POTENSI ANTIBAKTERI INFUSA DAN EKSTRAK ETANOL DAGING BUAH KEMLAKA (Phyllanthus emblica L.) TERHADAP
Staphylococcus aureus
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh : Christina Alfi NIM : 028114147
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
Tuhan….
Engkau menyelidiki dan mengenal aku
Engkau mengetahui kalau aku duduk atau berdiri Engkau mengerti pikiranku dari jauh…
Engkau memeriksa aku, kalau aku berjalan dan berbaring Segala jalanku Kau maklumi…
Sebab sebelum lidahku mengeluarkan perkataan… Sesungguhnya semuanya telah Kau ketahui, ya Tuhan... Dari belakang dan dari depan Engkau mengurung aku…
Dan Engkau menaruh tangan Mu keatasku…
Terlalu ajaib bagiku pengetahuan itu, terlalu tinggi… Tidak sanggup aku mencapainya
(Mazmur 139:1-6)
Aku melupakan apa yang telah di belakangku…
Dan aku mengarahkan diri pada apa yang di hadapanku, Dan berlari-lari kepada tujuan untuk memperoleh hadiah…
Yaitu panggilan surgawi dari Allah dalam Kristus Yesus (Filipi 3:13-14)
Tuhan, engkau mengetahui segala keinginanku… Dan keluhku pun tidak tersembunyi bagi Mu….(Mazmur 38:10)
FirmanMu…
Jika kamu meminta sesuatu kepadaKu dalam namaKu Aku akan melakukannya…(Yoh 14:14)
Aku tahu…
Untuk segala sesuatu ada masanya, untuk apa pun di bawah langit… Ada waktunya….(Pengkotbah 3:1)
Ini waktunya….
Dengan penuh kerendahan hati, karya sederhana ini aku persembahkan untuk : JESUS, My Saviour & My Master, My Very Best Friend & My Everything,
Mama dan Papa tersayang, My bro’ Aan and All Of My Sisters
Sahabat-sahabatku tercinta, Almamaterku
INTISARI
Buah kemlaka (Phyllanthus emblica L.) adalah salah satu buah yang banyak digunakan sebagai obat tradisional terutama di India. Salah satu penggunaan buah kemlaka secara tradisional adalah sebagai obat diare. Kandungan kimia utama dalam buah kemlaka adalah polifenol termasuk di dalamnya tanin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi antibakteri infusa dan ekstrak etanol buah kemlaka terhadap bakteri S. aureus, untuk mengetahui Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) infusa dan ekstrak etanol buah kemlaka terhadap S. aureus dan untuk mengetahui kandungan kimiawi dalam infusa dan ekstrak etanol buah kemlaka yang diduga aktif sebagai antibakteri.
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni rancangan acak lengkap pola satu arah. Penentuan aktivitas antibakteri dilakukan dengan Metode Difusi menggunakan paper disk, sedangkan penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) ekstrak etanol dan infusa buah kemlaka dilakukan dengan metode dilusi padat. Analisis statistik dilakukan dengan Uji t (t-Test).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol dan infusa buah kemlaka memiliki potensi antibakteri terhadap S. aureus. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ekstrak etanol adalah 1,5% dan infusa adalah 4%. Berdasarkan uji kualitatif dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT ) menggunakan fase diam Silika Gel GF 254 dan fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100 : 11 :11 : 27) serta dideteksi dengan sinar UV 254 dan UV 365 didapat harga Rf untuk ekstrak etanol 0,83, sedangkan untuk infusa didapat harga Rf 0,82. Setelah disemprot dengan FeCl3 didapat bercak berwarna hitam kebiruan sehingga didapat
kemungkinan senyawa yang aktif sebagai antibakteri adalah tanin.
Kata kunci: Antibakteri, Infusa, Ekstrak Etanol, Buah Kemlaka, S. aureus, Konsentrasi Hambat Minimum (KHM), Kromatografi Lapis Tipis (KLT ).
ABSTRACT
One of plants, which the society uses as traditional medicine especially in India is kemlaka (Phyllanthus emblica L.). It can be used traditionally as diarrhea medicine. The main chemical content of kemlaka is polyphenol including tannin. This research is aimed to know antibacterial activity and Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of infusion and etanol exstract of kemlaka against S. aureus, and also to know the chemical content in infusion and etanol exstract of kemlaka which is assumed has an antibacterial activity against S. aureus.
This research was a pure experimental using two ways complete random design. Antibacterial activity was determined by diffusion method using paper disk whereas the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bacterisidal Concentration (MBC) of etanol extract and infusion of kemlaka was identified by dilution method. t-test was used to analyzed the data.
The result showed that etanol extract and infusion of kemlaka possesed an antibacterial activity against S. aureus. The MIC of etanol extract was 1,5 % and the MIC of infusion was 4 %. Qualitative determination using Thin Layer Chromathography (TLC), applying Silica Gel GF 254 as stationary phase and etil acetate : formic acid : acetate acid : water (100 : 11 :11 : 27) as mobile phase. Yield Rf was 0,83 for etanol exstract and 0,82 for infusion. When the spot was introduced to FeCl3, it turned blue black, indicating that the spot contain tannin.
Key words: Antibacterial potency, Infusion, Etanol extract, Kemlaka, S. aureus, Minimum Inhibitory Concentration (MIC), Minimum Bacterisidal Concentration (MBC), Thin Layer Chromatography (TLC).
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat dan kasih karuniaNya yang telah diberikan kepada penulis dalam penyusunan skripsi yang berjudul POTENSI ANTIBAKTERI INFUSA DAN EKSTRAK ETANOL DAGING BUAH KEMLAKA (Phyllanthus emblica L.) TERHADAP Staphylococcus aureus.
Penyusunan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) pada program studi Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma. Dalam penyusunan skripsi ini, penulis mendapatkan banyak bantuan dari berbagai pihak dalam hal materi, motivasi, doa, pengarahan dan bimbingan. Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada semua pihak yang telah membantu penulis menyelesaikan skripsi ini, terutama kepada:
1. Papa Lukas Rismanto, Mama Debora Winarni dan Adik Aan dan Hanna,
om dan bulik tercinta, terima kasih atas dukungan doa dan kasih sayang yang tiada habisnya.
2. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
3. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M. Si., selaku dosen pembimbing
yang telah memberikan banyak masukan dan motivasi.
4. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S. Si., yang selalu bersedia meluangkan
waktu untuk memberikan bimbingan dan motivasi.
5. Ibu Yustina Sri Hartini, M. Si, Apt., selaku dosen penguji yang telah
meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan masukan untuk skripsi ini
6. Bapak Yohanes Dwi Atmaka, M. Si., selaku dosen penguji yang telah meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan masukan untuk skripsi ini.
7. Mas Wagiran, Mas Sarwanto, Mas Sigit dan Mas Andre serta semua laboran yang telah membantu selama penelitian.
8. Sahabat-sahabatku Wira, Puri, Meita, Fretty, Santi, Vero, Hen, Arya, Ciput, Yuni, Kristin. Terima kasih untuk setiap masukan, semangat, kesedihan, keceriaan yang selalu kalian bagikan denganku.
9. Teman-temanku Leni, Nana, Via, Rendeng, Alin, kelas C kelompok E dan F angkatan 2002. Terima kasih buat tahun-tahun yang indah.
10. Teman-teman seperjuangan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia
Sinta, Ayu, Prima, Didit. Terima kasih untuk semua bantuan dan kerjasama selama pengerjaan skripsi.
11. Teman-teman KKNku, Ntry, Kak Ima, Mamas, Lena, Dwi, Andre, Mas Eka.
12. Dan semua pihak yang telah banyak membantu dalam penyusunan skripsi
ini.
