17 3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental laboratorik. Mengadakan perlakuan terhadap sampel yang telah ditentukan yaitu berupa hewan coba di laboraturium.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakologi Politeknik Kesehatan Kementerian Kesehatan Bandung pada bulan Mei sampai dengan Juni 2015.
3.3 Populasi dan Sampel
Populasi: Mencit (Mus musculus) jantan galur Swiss Webster sehat dengan berat badan sekitar ±20-35 gram, usia hewan 2-3 bulan.
Sampe: hewan uji berupa mencit jantan galur Swiss Webster yang dibagi menjadi 6 kelompok masing- masing terdiri dari 6 ekor mencit. Jumlah sampel (mencit) yang digunakan dalam penelitian ini ditentukan berdasarkan rumus Federer, yaitu: (t-1)(n-1)>15 dimana t adalah jumlah perlakuan (jumlah kelompok), sedangkan n adalah ulangan (jumlah sampel tiap kelompok) (Purawisastra, 2001).
Perhitungan: (t-1) (n-1) > 15 (6-1) (n-1) > 15
Pada penelitian ini jumlah sampel ditentukan ada 6 kelompok perlakuan dan 6 ekor mencit (n>4) tiap kelompok, maka jumlah mencit yang diperlukan adalah 36 ekor mencit dari populasi yang ada.
3.4 Desain penelitian
Mencit dibagi menjadi 6 kelompok, tiap kelompok terdiri dari 6 ekor mencit. Terdapat 2 metode yang digunakan untuk melakukan prosedur penelitian ini yaitu: Metode transit intestinal dan metode proteksi terhadap oleum ricini.
a. Metode Proteksi Terhadap Diare Oleh Oleum Ricini
Prinsip metode : Kandungan utama dari oleum ricini adalah trigliserida dari asam risinoleat akan mengalami hidrolisis didalam usus halus oleh lipase pankreas menjadi gliserin dan asam risinoleat. Sebagai surfaktan anionik, zat ini bekerja mengurangi absorpsi neto cairan dan elektrolit serta menstimulasi peristaltis usus, sehingga berkhasiat sebagai laksansia berdasarkan kerja ini. Obat yang berkhasiat antidiare akan melindungi hewan percobaan mencit terhadap diare yang diinduksi dengan oleum ricini tersebut.
Dalam metode ini parameter pengukurannya adalah : 1) Konsistensi Feses
2) Frekuensi Feses 3) Bobot Feses
b. Metode Transit Intestinal Prinsip metode:
Metode transit intestinal dapat digunakan untuk mengevaluasi aktivitas obat antidiare, laksansia, spasmodik, berdasarkan pengaruhnya pada rasio jarak usus
yang ditempuh oleh sesuatu marker dalam waktu tertentu terhadap panjang usus keseluruhan pada hewan percobaan mencit atau tikus. Apabila obat memiliki aktivitas antidiare maka nilai rasionya akan lebih kecil bila dibandingkan terhadap kelompok kontrol.
Sampel diambil dengan teknik random sampling, yaitu pengambilan sample dengan cara mengambil begitu saja. Pada penelitian ini besar sampel adalah 25 ekor mencit yang dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan secara random (acak).
Skema Rancangan Penelitian
KKN HKN
KKP HKP
KU1 HU1
Populasi - Sampel – Random
KU2 HU2
KU3 HU3
KU4 HU4
Keterangan:
KKN : Kelompok kontrol negatif (kelompok mencit yang diberi suspensi CMC 1%)
KKP : Kelompok kontrol positif (kelompok mencit yang diberi oleum ricini)
KU1 : Kelompok uji 1 (kelompok mencit yang diberi suspensi obat pembanding kemudian diberi oleum ricini)
KU2 : Kelompok uji 2 (kelompok mencit yang diberi infusa daun beluntas dengan konsentrasi 5% kemudian diberikan oleum ricini)
KU3 : Kelompok uji 2 (kelompok mencit yang diberi air infusa daun beluntas dengan konsentrasi 10 % kemudian diberikan oleum ricini)
KU4 : Kelompok uji 2 (kelompok mencit yang diberi air infusa daun beluntas dengan konsentrasi 20% kemudian diberikan oleum ricini)
3.5 Identifikasi Variabel Penelitian
1) Variabel bebas : Infusa Daun Beluntas ( Pluchea Indica L) 2) Variabel terikat : Aktivitas antidiare dari Infusa Daun Beluntas
3) Variabel luar:
a. Dapat dikendalikan : Jenis kelamin, jenis makanan mencit, umur, variasi genetik, suhu udara, dan berat badan mencit.
