yang bervariasi. Dipilih daun yang tidak terlalu tua dan terlalu muda, sehingga diharapkan mempunyai kandungan senyawa aktif yang optimal.
Daun sirih merah yang telah terkumpul dibersihkan dengan dari kotoran-kotoran yang menempel, seperti debu, serangga, dan benda asing lainnya. Daun sirih merah yang sudah dibersihkan kemudian dikeringkan sampai kering dengan cara
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dimasukkan ke dalam oven pada suhu 60 – 70 °C untuk mengurangi kandungan air, dengan demikian reaksi enzimatis dapat diminimalkan dan menjamin agar kualitasnya tetap baik. Simplisia yag sudah kering diserbuk dengan blender dan diayak dengan ayakan 0,75 mm untuk memperkecil ukuran partikel. Dalam bentuk serbuk, luas permukaan partikel yang dapat kontak langsung dengan cairan penyari menjadi lebih besar sehingga kandungan kimia yang terkandung dapat tersari secara maksimal.
C. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Seratus gram serbuk sirih merah direndam dengan cairan penyari etanol 70%. Pemilihan etanol sebagai cairan penyari didasarkan pada kandungan senyawa yang ada dalam daun sirih merah yaitu flavonoid, alkaloid, polifenolat, minyak atsiri dan tanin yang dapat larut ke dalam etanol. Selain itu, etanol sebagai cairan penyari dikarenakan etanol merupakan pelarut universal. Beberapa kelebihan etanol antara lain lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20% keatas, tidak beracun, netral, absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan, panas ya ng digunakan untuk pemekatan lebih sedikit.
29
tidak menguap karena etanol mudah menguap pada suhu kamar dan mencega h masuknya kontaminan dari luar.
Pada proses maserasi, serbuk daun sirih merah direndam selama 3x24 jam sambil sesekali diaduk. Perendaman dimaksudkan agar susunan sel sampel akan dapat larut dalam cairan penyari. Sedangkan pengadukan bertujuan agar penyari dapat mengalir secara berulang-ulang ke dalam serbuk halus sehingga memungkinkan adanya interaksi antara penyari dengan serbuk. Pada umumnya larutnya zat aktif akan terjadi apabila penyari menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang berisi zat aktif yang dapat larut dalam penyari. Zat aktif dapat keluar dari rongga sel kemungkinan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dan di luar sel.
D. Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi bertujuan untuk menghilangkan kontaminasi mikroorganisme dari alat yang akan digunakan dalam penelitian ini. Proses sterilisasi sangat penting dalam penelitian ini karena objek penelitian merupakan sel yang sangat rentan terhadap adanya kontaminan sehingga dengan adanya kontaminan akan mempengaruhi kematian sel. Oleh karena itu alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu untuk menghilangkan semua pengotor dan kontaminan yang bisa mengganggu pada saat penelitian.
Alat-alat tersebut dicuci sampai bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan kertas payung kemudian disterilisasi. Sterilisasi dilakukan dengan autoklaf selama kurang lebih 20 menit dengan suhu 1210C dan tekanan 2,05 abs bar. Prinsip kerja dari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
autoklaf ialah sterilisasi dengan uap bertekanan yaitu dengan menaikkan tekanan hingga suhu tinggi sehingga terbentuk uap air panas. Uap air panas tersebut akan membunuh mikroorganisme dengan menyebabkan terjadinya koagulasi dan denaturasi protein pada mikroorganisme.
E. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa. Dengan uji ini dapat diketahui konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan sel sampai 50 %. Dapat dikatakan bahwa uji sitotoksisitas yang dilakukan bersifat kuantitatif, yaitu dengan parameter uji sitotoksisitas yang digunakan adalah LC50 (Lethal Concentration 50 %) yang merupakan implementasi potensi ketoksikan suatu senyawa.
31
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) merupakan suatu garam yang larut air. Prinsip uji sitotoksisitas dengan metode MTT adalah terjadinya reduksi garam tetrazolium MTT oleh enzim mitokondrial dehidrogenase yang terdapat dalam mitokondria sel sehingga terbentuk formazan yang berwarna ungu.
N N N N
S N
CH3 CH3
NH N
N N S
N
CH3 CH3 NADH
NAD+
MTT Formazan
Br
Gambar 1. Reaksi Pembentukan Formazan
Intensitas warna yang terbentuk kemudian ditetapkan absorbansinya dengan pembacaan ELISA reader. Pengukuran menggunakan ELISA Reader dilakukan pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang terbaca berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. Semakin besar absorbansi berarti semakin banyak sel hidup yang aktif melakukan metabolisme dan sebaliknya, semakin kecil absorbansi yang terbaca menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup.