Akhirnya, penulis menyadari bahwa tidak ada yang sempurna di dunia ini. Demikian pula dengan skripsi ini yang jauh dari sempurna karena keterbatasan pikiran, waktu dan tenaga. Oleh karena itu, dengan hati terbuka
penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi kemajuan dan kesempurnaan dalam penulisan skripsi ini. Semoga Tuhan Yang Maha Esa melimpahkan berkat dan kasih-Nya kepada semua pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
Yogyakarta, Februari 2007 Penulis
Christina Alfi
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL………... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……….. ii
HALAMAN PENGESAHAN………. iii
HALAMAN PERSEMBAHAN……….. iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……….. v
INTISARI……… vi
ABSTRACT……….. vii
KATA PENGANTAR………. viii
DAFTAR ISI………... xi
DAFTAR TABEL………... xiv
DAFTAR GAMBAR……….. xv
DAFTAR LAMPIRAN………... xvi
BAB I. PENGANTAR………... 1
A. Latar belakang……… 1
1. Permasalahan……….. 2
2. Keaslian Penelitian………. 3
3. Manfaat Penelitian……….. 3
B. Tujuan Penelitian………... 3
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA………. 4
A. Kemlaka (Phyllanthus emblica L.)……… 4
1. Keterangan Botani……….. 4
2. Deskripsi Tanaman………. 4
3. Kandungan Kimia………... 5
4. Kegunaan……… 6
B. Tanin……….. 6
C. Penyarian………... 7
D. Staphylococcus aureus………... 8
E. Ampisilin………... 10
F. Metode Pengujian Potensi Antibakteri……….. 10
1. Metode Difusi………. 11
2. Metode Dilusi………. 12
G. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)………... 13
H. Landasan Teori……….. 14
I. Hipotesis……… 15
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN………... 16
A. Jenis dan Rancangan Penelitian………. 16
B. Variabel dan Definisi Operasional………. 16
1. Variabel Penelitian………. 16
2. Definisi Operasional………... 17
C. Bahan dan Alat Penelitian………. 18
1. Bahan ………... 18
2. Alat………..………... 18
D. Tata Cara Penelitian………... 19
1. Determinasi Tumbuhan……….. 19
2. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan………... 19
3. Pembuatan Serbuk……… 19
4. Penyiapan Bahan Uji………. 19
5. Pengujian Potensi Antibakteri………... 21
6. Pengukuran Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka dengan Metode Dilusi…………... 22
7. Identifikasi Kualitatif Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)……… 23
8. Analisis Hasil……… 23
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN………... 25
A. Determinasi Tanaman……….. 25
B. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan………. 25
C. Pengujian Potensi Antibakteri Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Terhadap S. aureus dengan Metode Paperdisk……… 27
D. Penentuan KHM dan KBM Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka terhadap S. aureus dengan Metode Dilusi Padat………... 29
E. Identifikasi Kualitatif Infus dan Ekstrak Etanol buah Kemlaka dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)……… 32
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN……… 37
A. Kesimpulan……….. 37
B. Saran………. 37
DAFTAR PUSTAKA……… 38
LAMPIRAN………... 40
BIOGRAFI PENULIS………... 54
DAFTAR TABEL
Tabel I Pembuatan variasi konsentrasi larutan uji………... 20 Tabel II Rerata Diameter Zona Hambat Infus Buah Kemlaka
Terhadap S. aureus………. 28 Tabel III Rerata Diameter Zona Hambat Ekstrak Etanol Buah
Kemlaka Terhadap S. aureus………... 28 Tabel IV Hasil Pengamatan Penentuan KHM dan KBM Infus
terhadap Pertumbuhan S. aureus dengan menggunakan Metode Dilusi Padat………... 30 Tabel V Hasil Pengamatan Penentuan KHM dan KBM Ekstrak
Etanol terhadap Pertumbuhan S. aureus dengan
menggunakan Metode Dilusi Padat……….….. 30 Table VI Hasil Identifikasi Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka
Dengan Metode KLT………... 35
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Skema Tata Cara Penelitian………... 24 Gambar 2. Profil Kromatografi Infus dan Ekstrak Etanol Buah
Kemlaka dengan Deteksi Warna FeCl3………... 36
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman Kemlaka (P. emblica L.)…… 40 Lampiran 2. Tanaman Kemlaka (P. emblica L.)……….. 41 Lampiran 3. Buah Kemlaka (P. emblica L.)………. 42 Lampiran 4. Foto Hasil Uji Potensi Antibakteri Infus Buah Kemlaka
Terhadap S. aureus dengan Metode Difusi Paper Disk….... 43 Lampiran 5. Foto Hasil Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Buah
Kemlaka Terhadap S. aureus dengan Metode Difusi Paper Disk……… 44 Lampiran 6. Foto Hasil Uji Penetapan Kadar Hambat Minimal (KHM)
dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) Infus Buah Kemlaka Terhadap S. aureus Dengan Metode Dilusi Padat………... 45 Lampiran 7. Foto Hasil Uji Penetapan Kadar Hambat Minimal (KHM)
dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Terhadap S. aureus Dengan Metode Dilusi Padat………... 46 Lampiran 8. Foto Hasil Uji Penegasan Penetapan Kadar Hambat
Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) Infus Buah Kemlaka Terhadap S. aureus Dengan Metode Streak Plate………... 47 Lampiran 9. Foto Hasil Uji Penegasan Penetapan Kadar Hambat
Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM)
Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Terhadap S. aureus Dengan Metode Streak Plate………... 48 Lampiran 10. Hasil KLT Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Dengan
Deteksi UV 254 nm……… 49 Lampiran 11. Hasil KLT Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Dengan
Deteksi UV 365 nm……… 50 Lampiran 12. Hasil KLT Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Dengan
Deteksi FeCl3………... 51
Lampiran 13. Hasil Uji Statistik Diameter Zona Hambat Infus Terhadap S. aureus………..………... 52
Lampiran 14. Hasil Uji Statistik Diameter Zona Hambat Ekstrak Etanol Terhadap S. aureus………..…………... 53
BAB I PENGANTAR
A. Latar belakang
Saat ini pengobatan tradisional merupakan salah satu pilihan masyarakat dalam mengatasi permasalahan kesehatan maupun masalah penyakit, seperti penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri. Pada umumnya bakteri menginfeksi manusia melalui makanan sehingga mengganggu proses pencernaan makanan. Pengobatan tradisional menggunakan tanaman obat biasa menjadi pilihan masyarakat dalam mengatasi masalah kesehatan yang dialami.
Kemlaka (Phyllanthus emblica L.) tersebar luas di Asia. Kemlaka di India dipercaya sebagai salah satu tanaman yang sangat bermanfaat karena buahnya dianggap sakral, bergizi, dan berkhasiat untuk menyembuhkan penyakit. Buah kemlaka merupakan salah satu mycrobalans yang dikenal dengan baik sebagai astringent dan sebagai zat penyamak (Anonim, 2003).
Kemlaka digunakan sebagai obat untuk gangguan pencernaan. Selain itu, kemlaka secara tradisional dapat dengan cepat digunakan untuk mengatasi gangguan vitiligo, tumor abdominal, asam lambung, pembengkaan akibat jatuh (edema), demam, sakit kepala, batuk, penyakit cacingan,anemia, epistasis, diare, dan masih banyak lagi kegunaan yang lainnya (Anonim, 2003).
Salah satu kandungan utama dalam buah kemlaka adalah tanin. Adanya porsi tanin yang besar pada buah dapat menjelaskan beberapa manfaat dari buah kemlaka contohnya pengobatan pada gangguan intestinal seperti diare (Anonim,
2
2003). Tanin juga berfungsi sebagai anthelmintik, anti HIV, antibakteri, antikanker, dan anti karsinogenik (Duke, 1992 ).
Gangguan pencernaan sebagian besar disebabkan oleh patogenesis bakteri. Bakteri penyebab gangguan pencernaan ini diantaranya adalah Staphylococcus aureus. S. aureus adalah bakteri patogen gram positif, berbentuk bulat biasanya
tersusun dalam bentuk kluster yang tidak teratur seperti anggur (Jawetz dkk, 2001).
Dalam penelitian ini, untuk dapat memberikan kajian ilmiah simplisia buah kemlaka sebagai antibakteri maka digunakan bentuk sediaan infus dan ekstrak etanol. Digunakan infus karena menyesuaikan dengan penggunaan selama ini di masyarakat sebagai obat diare dalam bentuk infus. Sedangkan diujikan pula ekstrak etanol dengan harapan dapat menyari tanin yang diduga sebagai senyawa antibakteri dalam buah kemlaka.
Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian potensi antibakteri infus dan ekstrak etanol buah kemlaka terhadap S. aureus yang yang ditunjukkan dengan diameter zona hambat, Kadar Hambat Minimal (KHM), dan Kadar Bunuh Minimal (KBM).