b. Tidak dapat dikendalikan : Kondisi psikologis mencit, reaksi hipersensitivitas, dan kondisi awal mencit
4.6 Alat dan Bahan Penelitian
ALAT : Sonde Oral, Disp Syringe 1 Cc, kertas saring, Kandang Mencit, Pisau Bedah, Tali, Penggaris, Pinset, 4o Ekor Mencit, Timbangan Hewan, Stopwatch.
BAHAN : Obat Pembanding , Infusa Daun Beluntas, CMC, Mencit 36 Ekor, Aquadest, Tinta Cina.
4.7 Cara Kerja
1) Pengumpulan Bahan
Pengambilan tumbuhan dilakukan dengan memilih daun beluntas yang masih utuh dan segar yang diambil dari perkebunan daerah Subang, Jawa Barat.
2) Determinasi
Daun beluntas yang diteliti, sebelum dilakukan penelitian dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Sekolah Tinggi Ilmu Hayati ITB BANDUNG. Bagian yang dideterminasi yaitu, daun dan semua bagian yang menempel pada daun.
Uji efek antidiare dimulai dari penyiapan hewan percobaan, penyiapan bahan uji, kontrol, obat pembanding, induktor diare dan pengujian efek antidiare, seperti dituturkan dibawah ini:
a) Penyiapan Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit jantan Galur Swiss sehat yang berumur 2-3 bulan dengan berat 20-35 gram. Satu minggu sebelum penelitian, mencit diadaptasikan dengan lingkungan percobaan.
b) Penyiapan Bahan
Penyiapan bahan yang dilakukan adalah pembuatan sunpensi CMC sebagai kontrol, suspensi obat pembanding, oleum ricini sebagai induktor, dan infusa daun beluntas sebagai bahan uji.
c) Pembuatan Suspensi CMC 1% (b/v)
Pembuatan suspensi CMC 1% (b/v) diantaranya dengan cara:
1) CMC sebanyak 1 gram ditaburkan ke dalam mortir berisi aquadest panas sebanyak 20 ml.
2) Ditutup dan dibiarkan selama 30 menit hingga diperoleh massa yang transparan
3) Digerus lalu diencerkan dengan aquadest hingga 100 ml. d) Pembuatan Suspensi obat pembanding
Tablet nodiar® diambil sebanyak 2 tablet kemudian digerus dan disuspensikan dalam CMC Na 1% sehingga konsentrasi nodiar dalam suspensi adalah 14.22 mg/ml.
e) Pembuatan Infusa Daun Beluntas
1) Ditimbang untuk 3 konsentrasi 5%, 10%, 20% , dengan pemotongan kecil. 2) Setelah ditimbang, kemudian dicuci bersih.
3) Daun beluntas, yang telah ditimbang dan dipotong halus direbus dengan menggunakan aquadest sebanyak 100 ml, kemudian setelah direbus ditambahkan aquadest hangat hingga 100 ml, karena selama direbus terjadi penguapan dan pengurangan volume air.