Gambar 2. Formazan di Bawah Mikroskop (perbesaran 100x)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Namun pada penelitian ini, ternyata ELISA reader tidak mampu membaca dengan tepat intensitas warna ungu formazan yang terbentuk akibat reaksi MTT dengan kultur sel SiHa. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh warna coklat dari ekstrak etanolik daun sirih merah yang digunakan sebagai senyawa uji. Warna coklat dari ekstrak etanolik ini dapat berpengaruh pada nilai absorbansi yang dihasilkan, karena kemungkinan terjadi penambahan intensitas warna sehingga absorbansi yang terbaca menjadi lebih besar daripada nilai yang sebenarnya. Pada penelitian ini dilakukan pengukuran absorbansi dari perlakuan dan kontrol pada masing- masing konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah.
Hasil yang diperoleh antara pembacaan absorbansi dengan ELISA reader ternyata tidak signifikan dengan foto kultur sel SiHa. ELISA reader memberikan absorbansi yang rendah namun pada foto terlihat bahwa kultur sel SiHa pada seri konsentrasi selnya masih hidup. Seharusnya apabila absorbansinya rendah maka sel banyak yang mati. Karena hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT memberikan data yang fluktuatif, maka selanjutnya dilakukan metode penghitungan langsung (direct counting).
33
Tabel 1. Tabel nilai absor bansi ekstrak etanolik daun sirih merah dengan Metode MTT
Penetapan
I II III
Kadar ekstrak etanolik daun sirih
merah (µg/ml) Absorbansi Absorbansi Absorbansi
Kontrol 0,994 1,050 1,127
125 0,897 0,879 0,903
250 0,863 0,860 0,907
500 0,847 0,851 0,865
1000 0,924 0,882 0,936
2000 0,969 0,928 0,938
4000 1,034 0,983 0,977
8000 1,133 1,118 1,071
16000 1,353 1,337 1,330
32000 1,520 1,483 1,458
Dari tabel di atas dapat dilihat bahwa semakin besar kadar ekstrak etanolik daun sirih merah maka semakin besar pula nilai absorbansi yang diperoleh, hal ini dikarenakan pengaruh dari warna ekstrak etanolik daun sirih merah yang ikut terbaca. Padahal intensitas warna yang terbaca berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. Semakin besar absorbansi berarti semakin banyak sel hidup yang aktif melakukan metabolisme dan sebaliknya, semakin kecil absorbansi yang terbaca menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup. Dengan demikian, metode MTT pada penelitian ini tidak dapat digunakan.
Selanjutnya uji sitotoksisitas menggunakan metode direct counting (Perhitungan langsung), yang dilakukan dengan menghitung jumlah sel hidup perlakuan kemudian dibandingkan dengan jumlah sel hidup kontrol (kontrol media). Metode ini disebut juga metode trypan blue, metode ini tidak dipengaruhi oleh warna dari ekstrak etanolik daun sirih merah. Pada metode ini, penghitungan dilakukan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
secara manual terhadap sel hidup setelah sebelumnya kultur sel diwarnai dengan reagen trypan blue. Sel yang mati akan menyerap reagen sehingga warnanya lebih gelap daripada sel hidup.
Kelemahan dari metode direct counting adalah waktu yang dibutuhkan untuk menghitung sel terlalu lama dan subjekstivitasnya sangat tinggi. Oleh karena itu sebaiknya perhitungan sel dilakukan oleh satu orang dan orang yang sama untuk menghindari atau mengurangi variabel kesalahan yang terlalu besar.
Pada penelitian ini, seri kadar yang digunakan sebanyak 5 konsentrasi dengan konsentrasi tertinggi 1000 µg/ml dan konsentrasi terendah 125 µg/ml. Sebagai kontrol dimasukkan media kultur RPMI 1640 100 µl beserta suspensi kultur sel SiHa. Plate diinkubasi dalam inkubator CO2 5 % + 95 % O2 selama 24 jam. Jumlah sel yang hidup dihitung di bawah mikroskop menggunakan haemocytometer dengan penambahan trypan blue. Untuk mempermudah perhitungan sel dilakukan resuspensi terlebih dahulu. Hal ini bertujuan untuk melepaskan sel dari dinding plate.