1. Permasalahan
Permasalahan dalam penelitian ini adalah :
a. Apakah infus dan ekstrak etanol buah kemlaka mempunyai potensi
antibakteri terhadap bakteri S.aureus?
3
c. Kandungan kimia apa yang ada dalam buah kemlaka yang diduga aktif sebagai antibakteri?
2. Keaslian penelitian
Sejauh ini dari penelusuran pustaka dan jurnal yang diperoleh, belum pernah dilakukan uji antibakteri infusa dan ekstrak etanol buah kemlaka terhadap bakteri S. aureus.
3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis
Hasil penelitian diharapkan dapat memberi informasi tentang potensi antibakteri infus dan ekstrak etanol buah kemlaka dan kandungan senyawa dalam buah kemlaka yang berkhasiat antibakteri.
b. Manfaat praktis
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi alternatif penggunaan buah kemlaka sebagai obat yang berkhasiat antibakteri.
B. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka tujuan dari penelitian ini adalah untuk :
1. mengetahui potensi antibakteri infus dan ekstrak etanol buah kemlaka
terhadap bakteri S. aureus.
2. mengetahui Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal
(KBM) infus dan ekstrak etanol buah kemlaka terhadap S. aureus
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kemlaka (Phyllanthus emblica L.) 1. Keterangan botani
Kemlaka merupakan tanaman yang termasuk dalam familia Euphorbiaceae, dengan genus Phyllanthus L., dan mempunyai nama spesies Phyllanthus emblica L. (Anonim, 2005).
Di beberapa negara, kemlaka dikenal dengan nama yang beraneka ragam, antara lain: emblic mycrobalan (English), Malacca tree (English), Indian gooseberry (English), Melaka, Asam melaka, Amlaka (Malaya),
Ma-Kham-Pom (Thailand), Mak-Kham-pom (Laos), Kam Lam atau Kam Lam Ko
(Kamboja), Bang ngot (Vietnam selatan), Chu me (Vietnam utara), Neli (Philipina) (Anonim, 1987). Kemlaka, malaka, balangka, karsinta (Indonesia) (Anonim, 2000b).
2. Deskripsi tanaman
Kemlaka adalah tanaman yang hidup liar di hutan, ladang, dan tempat-tempat lain yang memiliki hawa panas (Anonim, 2000b). Tumbuh tersebar di Asia Tenggara dan negara-negara lainnya terutama di daerah India. Di Jawa umumnya terdapat hingga pada ketinggian ± 1200 m di atas permukaan laut, terutama di dalam semak-semak rumput (Heyne, 1987).
Kemlaka merupakan jenis pohon meranggas atau tanaman yang menggugurkan daunnya pada musim kemarau. Tumbuhan ini pertumbuhannya
5
sangat lambat dan tingginya 10-19 m dengan batang berwarna abu-abu yang besarnya 15-28 cm (Heyne, 1987). Daun berwarna hijau, letaknya berseling, bentuk daun sederhana, utuh dan menyirip, ujung daun tumpul, lonjong, 12-20 x 2-5 mm (Anonim, 2000a). Bunganya kecil, berwarna kuning kehijau-hijauan, berbunga selama bulan Oktober (Anonim, 1989), bunga tidak sempurna, uniseksual atau biseksual, berumah satu, tumbuh di ketiak (Anonim, 2000a), biasanya bunga jantan tumbuh di bagian pangkal ranting dengan bunga betina di atasnya (Anonim, 1987), memiliki enam buah kelopak bunga tetapi tidak memiliki daun mahkota, bunga bersari dengan tiga benang sari, memiliki dua kepala putik dan bakal buah yang berada di bagian atas, memiliki tiga daun buah (Anonim, 2000a).
Buahnya berdaging, bulat kecil dengan diameter 1,5-2 cm, berwarna hijau muda, licin atau halus, dan dapat dimakan (Anonim, 2000a). Buah rasanya sepat, asam-asam, dan pahit (Anonim, 2000b). Bijinya kecil dan berwarna coklat muda. (Anonim, 2000a), kurang lebih ada enam biji yang terkandung dalam masing-masing buah. (Anonim, 1987).
3. Kandungan kimia
6
magnesium, potassium, sodium, seng, besi), protein, lemak, residual moisture (Anonim, 2003)
4. Kegunaan
Kegunaan dari tanaman ini, antara lain: buahnya dapat dimakan, untuk memberikan makanan yang bergizi, menjaga efek penuaan dibandingkan obat-obat yang lain, meredakan beberapa penyakit ringan, memberi peningkatan pada daya intelegensi dan perasaan. Kemlaka juga dapat dengan cepat mengatasi vitiligo, tumor abdominal, asam lambung, pembengkaan (edema), pucat, demam kronik, sakit di dada, sakit kepala, diare, batuk, gonorrhea, epistasis, sebagai ekspektoran, cacingan, anemia, asma, memperlancar aliran darah, menurunkan kadar gula dalam darah dan kolesterol (Anonim, 2003 ).
B. Tanin
Tanin dinamakan juga asam tanat atau asam galotanat, ada yang tidak berwarna tetapi ada juga yang berwarna kuning atau coklat. Tanin terdiri dari sembilan molekul asam galat dan molekul glukosa (Harborne, 1987).
7
non polar seperti benzen dan kloroform. Larutan tanin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan asam mineral atau garam (Robinson, 1991).
Beberapa tanin terbukti mempunyai aktivitas antioksidan, menghambat pertumbuhan tumor, tanin lainnya juga dapat meracuni hati (Robinson, 1991). Tanin juga berfungsi sebagai anthelmintik, anti HIV, antibakteri, antikanker, dan anti karsinogenik (Duke, 1992 ).
B. Penyarian
Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dalam pelarut cair. Simplisia yang disari mengandung zat aktif yang dapat larut dan zat aktif yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-lain. Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim, 1986).
Penyarian serbuk simplisia dilakukan dengan secara berturut-turut menggunakan pelarut penyari berbeda-beda polaritasnya, umumnya dari yang nonpolar hingga yang polar. Masing-masing pelarut secara selektif akan memisahkan senyawa-senyawa dalam simplisia (Sudjadi, 1981).
1. Infusa
8
sambil sekali-kali diaduk. Infus diserkai selagi panas melalui kain flanel. Untuk mencukupi kekurangan air, ditambahkan air panas secukupnya melalui ampas sampai diperoleh volume yang dikehendaki (Anonim, 1986).
2. Perkolasi
Adalah penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas kebawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh gaya beratnya sendiri dan cairan diatasnya, dikurangi gaya kapiler yang cenderung untuk menahan (Anonim, 1986).
Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan Zat aktif yang keluar dari perkolator disebut sari atau perkolat, sedangkan sisa setelah dilakukannya penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).
C. Staphylococcus aureus
S. aureus termasuk dalam familia Microccaceae, yaitu sel gram positif
9
bervariasi dari putih sampai kuning tua. Bakteri ini tumbuh paling cepat pada suhu 37oC, tapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar (20oC-25oC). S aureus merupakan bakteri anaerob fakultatif yang bersifat patogen dengan
memfermentasi manitol dan laktosa, bersifat proteolitik, memproduksi koagulase pigmen warna kuning emas, lipase, bersifat haemolitik dan tumbuh pada media yang mengadung NaCl 0,9%. S. aureus biasanya ditemukan pada kulit dan membran serta dapat menimbulkan penyakit tertentu. Bakteri ini dapat menyebabkan terjadinya bisul, borok, serta nanah pada luka, tetapi peka terhadap antibiotik golongan beta laktam serta peka terhadap fenol dan devirat fenol lainnya (Jawetz dkk, 2001).
S. aureus merupakan salah satu mikroorganisme yang menyebabkan
10
E. Ampisilin
Ampisilin merupakan suatu antibiotik golongan beta laktam derivat penisilin semisintetik dengan spektrum luas. Ampisilin memiliki aktivitas bakterisid terhadap bakteri Gram (+) maupun bakteri Gram (-) dengan mekanisme menghambat pembentukan dinding sel, bila sel tumbuh dan plasmanya bertambah atau menyerap air dengan cara osmosis, maka dinding sel bakteri yang tidak sempurna itu akan pecah dan bakteri akan mati.
Penisilin dan derivat penisilin lainnya tidak dapat dikombinasikan dengan bakteriostatik lain seperti kloramfenikol dan eritromisin kecuali sulfonamid. Khasiat Ampisilin terhadap bakteri Gram (+) lebih ringan dibanding penisilin yang memiliki spektrum sempit.
Efek samping yang sering ditimbulkan antara lain alergi kulit (kemerah-merahan) dan diare yang kemungkinannya disebabkan oleh absorbsinya yang kurang baik (Tan & Rahardja, 1991).
F. Metode Pengujian Potensi Antibakteri
Antibakteri adalah obat pembasmi bakteri, khususnya bakteri yang merugikan manusia. Obat yang digunakan untuk membasmi bakteri penyebab infeksi pada manusia harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin. Artinya obat tersebut harus bersifat sangat toksik untuk bakteri, tetapi relatif tidak toksik untuk hospes (Anonim, 1995).
11
membunuh bakteri (bacteriocide). Kadar minimal yang diperlukan untukl menghambat pertumbuhan bakteri atau membunuhnya, masing-masing dikenal sebagai Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM). Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bacteriostatic menjadi bacteriocide bila kadar antibakterinya ditingkatkan (Anonim, 1995).
1. Metode Difusi
Prinsip metode difusi adalah pengukuran potensi antimikroba berdasarkan pengamatan luas daerah hambatan mikroba karena berdifusinya obat dari titik awal pemberian ke daerah difusi (Jawetz dkk, 1996).
Metode difusi meliputi : a. Cara Kirby Bouwer
Cara ini dilakukan dengan cara memulaskan suspensi mikroba dengan konsentrasi tertentu umumnya 106 Colony Forming Unit (CFU)/ml pada permukaan media hingga merata. Kertas disk yang mengandung antibiotik diletakkan di atas media lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam, setelah itu dibaca hasilnya. Potensi antimikroba ditentukan dengan mengukur diameter zona hambatan yang terbentuk (Hugo & Russel, 1987).
b. Cara sumuran
12
c. Cara Pour Plate
Metode ini dilakukan dengan cara mencampurkan suspensi bakteri dengan agar base pada suhu 50oC dicampur sampai homogen, kemudian dituang di atas media Muller Hinton Agar (MHA) dan dibiarkan membeku. Disk antibiotic diletakkan di atasnya, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Hasilnya dibaca seperti Kirby Bouwer. 2. Metode Dilusi
Prinsipnya adalah larutan uji diencerkan hingga diperoleh beberapa konsentrasi, kemudian masing-masing konsentrasi larutan uji ditambahkan suspensi bakteri dalam media. Untuk dilusi padat, tiap konsentrasi larutan uji dicampurkan ke dalam media agar. Setelah menjadi padat kemudian ditanami kuman (Hugo & Russel, 1987).
Prosedur uji dilusi digunakan untuk mencari Kadar Hambat Minimal (KHM) yaitu konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) yaitu konsentrasi terendah yang dapat membunuh mikroba (Anonim, 1993).
13
berupa media yang tidak tampak adanya pertumbuhan mikroba. Potensi antimikroba dapat ditentukan dengan melihat konsentrasi terendah yang dapat menghambat atau membunuh mikroba (Jawetz dkk, 1996).
G. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
KLT adalah metode pemisahan fitokimia. Lapisan yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal) setelah plat atau lapisan ditaruh di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (Stahl, 1985).
Pemisahan komponen-komponen yang ada dapat digunakan bermacam-macam pelarut dari polar sampai non polar, misal: air, methanol, etanol, aseton, etil asetat, dietil eter, kloroform atau beberapa campuran (Stahl, 1985). Silika gel paling banyak digunakan sebagai fase diam. Selain itu, yang dapat pula digunakan sebagai fase diam antara lain: aluminium oksida, cellite, selulosa, kalsium hidroksida, damar penukar ion, magnesium fosfat, poliamida dan campuran dua bahan di atas (Harbone, 1987).
14
awal. Harga Rf berkisar antara 0.00 dan 1.00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. Harga hRf adalah angka Rf dikalikan dengan faktor 100 (hundred), menghasilkan nilai berjangka 0 sampai 100 (Stahl, 1985).
H. LANDASAN TEORI
Kemlaka digunakan untuk obat gangguan pencernaan. Selain itu, kemlaka secara tradisional dapat dengan cepat digunakan untuk mengatasi diare, tumor abdominal, cacingan dan masih banyak lagi kegunaan lainnya (Anonim, 2003).
Salah satu kandungan utama dalam buah kemlaka adalah tanin. Adanya porsi tanin yang besar pada buah dapat menjelaskan beberapa manfaat dari buah kemlaka contohnya pengobatan pada gangguan intestinal seperti diare (Anonim, 2003). Tanin juga berfungsi sebagai antibakteri, anti kanker dan anti karsinogenik (Duke, 1992).
S. aureus merupakan salah satu mikroorganisme yang menyebabkan
15
I. HIPOTESIS
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan rancangan penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni sederhana dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas adalah variasi konsentrasi infus dan ekstrak etanol buah
kemlaka. Konsentrasi infus masing-masing: 10%; 15%; 20% dan konsentrasi ekstrak etanol masing-masing: 2,5 %; 5%; 7,5 %.
b. Variabel tergantung adalah diameter zona hambat pertumbuhan S. aureus. c. Variabel pengacau terkendali adalah : media penanaman bakteri, suhu
inkubasi 37o C dan lama inkubasi 24 jam, suspensi bakteri 0,5 ml, suhu pengeringan oven 50o C, diameter paper disk 5 mm, volume infus dan ekstra etanol yang dijenuhkan ke paper disk sebanyak 20 µl , kepadatan suspensi bakteri uji setara dengan larutan standar Mc Farland II ( 6.108 CFU/ml )
d. Variabel pengacau tak terkendali adalah: umur tanaman ± 30 tahun, umur buah kemlaka ± 3 bulan, ukuran buah kemlaka.
17
1. Definisi operasional
a. Buah kemlaka adalah daging buah yang diambil dari tanaman kemlaka
berumur ± 30 th, diambil dari Ngalian, Sandiroto, Temanggung.
b. Biakan murni S. aureus diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Kedokteran Universitas Gajah Mada Yogyakarta.
c. Zona hambat adalah zona jernih yang tidak dijumpai pertumbuhan bakteri uji S. aureus dan zona yang masih terdapat bakteri uji S. aureus dalam jumlah sedikit di sekitar paper disk jika dilihat dengan mata telanjang. d. Infusa adalah cara penyarian simplisia buah kemlaka dengan air pada
suhu 90o C selama 15 menit.
e. Ekstrak etanol buah adalah hasil penyaringan simplisia serbuk daging buah kemlaka dengan perkolasi menggunakan cairan penyari etanol. f. Metode dilusi adalah metode pengukuran aktivitas antibakteri dengan
cara mengencerkan infus dan ekstrak etanol buah kemlaka pada beberapa konsentrasi untuk menentukan KHM dan KBM infus dan ekstrak etanol g. KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) adalah konsentrasi minimum infus
18
C. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan
a. Buah kemlaka dengan umur ± 3 bulan yang diambil dari Ngaliyan, Sandiroto, Temanggung.
b. Biakan murni bakteri S. aureus ATCC 25923 yang diperoleh dari
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada Yogyakarta.
c. Media Nutrien Agar (NA) dan Nutrien Broth (NB) (Oxioid), etanol 96 %, paper disk 5 mm, aquadest steril, kertas saring, TLC silica gel Gf 254
(Merek), etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100:11:11:27) sebagai fase gerak, pereaksi FeCl3, larutan standar Mc Farland II (6.108
CFU/ml), kontrol positif sirup kering Ampisilin 2,5%, kontrol negatif DMSO dan aquadest, pembanding asam tanat 2,5 %.