35
Tabel II. Tabel potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa
Persen kematian sel SiHa (%) Kadar ekstrak
etanolik daun sirih merah
(µg/ml)
Penetapan I Penetapan II Penetapan III
125 42,86 41,43 41,43
250 54,29 52,86 54,29
500 65,71 65,71 65,71
750 74,29 74,29 74,29
1000 77,14 77,14 77,14
Harga LC50 diperoleh dengan analisis probit (Mursyidi, 1985). Untuk memperoleh harga LC50 ini diperlukan data yang tercantum pada tabel II dan harga probit untuk tiap persentase kematian sel dapat dicari dari tabel probit, kemudian dibuat regresi linier antara log kadar dengan harga probit.
Grafik kadar vs % kematian sel SiHa
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0 200 400 600 800 1000 1200
Kadar (microgram/ml)
% kematian
Gambar 3. Grafik hubungan kadar ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap % kematian sel SiHa penetapan I
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pada gambar 3 dan tabel II dapat dilihat bahwa kenaikan kadar ekstrak etanolik daun sirih merah akan menaikkan persentase kematian sel SiHa, hal ini berarti jumlah sel yang hidup semakin kecil. Pada tabel II, penetapan I kadar terendah ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml menyebabkan persen kematian terkecil yaitu 42,86 %, sedangkan pada kadar tertinggi 1000 µg/ml menyebabkan persen kematian terbesar yaitu 77,14 %. Penetapan II, kadar terendah ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml menyebabkan persen kematian terkecil ya itu 41,43 %, sedangkan pada kadar tertinggi 1000 µg/ml menyebabkan persen kematian terbesar yaitu 77,14 %. Sedangkan pada penetapan III, kadar terendah ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml menyebabkan persen kematian terkecil yaitu 41,43 %, sedangkan pada kadar tertinggi 1000 µg/ml menyebabkan persen kematian terbesar yaitu 77,14 %.
Dari uji sitotosisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa diperoleh harga LC50 sebesar 200,6 µg/ml. Berdasarkan NCI (National Cancer Institute), suatu senyawa dinyatakan berpotensi sebagai antikanker bila memiliki harga LC
37
daun sirih merah ini mempunyai suatu senyawa yang dapat membunuh sel kanker, meskipun dalam jumlah kecil.
Grafik log kadar vs angka probit
y = 1,039x + 2,6264 R2 = 0,9999
0 1 2 3 4 5 6 7
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
Log kadar
Angka probit
Gambar 4. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan I
Grafik log kadar vs angka probit
y = 1,095x + 2,466 R2 = 1
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
Log kadar
Angka probit
Gambar 5. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan II
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Grafik log kadar vs angka probit
y = 1,087x + 2,491 R2 = 1
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
Log kadar
Angka probit
Gambar 6. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan III
Untuk memperjelas hubungan antara kadar ekstrak etanolik daun sirih merah yang diberikan dengan persen kematian sel yang diperoleh maka dibuat grafik hubungan antara log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit seperti terlihat pada gambar 4, 5, dan 6. Pada gambar 4, 5, dan 6 terlihat bahwa terdapat hubungan yang linier antara log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah dengan angka probit.
39
yang berbeda-beda. Hal ini kemungkinan disebabkan karena masing- masing sel kanker mempunyai karakteristik dan morfologi sel yang berbeda pula, sehingga besarnya harga LC50 yang diperoleh pada masing- masing sel kanker berbeda. Seperti halnya pada sel HeLa, sel HeLa diketahui mempunyai membran sitoplasma yang lebih tebal, oleh karenanya dibutuhkan jumlah ekstrak daun sirih merah yang lebih besar untuk dapat berpenetrasi ke dalam sel.
Selain mengamati jumlah sel yang hidup yang merupakan implementasi persen kematian sel, ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah juga dapat dilihat dari gambaran morfologi sel secara mikroskopik untuk mengetahui adanya perbedaan morfologi sel yang dikenai perlakuan dan yang tidak dikenai perlakuan.
(a)
(c)
(b)
(d) i
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 7. Foto penampakan morfologi sel SiHa dalam sumuran pada jam ke 24 (a) kontrol sel (b) perlakuan dengan ekstrak etanolik daun sirih merah kadar 250 µg/ml (c) perlakuan dengan ekstrak etanolik daun sirih merah kadar 500 µg/ml (d) perlakuan dengan ekstrak etanolik daun sirih merah kadar 750 µg/ml (perbesaran 100x) Ket : (i) sel hidup (ii) sel mati
Sel SiHa yang masih hidup tampak seperti helaian daun, berbentuk panjang, tampak cerah dan menempel di dasar sumuran. Dikarenakan membran sel nya masih utuh sehingga trypan blue tidak dapat berikatan dengan protein. Sel SiHa yang mati tampak berbentuk bulat, tampak gelap keruh, berukuran lebih kecil, dan tidak menempel di dasar sumuran. Hal ini dikarenakan pada sel yang mati terjadi kerusakan membran yang mengakibatkan protein di dalam sel akan keluar dan berikatan dengan trypan blue sehingga tampak berwarna biru.
Selain dari morfologi kita juga dapat mengetahui ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa dengan membandingkan kerapatan sel antara kontrol media dengan perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah. Semakin besar konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah, maka kerapatan sel hidupnya akan semakin kecil. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah memberikan pengaruh dengan menginduksi kematian sel. Langkah lain yang dapat ditempuh untuk memperkecil harga LC50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah ini adalah dilakukannya fraksinasi sehingga diperoleh senyawa-senyawa yang lebih efektif dalam membunuh sel kanker.
41
dilakukan analisis variansi (anova), terlebih dahulu dilakukan uji Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui apakah data yang ada terdistribusi normal atau tidak. Dari hasil uji Kolmogorov-Smirnov diperoleh hasil bahwa distribusinya normal. Dari hasil analisis anova satu arah diperoleh hasil bahwa ada perbedaan secara signifikan antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol yang digunakan (a < 0,05). Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa. Hasil penelitian ini tidak berbeda dengan penelitian terhadap sel Hela, sel T47D, sel Raji, dan sel Myeloma, yakni sama-sama mempunyai aktifitas sitotoksik karena hasilnya berbeda signifikan antara kontrol dan tiap perlakuan. Selain uji- uji diatas, dilakukan juga uji linieritas untuk mengetahui apakah data yang diperoleh linier atau tidak. Dari hasil analisis diperoleh bahwa harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel SiHa signifikan untuk taraf kepercayaan 95 %, di mana r hitung lebih besar dari r tabel. Pada penetapan I diperoleh nilai r hitung = 0,99856 dan r tabel = 0,878; penetapan II diperoleh nilai r hitung = 0,99914 dan r tabel = 0,878; dan penetapan III diperoleh nilai r hitung = 0,99927 dan r tabel = 0,878. Dari uraian nilai r hitung yang diperoleh dengan nilai r tabel diatas dapat dilihat bahwa nilai r hitung yang diperoleh pada masing- masing penetapan lebih besar dari nilai r tabel, maka dapat disimpulkan bahwa korelasinya linier.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa dengan harga LC50 sebesar 200,6 µg/ml.
B. Saran
1. Perlu dilakukan fraksinasi terhadap ekstrak etanolik daun sirih merah untuk selanjutnya diteliti potensi sitotoksisitasnya.
2. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel normal.
43
DAFTAR PUSTAKA
Adyana, I.D.P., 2006, Efek Anti Telomerase Fraksi Alkaloid Terhadap Pembelahan dan Mitosis Sel Mieloma Mencit, Skripsi, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.
Albert, B., P., Lewis, J., Ratt, M., Roberts, K. dan Watson, J.D., 1994, Molecular Biology of The Cell, Third Edition, Garland Publishing Inc., New York
Angel, 2008, http://angel.crysta-corp.com/?p=51, diakses februari 2008
Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-2, 10, Departemen Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta
Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan I, 9-11, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 2007a, Apa Yang Harus Anda Ketahui Tentang Kanker,
http://www.mastel.or.id/indonesia/Artikel%20Kesehatan/Apa%20Yang%20 Harus%20Anda%20Ketahui%20Tentang%20Kanker.htm, Diakses pada Oktober 2007
Anonim, 2007b, Piper crocatum taxonomy,
http://zipcadezoo.com/plants/p/piper_crocatum.asp, diakses pada tanggal 9 Agusus 2007
Anonim, 2007c, http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer, diakses pada oktober 2007. Anonim, 2007d, SiHa Cell, http://www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/308.htm, diakses
pada September 2007
Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I dan II, N. V. Noordhoff, Graningen.
Barille, F.A., 1997, In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, 2-3, 34-43, Academic Press, Valencia, Spanyol.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Caltagirone, S., Rossi, C., Poggi, A., Ranelletti, F. O., Natali, P. G., Brunetti, M., Aiello, F.B., and Piantelli, M., 2000, Flavonoids Apigenin and Quercetin Inhibit Melanoma Growth and Metastatic Potential, Int J Cancer, 87 : 595-600.