2. Alat
Alat gelas: Erlenmeyer, pipet volume, beaker glass, cawan petri, flakon, tabung reaksi (IWAKI / Pyrex), Laminar Air Flow (Inches W.C.), Rotary evaporator (Janke & Kunkel, Ika-labotehnik, RV05-ST), inkubator
(Memmert, tipe BE 400, GmbH+CoKG-D91126, Swahaban FGR, Germany), autoklaf (Model KT-40, ALP co.Ltd. Hamurashi Tokyo, Japan), kompor listrik (Maspion SH-31), neraca analitik (Mettler PC 2000), oven (Memmert, Germany), lampu UV, penyemprot reagen tampak (FeCl3), alumunium foil,
19
D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tumbuhan
Determinasi bagian tanaman kemlaka dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dengan mendeterminasi bagian tanaman yaitu daun, ranting, bunga dan buahnya menggunakan pustaka Flora of Java (Backer & Van den Brink, 1963; 1985).
2. Pengumpulan dan pengeringan bahan
Tanaman didapatkan dari Ngaliyan, Sandiroto, Temanggung dengan umur tanaman ± 30 tahun. Daging buah diambil dari buah kemlaka dengan umur ± 3 bulan diperoleh dengan melepaskan dari bijinya dengan cara mengelupasnya. Kemudian daging buah yang didapat dikeringkan sampai kering (dapat dipatahkan) dalam oven pada suhu 500 C selama ± 48 jam
3. Pembuatan serbuk
Simplisia daging buah kemlaka selanjutnya dibuat menjadi serbuk dengan cara dihaluskan dengan menggunakan blender, kemudian diayak.
4. Penyiapan bahan uji a. Pembuatan infus
20
dengan kadar 10g/100ml, 15g/100ml dan 20g/100ml dilakukan dengan mengencerkan dari infus kadar 40g/100ml, sampai kadar yang diinginkan dalam volume 10 ml. Infus dibuat baru menjelang proses pengujian.
Tabel I . Pembuatan Variasi Konsentrasi Larutan Uji Konsentrasi larutan uji
(%)
Volume yang diambil dari infus 40% (ml)
10 2,5 15 3,75 20 5 b. Pembuatan ekstrak etanol
21
5. Pengujian potensi antibakteri
a. Pembuatan suspensi bakteri uji S. aureus
Satu ose biakan murni bakteri uji diinokulasikan pada 5 ml nutrient broth steril, divortex, kemudian diinkubasi 24 jam. Suspensi bakteri
ditambahkan aquades steril untuk menyetarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml).
b. Pembiakan suspensi S. aureus secara pour plate dan pengujian potensi
antibakteri.
Suspensi bakteri uji sebanyak 1 ml diinokulasikan kedalam 20 ml nutrient agar dalam petri steril, kemudian digoyang supaya homogen. Setelah
media yang berisi suspensi bakteri uji memadat, diinokulasikan paper disk yang telah dijenuhkan dangan infus dangan konsentrasi 10, 15, dan 20 % b/v
dan ekstrak etanol buah kemlaka dengan konsentrasi 2,5; 5; dan 7,5% b/v
masing-masing 20µl. Paper disk yang lain dijenuhkan dengan 20µl Ampisilin 2,5% sebagai kontrol positif dan 20µl DMSO, 20 µl aquadest sebagai kontrol negatif. Kemudian inkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC.
22
6. Pengukuran Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka dengan Metode Dilusi Padat
Pada pengujian potensi antibakteri infus dan ekstrak etanol buah kemlaka dengan metode difusi secara paper disk, diperoleh konsentrasi terkecil yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji. Untuk mengetahui KHM dan KBM, maka ditetapkan rentang konsentrasi yang lebih kecil dari pada konsentrasi terendah sebanyak 4 variasi konsentrasi untuk mengetahui Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) dari infus dan ekstrak etanol buah kemlaka. Variasi Konsentrasi yang dibuat untuk infus adalah 2; 4; 6; 8 %, sedangkan untuk ekstrak etanol adalah 0,5; 1,0; 1,5; 2%.
Mula-mula uji dilakukan dengan membuat suspensi bakteri uji yang disetarakan dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml). Lalu dari suspensi tersebut diambil 0,5 ml, ditambah dengan larutan uji sebanyak 0,5 ml dengan kadar tertentu yang telah ditetapkan dan dicampur dengan 20 ml Nutrient Agar cair dan dituang dalam petri, selanjutnya digoyang sampai
23
yang masih menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri, sedangkan Kadar Bunuh Minimal (KBM) ditentukan dari konsentrasi pada media pertumbuhan bakteri sudah tidak tampak lagi adanya pertumbuhan bakteri. Penegasan dari hasil yang diperoleh dilakukan secara streak plate.
7. Identifikasi Kualitatif Infus dan Ektrak Etanol Buah Kemlaka dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Proses pemisahan dilakukan dengan menotolkan infus buah kemlaka dengan konsentrasi 12% dan ekstrak etanol buah kemlaka dengan konsentrasi 2,5% menggunakan pipa kapiler pada lempeng kromatografi lapis tipis (KLT).
Uji Kromatografi lapis tipis infus dan ekstrak etanol buah kemlaka dengan menggunakan fase diam Silica gel GF 254, fase gerak etil asetat, asam formiat, asam asetat, air (100:11:11:27) dan standar pembanding asam tanat 2,5%. Senyawa dielusi sampai batas yang ditentukan yaitu 10 cm. Pengamatan dilakukan pada UV 254 nm, UV 365 nm dan reagen semprot FeCl3.
Selanjutnya dihitung harga Rf dan diamati warna bercak yang dihasilkan. 8. Analisa hasil
24
Identifikasi tanaman kemlaka
Pengumpulan dan pengeringan bahan
Penyiapan bahan uji
-Konsentrasi infus: 10; 15; 20%
-Konsentrasi ekstrak etanol: 2,5; 5; 7,5%
Pengujian potensi antibakteri dengan metode paper disk
-Kontrol positif: Ampisilin
-Kontrol negatif: DMSO dan Aquadest -Konsentrasi infus: 10; 15; 20%
-Konsentrasi ekstrak etanol: 2,5; 5; 7,5%
Penentuan KHM dan KBM dengan Metode Dilusi Padat
Identifikasi kualitatif infus dan ekstrak etanol dengan metode KLT
-Fase diam : Silika Gel GF 254
-Fase gerak : Etil asetat : Asam formiat : asam asetat : air (100 : 11 : 11 : 27)
-Pereaksi semprot : FeCl3
Analisis hasil
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi
Universitas Sanata Dharma. Dari hasil determinasi tersebut, tanaman kemlaka
yang digunakan dalam penelitian ini diketahui memiliki nama ilmiah Phyllanthus
emblica L. (lampiran 1).
B. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan
Buah kemlaka yang diperoleh kemudian dicuci dengan air mengalir,
dimaksudkan untuk menghilangkan debu dan kotoran yang menempel pada
permukaan buah, selanjutnya diangin-anginkan. Kemudian buah diambil daging
buahnya lalu dirajang dengan maksud untuk memperkecil ukuran daging buah,
sehingga mudah ditangani dalam proses berikutnya. Langkah selanjutnya adalah
pengeringan bahan yang dilakukan untuk mengurangi kadar air. Air merupakan
media yang baik untuk pertumbuhan mikroba, dengan demikian pengeringan
dapat mencegah terjadinya pembusukan dan bahan yang akan digunakan lebih
awet.
Pengeringan dilakukan dengan menggunakan oven karena suhu dan aliran
udaranya dapat dikontrol. Suhu pengeringan adalah 500C, karena pengeringan
bahan yang mengandung tanin harus lebih besar dari 400C untuk menghindari
oksidasi dari enzim-enzim yang masih aktif, dan harus lebih kecil dari 600C
26
untuk menghindari kerusakan karena terlalu panas dan polimerisasi (Anonim,
1996). Pengeringan dilakukan selama ± 48 jam sampai benar-benar kering (dapat
dipatahkan) supaya dapat diblender menjadi serbuk. Pembuatan serbuk dengan
menggunakan blender dengan maksud untuk memperkecil ukuran partikel bahan
dan memperbesar luas permukaan bahan agar mudah terbasahi oleh penyari.
Setelah menjadi diserbuk, bahan kemudian diayak dengan tujuan untuk
memperoleh derajat halus yang diinginkan, sehingga akan mempermudah dalam
proses perkolasi. Ayakan yang digunakan adalah ayakan dengan nomor mesh
12/50. Derajat halus serbuk buah kemlaka mengikuti derajat halus umum serbuk
simplisia yaitu 4/18. Derajat halus suatu serbuk dinyatakan dengan nomor
pengayak, sedangkan dalam penelitian ini pengayak yang digunakan dalam
bentuk nomor mesh. Nomor mesh menunjukkan jumlah lubang tiap 2,54 cm,
sedangkan nomor pengayak menunjukkan jumlah lubang tiap 1 cm dihitung
searah dengan panjang kawat, oleh karena itu derajat halus simplisia 4/18
dikonversikan ke nomor mesh dengan mengalikan 2,54 cm, sehingga hasilnya
yaitu 10/45. Tapi karena keterbatasan alat yang ada di laboratorium maka
digunakan ayakan dengan nomor mesh 12/50. Penyarian akan bertambah baik bila
permukaan serbuk yang bersentuhan dengan cairan penyari semakin luas. Dengan
demikian, semakin halus serbuk seharusnya semakin baik penyariannya (Anonim,
1986). Tapi jika serbuk terlalu halus penyarian akan terganggu, oleh karena itu
27
C. Pengujian Potensi Antibakteri Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka terhadap S. aureus dengan Metode Paper Disk
Pengujian potensi antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode
paper disk. Paper disk yang digunakan memiliki diameter 5 mm. Konsentrasi
infus yang digunakan 10; 15; 20%, sedangkan konsentrasi ekstrak etanol yang
digunakan 2,5; 5; 7,5%. Kontrol negatif yang digunakan adalah DMSO yang
digunakan sebagai pelarut ekstrak etanol dan aquadest yang digunakan sebagai
pelarut infus. Kontrol positif digunakan Ampisilin 2,5%. Ampisilin dipilih
sebagai kontrol positif karena S. aureus peka terhadap antibiotik ini. Ampisilin
memiliki aktivitas bakterisid terhadap bakteri Gram positif (+) maupun bakteri
Gram negatif (-) dengan mekanisme menghambat pembentukan dinding sel.
Volume bahan uji yang dijenuhkan dalam paper disk untuk tiap perlakuan adalah
sama yaitu 20µl. Setelah inkubasi selama 24 jam, diperoleh zona jernih disekitar
paper disk yang menunjukkan adanya penghambatan terhadap petumbuhan
bakteri uji S. aureus.
Metode difusi dipilih karena metode ini sederhana dan praktis dengan
prinsip senyawa uji ditempatkan dalam media padat yang telah diinokulasikan
bakteri uji. Pada penelitian ini dipilih metode difusi secara paper disk dengan
pertimbangan senyawa uji yang digunakan tidak cepat menguap sehingga pada
saat diangin-anginkan setelah pemberian larutan uji pada paper disk, senyawa
tidak akan habis. Senyawa uji akan berdifusi ke dalam media dan menghambat
pertumbuhan bakteri uji atau mematikannya, selain itu senyawa uji mempunyai
28
menyentuh permukaan agar, air akan diabsorbsi melewati filter paper dan
senyawa uji akan berdifusi ke dalam media disekitar paper disk.
Hasil uji antibakteri infus dan ekstrak etanol buah kemlaka terhadap S.
aureus pada Tabel II dan III serta lampiran 4 dan 5.
Tabel II. Rerata Diameter Zona Hambat Infus Buah Kemlaka Terhadap S.Aureus
Konsentrasi ( % ) Diameter Zona Hambat (cm)
( x ± SD)
Kontrol negatif 0 ± 0
10 0,96 ± 0,0082
15 1,01 ± 0,0096
20 1,11 ± 0,0096
Kontrol positif 3,50 ± 0,0050
Tabel III. Rerata Diameter Zona Hambat Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Terhadap S.Aureus
Konsentrasi ( % ) Diameter Zona Hambat (cm)
( x ± SD)
Kontrol negatif 0 ± 0
2,5 1,11 ± 0,0126
5,0 1,18 ± 0,0126
7,5 1,49 ± 0,0096
Kontrol positif 3,50 ± 0,0050
Senyawa yang terdapat dalam buah kemlaka antara lain adalah tanin yang
diduga aktif sebagai antibakteri. Tanin merupakan komponen oligomerik dengan
unit multi struktur yang mempunyai gugus fenolik bebas (Anonim, 1996).
Menurut Harbone (1987), senyawa-senyawa dengan gugus OH fenolik dapat
merusak membran sel dengan membentuk kompleks protein melalui ikatan
hidrogen.
Sifat polaritas suatu zat antibakteri dan sifat kepolaran dinding sel bakteri
mempengaruhi aktivitas suatu zat antibakteri dalam menghambat pertumbuhan
bakteri. S. aureus merupakan bakteri Gram (+) yang sifatnya polar sehingga
29
Senyawa-senyawa yang terdapat dalam infus dan ekstrak etanol bersifat polar
karena dari penelitian diperoleh bahwa semakin besar konsentrasi zat uji, diameter
hambatan yang terbentuk makin lebar menunjukkan zat yang terdifusi ke dalam
media (yang sebagian besar kandungannya air) makin besar, sehingga didapat
bahwa makin tinggi konsentrasi zat uji, makin besar daya antibakteri. Selain itu, S.
aureus memiliki dinding sel dengan kadar lemak yang rendah, sehingga mudah
ditembus oleh senyawa-senyawa polar.
Dari diameter zona hambat yang diperoleh, kemudian dianalisis
menggunakan uji t (t-test). Uji ini dilakukan untuk mengevaluasi potensi
antibakteri infus dan ekstrak etanol buah kemlaka dibandingkan dengan kontrol
negatif dengan cara membandingkan nilai uji t hitung dengan t tabel. Apabila t
hitung ≥ t tabel, berarti konsentrasi terkecil infus maupun ekstrak etanol buah
kemlaka memiliki potensi antibakteri terhadap S. aureus.
Dari uji t didapatkan harga t hitung untuk infus 253,151 dan untuk ekstrak
etanol 176,030; sedangkan harga t tabel untuk infus dan ekstrak etanol adalah
sama yaitu 2,447. Hal ini menunjukkan bahwa t hitung ≥ t tabel, yang berarti
konsentrasi terkecil infus maupun ekstrak etanol buah kemlaka memiliki potensi
antibakteri terhadap S. aureus.
D. Penentuan KHM dan KBM Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka terhadap S. aureus dengan Metode Dilusi Padat
Penentuan KHM dan KBM infus dan ekstrak etanol buah kemlaka
30
konsentrasi terkecil dari infus dan ekstrak etanol buah kemlaka yang dapat
menghambat pertumbuhan dan membunuh bakteri uji. Penentuan KHM dan KBM
dilakukan dengan menggunakan metode dilusi padat dengan cara mengamati
tingkat kekeruhan media yang telah diinokulasikan suspensi bakteri dan larutan
uji dalam petri. Hasilnya kemudian dibandingkan dengan kontrol (-) dan kontrol
(+). Jika didapatkan pertumbuhan koloni bakteri lebih sedikit (ditandai dengan
kekeruhan media) dibandingkan dengan kontrol (-) berarti larutan uji
menunjukkan adanya potensi hambat terhadap pertumbuhan bakteri uji.
Sedangkan jika tidak ditemukan adanya pertumbuhan bakteri uji dan kekeruhan
media sama atau hampir sama dengan kontrol (+) berarti larutan uji memiliki
potensi membunuh bakteri. Penegasan hasil dari dilusi padat dilakukan dengan
metode streak plate untuk melihat ada tidaknya pertumbuhan bakteri dengan
goresan pada media. Hasil pengamatan Kadar Hambat Minimal (KHM) dan
Kadar Bunuh Minimal (KBM) infus dan ekstrak etanol buah kemlaka terhadap S.
aureus tertera pada Tabel IV dan V serta lampiran 6 dan 7.