Castell, J. V., & Gomez-Lechon, M. J., 1997, In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, 3-6, Academic Press, California.
Chabner, B.A., D.P.Rian, L.Paz-Ares, R.G. Carbonero, and P. Calabresi, 2001, Antineoplastic Agents In Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, Graw-Hill, Medical Publishing Division, P.1417-1421.
Dalimartha, Setiawan, 2006, Ramuan Tradisional Untuk Pengobatan Kanker, cetakan 8, Penerbit Swadaya, Jakarta.
De Muth, James E., 1999, Basic Statistics And Pharmaceutical Statistical Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., New York
Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research, John Willey and Sons Ltd, New York, 12-16, 47-50, 402 – 415
Dwikusumaningtyas, E., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-73, IRL Press, Washington DC
Freshney, R.I., 2000, Culture of Animal Cells, A manual of Basic Technique, 4th Edition, 71-73, A John Wiley & Sons, inc, New York
Ganiswara, S.G dan Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Immunosupresan dalam Farmakologi dan Terapi, Edisi 4, editor Sulistia G. Ganiswara dkk, 686-687, Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta
Gill, S.M.K., N. Balasioner, and P. Parte, 2001, Intermitent Treatment With Taxmoxiven on Reproduction in Male Rat, Asian. J. Andri 3(2)-P 155-158. Grotewold, Erich, 2006, The Science of Flavonoids, Departement of Cellular and
45
Hagman, D.E., 2005, Sterilization, in, Beringer, Paul., Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21th edition, 776-781, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.
Hanahan, D., dan Weinberg, R. A., 2000, The Hallmarks of Cancer, Cell 100, 57-70 Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan, Terbitan kedua, Penerbit ITB, Bandung.
Igura, K., Ohta T., Kuroda Y., and Kaji K., 2001, Resveratrol and Quercetin Inhibit Angiogenesis in Vitro, Cancer Lett, 171 (1): 11-6.
Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York.
Jujena, P., S. M.K.Gill., S. Dsolisa., V. Padwai., N. Balasimor., M. Aleem, and Zool, 2001, Anti Fertility Effect Estradiol in Adult Female Rat, J. Endokrinol. Invest 249(8): 598-607.
King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd edition, School of Biological Sciences, University of Surrey, England.
Macdonald F. and Ford C.H.J., 1997, Molecular Biology of Cancer, edisi I, 1-2, Bios Scientific Publisher Ltd, Oxford OX4 IRE, UK
Meleka, F.M., 1983, Dimensions of the Cancer Problem, 5-9, Karger, New York. Meri, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum
Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nochols, D.E., Mc Laughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Concenient, Planta Medica, Volume 45, 32-34.
Miller, R. E., Rausher, M. D., dan Manos, P. S., 1996, Phylogenetic Systematics of Ipomoea (Convolvulaceae) Based on ITS and Waxy Sequence, Syst Bot, No. 24, 209-227.
Miyagi, Y., Om, A. S., Chee, K. M., and Bennink, M. R., 2000, Inhibition of Azoxymethane-Induced Colon Cancer by Orange Juice, Nutr Cancer, 36: 224-229.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi dan Biologi, 101-102, 157, Penerbit Ghalia Indonesia, Jakarta
Neritika, Kartina., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Ness, A. R., and Powles, J. W., 1997, Fruit and Vegetables, and Cardiovascular Disease: a review, Int J Epidemiol, 26: 1-13.
Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, terjemahan oleh Kosasih Padmawinata, edisi ke enam, Penerbit ITB, Bandung.
Sambrook, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press.
Sherr, C.J., 1996, Cancer Cell Cycle, Science, Volume 274, 5293, 1672 – 1677. So, F. V., Guthrie, N., Chambers, A. F., Moussa, M., and Carroll, K. K., 1996,
Inhibition of Human Breast Cancer Cell Proliferation and Delay of Mammary Tumorigenesis by Flavonoids and Citrus Juices, Nutr Cancer, 26: 167-181.
Soedibyo, M., 1998, Alam Sumber Kesehatan, Manfaat dan Kegunaan, cet 1, Balai Pustaka, Jakarta
Soeripto, 1998, Mekanisme Molekuler Karsinogenesis, Bagian Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Sofyan, R., 2000, Terapi Kanker Pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia Kedokteran, No.127, 5-10.
Sudewo, B., 2005, Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, cet I, 39-41,