Tabel IV. Hasil Pengamatan Penentuan KHM dan KBM Infusa terhadap Pertumbuhan S.Aureus dengan menggunakan Metode Dilusi Padat
Konsentrasi infus ( % ) Pengamatan pertumbuhan S. aureus
2 ++ 4 - 6 - 8 -
Tabel V. Hasil Pengamatan Penentuan KHM dan KBM Ekstrak Etanol terhadap Pertumbuhan S.Aureus dengan menggunakan Metode Dilusi Padat
Konsentrasi ekstrak etanol ( % ) Pengamatan pertumbuhan S. aureus
31
Keterangan : +++ = (Pertumbuhan koloni bakteri banyak)
++ = (Pertumbuhan koloni bakteri agak banyak)
+ = (Pertumbuhan koloni bakteri sedikit)
- = (Pertumbuhan koloni bakteri tidak terlihat)
Dari tabel IV dapat diketahui bahwa infus pada konsentrasi 2% masih
terdapat pertumbuhan bakteri, walau tidak sebanyak kontrol (-) yang ditunjukkan
dengan kekeruhan media (lampiran 6). Hal ini berarti infus buah kemlaka pada
konsentrasi 2% memiliki potensi antibakteri bila dibandingkan dengan kontrol (-).
Infus dengan konsentrasi 4% sudah tidak tampak adanya pertumbuhan bakteri
ditunjukkan dengan adanya media yang jernih (lampiran 6). Untuk mempertegas
hasil yang diperoleh, dilakukan uji penegasan menggunakan metode streak plate
dari hasil dilusi padat. Hasil yang diperoleh dari uji penegasan dengan metode
streak plate adalah pada konsentrasi 2% dan 4% masih terdapat pertumbuhan
bakteri uji, sedangkan pada konsentrasi 6% dan 8% sudah tidak ditemukan
pertumbuhan bakteri uji (lampiran 8). Dengan demikian dapat diambil kesimpulan
bahwa infus dengan konsentrasi 4% merupakan Kadar Hambat Minimal (KHM)
yang merupakan konsentrasi terendah dari infus yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri uji. Sedangkan infus dengan konsentrasi 6% merupakan
Kadar Bunuh Minimal (KBM) yang merupakan konsentrasi terendah infus yang
dapat membunuh bakteri uji.
Dari tabel V dapat diketahui bahwa ekstrak etanol pada konsentrasi 0,5
dan 1,0% masih terdapat pertumbuhan bakteri dan tidak sebanyak kontrol (-) yang
ditunjukkan dengan kekeruhan media (lampiran 7). Hal ini berarti ekstrak etanol
pada konsentrasi 0,5 dan 1,0% memiliki potensi antibakteri bila dibandingkan
32
tampak adanya pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan adanya media yang
jernih (lampiran 7). Untuk mempertegas hasil yang diperoleh, dilakukan uji
penegasan menggunakan metode streak plate dari hasil dilusi padat. Hasil yang
diperoleh dari uji penegasan dengan metode streak plate adalah pada konsentrasi
0,5; 1,0; dan 1,5% masih terdapat pertumbuhan bakteri uji, sedangkan pada
konsentrasi 2,0% sudah tidak ditemukan pertumbuhan bakteri uji. Dengan
demikian dapat diambil kesimpulan bahwa ekstrak etanol dengan konsentrasi
1,5% merupakan Kadar Hambat Minimal (KHM) yang merupakan konsentrasi
terendah dari ekstrak etanol yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji.
Sedangkan ekstrak etanol dengan konsentrasi 2,0% merupakan Kadar Bunuh
Minimal (KBM) yang merupakan konsentrasi terendah ekstrak etanol yang dapat
membunuh bakteri uji (lampiran 9).
E. Identifikasi Kualitatif Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pada penelitian ini dilakukan analisis kualitatif infus dan ekstrak etanol
buah kemlaka dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Analisis dengan KLT
mempunyai keuntungan yaitu waktu yang dibutuhkan singkat dan dapat
memberikan pemisahan yang baik. Sedangkan keuntungan lainnya adalah
penanganannya sederhana, cuplikan dan pelarut yang digunakan sedikit.
Pada analisis dengan KLT ini fase diam yang digunakan adalah Silika Gel
GF 254, karena Silika Gel GF 254 ini bersifat polar. Perbedaan kepolaran dari
33
dengan fase diam sehingga zat uji dapat terelusi dengan baik oleh fase gerak yang
sifatnya sama dengan zat uji. Senyawa tanin bersifat polar tapi tidak terlalu polar
yang ditunjukkan dengan tanin larut dalam pelarut organik polar hanya sampai
batas tertentu saja (Robinson, 1991). Oleh karena itu diharapkan senyawa tanin
akan terelusi oleh fase gerak yang kepolarannya lebih kecil dari fase diamnya.
Pemisahan bercak dipengaruhi oleh sifat kepolaran antara komponen senyawa
yang terkandung dalam sampel. Bila dalam sampel terdapat lebih dari satu
senyawa dengan tingkat kepolaran yang berbeda-beda, maka bercak yang muncul
pada plat kromatogram akan berbeda-beda juga.
Fase gerak yang digunakan adalah etil asetat : asam formiat : asam asetat :
air (100:11:11:27). Pembanding yang digunakan adalah asam tanat karena
kemungkinan senyawa yang mempunyai potensi antibakteri yang terdapat dalam
infus dan ekstrak etanol buah kemlaka adalah tanin.
Setelah penotolan dengan menggunakan pipa kapiler sebanyak 5 µl, plat
KLT kemudian dielusi dalam tabung yang telah jenuh oleh fase gerak. Penjenuhan
dilakukan dengan menempatkan kertas saring yang dibasahi oleh fase gerak pada
dinding tabung. Tujuan penjenuhan ini adalah agar perambatan dapat berlangsung
dengan optimal dan cepat. Elusi dilakukan hingga jarak rambat yang ditentukan
(10 cm), setelah itu diangin-anginkan supaya plat kering.
Dari hasil KLT pada pengamatan dibawah sinar UV 254 nm, didapatkan
untuk infus terdapat 3 bercak yang masing-masing berwarna kebiruan, untuk
ekstrak etanol terdapat 2 bercak masing-masing berwarna kebiruan, serta untuk
34
untuk infus terdapat 1 bercak berwarna ungu gelap, untuk ekstrak etanol terdapat
1 bercak juga berwarna ungu gelap, sedangkan untuk standar juga berwarna ungu
gelap. Setelah pengamatan dengan menggunakan sinar UV, dilakukan penegasan
dengan menggunakan pereaksi warna FeCl3. Setelah disemprot menggunakan
FeCl3 didapatkan hasil untuk infus terdapat 5 bercak masing-masing dengan
warna hitam samar hingga hitam kebiruan dengan harga Rf masing-masing 0,13;
0,48; 0,60; 0,65; 0,82. Untuk ekstrak etanol terdapat 3 bercak yang
masing berwarna hitam kebiruan dan hitam samar dengan harga Rf
masing-masing 0,14; 0,54; 0,83, sedangkan standar berwarna hitam kebiruan dengan
harga Rf 0,82. Jadi dapat disimpulkan bahwa sampel baik infus maupun ekstrak
etanol buah kemlaka mengandung tanin. Hasil identifikasi dengan menggunakan
KLT dapat dilihat pada tabel VI dan lampiran 10, 11, dan 12.
Dari hasil uji t didapat konsentrasi terkecil infus ataupun ekstrak etanol
buah kemlaka memiliki potensi sebagai antibakteri terhadap S. aureus. Dari uji
kualitatif menggunakan KLT didapat ada senyawa tanin dalam infus dan ekstrak
etanol buah kemlaka. Menurut Duke (1992) tanin dapat berfungsi sebagai
antibakteri. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa infus dan ekstrak etanol
buah kemlaka memiliki potensi antibakteri terhadap S. aureus dan tanin
merupakan senyawa yang diduga sebagai senyawa antibakteri yang terdapat
35
Tabel VI. Hasil Identifikasi Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka dengan Metode KLT
Deteksi
UV 254 nm UV 365 nm FeCl3
Bercak No
Rf Warna
bercak Rf Warna Bercak Rf Warna Bercak Infus 1 2 3 4 5 - - 0,60 0,65 0,82 - - Kebiruan Kebiruan Kebiruan - - - - 0,82 - - - - Ungu gelap 0,13 0,48 0,60 0,65 0,82 Hitam kebiruan Hitam samar Hitam samar Hitam samar Hitam kebiruan Ekstrak Etanol 1 2 3 - 0,54 0,83 - Kebiruan Kebiruan - - 0,83 - - Ungu gelap 0,14 0,54 0,83 Hitam samar Hitam samar Hitam kebiruan Standar 0,82 Biru 0,82 Ungu
gelap
36
Gambar 2. Profil Kromatografi Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka dengan Deteksi Warna FeCl3
Keterangan gambar : Fase Diam : Silika Gel GF 254
Fase Gerak : Etil asetat : asam formiat : asam asetat : air
(100:11:11:27)
A : Ekstrak etanol buah kemlaka 2,5%
B : Standart asam tanat 2,5%
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan
1. Infus dan ekstrak etanol buah kemlaka memiliki potensi antibakteri terhadap S. aureus.
2. Kadar Hambat Minimal (KHM) infus buah kemlaka terhadap S. aureus adalah 4%, sedangkan KHM ekstrak etanol adalah 1,5%. Kadar Bunuh Minimal (KBM) infus buah kemlaka terhadap S. aureus adalah 6%, sedangkan KBM ekstrak etanol adalah 2%.
3. Kandungan kimia dalam buah kemlaka yang diduga aktif sebagai antibakteri
adalah tanin.
B. Saran
1. Perlu dilakukan identifikasi dan isolasi senyawa aktif antibakteri yang terdapat dalam infusa dan ekstrak etanol buah kemlaka.
2. Perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang potensi antibakteri infus dan ekstrak etanol buah kemlaka dengan metode Bioautografi.
3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang uji toksisitas infus dan ekstrak
etanol buah kemlaka sehingga diketahui nilai LC50.
4. Perlu dilakukan standarisasi simplisia buah kemlaka sehubungan dengan
kegunaannya sebagai antibakteri.
38
DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-17, 80, Depkes RI
Anonim, 1989, Phyllanthus emblica (PIER species info), www.hear.org, diakses 17Januari 2005
Anonim, 1993, Dasar-Dasar Pemeriksaan Mikrobiologi, 27-29, 115-116, Bagian Mikrobiologi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Anonim, 1995a, Farmakope Indonesia, Ed IV, 7-9, 410, Depkes RI
Anonim, 1995b, Farmakologi dan Terapi, Ed IV, 517, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta
Anonim, 1996, Tannins: Fascinating but Sometimes Dangerous Molecules,
www.ansci.cornell.edu/palnts/toxicagents/tannin.html, diakses 8 April 2005
Anonim, 1999, Phyllanthus emblica Fruit, \\E:/Phyllanthus emblica Fruit.htm, diakses 8 April 2005
Anonim, 2000a, Flora of Sut, nelli\flora.sut.ac.th,pH8.html.htm, diakses 7 juli 2005
Anonim, 2000b, Kemloko (Phyllanthus emblica Linn.), www.asiamaya.com, diakses 8 April 2005
Anonim, 2003, Emblic mycrobalans: Amla-Key Herb of Ayurwedic Medicine, Portland, Oregon, www.imotline.org/arts/amla.htm, diakses 22 Agustus 2005
Anonim, 2005, Plant Database, NRSC, United State Departement of Agriculture,
www.yahoo.com, diakses 31 Oktober 2005
Bonang, G., & Koeswardono, E., S., 1982, Mikrobiologi Kedokteran Untuk Klinik dan Laboratorium, 9, 17, 177-182, Gramedia, Jakarta
Bidiyanto, K., A., M., 2003, Mikrobiologi Terapan, 101, Penerbit Universitas Muhammadiyah, Malang
Duke, J., 1992, Phytochemical and Ethnobotanical Database, www.arsgin.gov, diakses 25 April 2005
39
Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia Jilid II, Ed I, 1137-1138, Badan Litbang Departemen Kehutanan RI
Hugo, W., B., & Russel, A., D., 1987, Pharmaceutical Mycrobiology, 34, 37, 285-286, Blackwell Scientific Publication, Oxford
Jawetz, E., Melnick, J., L., & Adelberg, E., A., 2001, Mikrobiologi Kedokteran, Ed I, 235, 317-326, Diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Penerbit Salemba Medika, Jakarta
Morton, F., J., 1987, Phyllanthus emblica L. In : Fruits of Warm Climates, 213-217, Miami, Florida, www.nort.purdue.edu,mewcorp,morton,emblic.htm.ht, diakses 8 April 2005
Robinson, T., 1991, The Organic Constituents of Higher Plants, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Ed IV, 281-292, ITB Press, Bandung
Salle, A., J., 1961, Fundamental Prinsiples of Bacteriology, 5th Ed, 738-739, Mc. Graw, Hill Book Company Inc., Kogakusha Company Ltd, Tokyo
Sudjadi, S., 1981, Metode Pemisahan, 60-72, Penerbit Kanisius, Yogyakarta Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, 4, 6, 13, 17,
diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata & Iwang Sudiro, ITB, Bandung Tan, H., T., & Rahardja, K., 1991, Obat-Obat Penting : Khasiat, Penggunaan dan
Efek-Efek Sampingnya, Ed IV, Cetakan ke-2, 66, 72, Balai POM, Depkes RI, Jakarta
Lampiran 2. Tanaman Kemlaka (Phyllanthus emblica L.)
Lanpiran 3. Buah Kemlaka (Phyllanthus emblica L.)
Lampiran 4. Foto Hasil Uji Potensi Antibakteri Infus Buah Kemlaka Terhadap S. aureus dengan Metode Difusi Paper Disk
Lampiran 5. Foto Hasil Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Terhadap S. aureus dengan Metode Difusi Paper Disk
Keterangan : A : Kontrol Positif (Ampisilin 2,5%) B : Kontrol Negatif (DMSO)
Lampiran 6. Foto Hasil Uji Penetapan Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) Infus Buah Kemlaka Terhadap S. aureus
Dengan Metode Dilusi Padat
Keterangan : K(-) : Kontrol Negatif (Aquadest) K(+) : Kontrol Positif (Ampisilin 2,5%) 1 : Infus Buah Kemlaka 2%
Lampiran 7. Foto Hasil Uji Penetapan Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Terhadap S.
aureus Dengan Metode Dilusi Padat
Keterangan : K(-) : Kontrol Negatif (DMSO)
Lampiran 8. Foto Hasil Uji Penegasan Penetapan Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) Infus Buah Kemlaka Terhadap
S. aureus Dengan Metode Streak Plate
Keterangan : K(+) : Kontrol Positif (Ampisilin 2,5%) 1 : Infus Buah Kemlaka 2%
Lampiran 9. Foto Hasil Uji Penegasan Penetapan Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) Ekstrak Etanol Buah Kemlaka
Terhadap S. aureus Dengan Metode Streak Plate
Lampiran 10. Hasil KLT Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Dengan Deteksi UV 254 nm
Keterangan : Fase diam : Silica Gel GF 254
Fase gerak : Etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100:11:11:27)
Lampiran 11. Hasil KLT Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Dengan Deteksi UV 365 nm
Keterangan : Fase diam : Silica Gel GF 254
Fase gerak : Etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100:11:11:27)
Lampiran 12. Hasil KLT Infus dan Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Dengan Deteksi FeCl3
Keterangan : Fase diam : Silica Gel GF 254
Fase gerak : Etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100:11:11:27)
Pereaksi Semprot : FeCl3
Lampiran 13. Hasil Uji Statistik Diameter Zona Hambat Infus Buah Kemlaka Terhadap S. aureus
One-Sample Statistics
4 .0000 .0000a .0000
4 .9600 8.165E-03 4.082E-03
Kontrol (-) Konsentrasi infusa terkecil
N Mean Std. Deviation
Std. Error Mean
t cannot be computed because the standard deviation is 0. a.
One-Sample Test
235.151 3 .000 .9600 .9470 .9730
Konsentrasi infusa terkecil
t df Sig. (2-tailed)
Mean
Difference Lower Upper 95% Confidence Interval of the
Lampiran 14. Hasil Uji Statistik Diameter Zona Hambat Ekstrak Etanol Buah Kemlaka Terhadap S. aureus
One-Sample Statistics
4 .0000 .0000a .0000
4 1.1075 1.258E-02 6.292E-03
Kontrol (-)
Konsentrasi ekstrak etanol terkecil
N Mean Std. Deviation
Std. Error Mean
t cannot be computed because the standard deviation is 0. a.
One-Sample Test
176.030 3 .000 1.1075 1.0875 1.1275
konsentrasi ekstrak etanol terkecil
t df Sig. (2-tailed)
Mean
Difference Lower Upper 95% Confidence Interval of the