4) Daun beluntas yang telah direbus selama 15 menit sampai suhunya 90 derajat celcius disaring dan diambil airnya.
f) Prosedur Metode Proteksi dan Metode Transit Intestinal
Mencit dibagi menjadi 6 kelompok, tiap kelompok terdiri dari 6 ekor mencit. Metode yang digunakan untuk melakukan prosedur penelitian ini terdapat 2 metode yaitu : metode transit intestinal dan metode proteksi terhadap oleum ricini. 1. Metode Proteksi Terhadap Diare Oleh Oleum Ricini
Dalam metode ini parameter pengukurannya adalah : a. Konsistensi feses
Tabel 3.1 Parameter Pengukuran Konsistensi Feses
Simbol Konsistensi Skor
T Tidak defekasi 0
N Normal 1
Ln Lembek Normal 2
Lc Lembek Cair 4
C Cair 5
b. Frekuensi feses
Frekuensi feses ditentukam berdasarkan berapa kali mencit tersebut mengalami defekasi dalam setiap 30 menit.
c. Bobot feses
Dihitung berdasarkan selisih berat kertas saring awal dengan berat kertas saring setelah 30 menit. Mencit dikelompokan secara acak menjadi 6 kelompok yaitu, kelompok kontrol yang diberi oleum ricini, kelompok yang diberi sediaan uji dan kelompok yang diberi pembanding Nodiar®, masing-masing terdiri atas 6 ekor mencit. Mencit diadaptasikan dengan lingkungan penelitian selama satu minggu.
Delapan belas jam sebelum penelitian, mencit dipuasakan, kemudian dikelompokkan menjadi 6 kelompok masing-masing 6 ekor.
1) Kelompok 1 hanya diberi suspensi CMC 1% (b/v) saja secara per oral sebagai kontrol negatif. Kelompok mencit diberi oleum ricini sebanyak 0.5 ml/ekor secara oral.
2) Kelompok II didiamkan tidak diberikan asupan lagi sebagai kontrol positif (Hanya Oleum ricini).
3) Kelompok III diberikan suspensi nodiar® secara oral sebagai pembanding. 4) Kelompok IV diberikan air infusa daun beluntas dengan konsentrasi 5%
5) Kelompok V diberikan air infusa daun daun beluntas dengan konsentrasi 10% secara oral sebagai uji 2.
6) Kelompok VI diberikan air infusa daun beluntas dengan 20% secara oral sebagai uji 3.
7) Satu jam setelah perlakuan, semua mencit diberikan per oral 0.5 ml oleum ricini
8) Respon yang terjadi pada tiap mencit diamati selang 30 menit sampai 4 jam, kemudian selang 1 jam sampai 6 jam setelah pemberian oleum ricini.
9) Parameter yang diamati meliputi frekuensi diare, konsistensi feses, dan jumlah bobot feses.
2. Metode Transit Intestinal
Untuk pengujian aktivitas antidiare dengan menggunakan metode transit intestinal adalah sebagai berikut :
a. Pengujian dilakukan 7 hari setelah dilakukan metode proteksi karena menggunakan mencit yang sama, sambil diadaptasikan kembali.
b. Selama 18 jam sebelum dilakukan pengujian, mencit dipuasakan (tetapi minum tetap diberikan).
c. Dikelompokan dengan cara dipilih secara random dan dikelompokan menjadi 5 kelompok masing-masing 6 ekor.
d. Pada waktu uji, setiap kelompok mencit diberi perlakuan :
1) Kelompok KKN diberi suspensi CMC NA 1% sebanyak 0.5% sebagai kontrol negatif
2) Kelompok 1 diberikan suspensi nodiar 14.22 mg/ml per ekor secara per oral sebagai kelompok uji 1 (obat pembanding)
3) Kelompok II diberikan air infusa daun beluntas konsentrasi rendah sebanyak 5% secara per oral (kelompok uji 2).
4) Kelompok III diberikan air infusa daun beluntas konsentrasi sedang sebanyak 10% secara per oral (kelompok uji 3)
5) Kelompok IV diberikan air infusa daun beluntas konsentrasi tinggi sebanyak 20% secara per oral (kelompok uji 4).
6) Pada waktu t-45 menit, semua mencit diberi tinta cina (marker) sebanyak 1ml per ekor mencit secara per oral.
7) Satu jam setelah pemberian marker, semua hewan dikorbankan secara dislokasi tulang leher. Usus dikeluarkan secara hati-hati sampai terenggang. Panjang usus yang dilalui marker tinta cina mulai dari pilorus sampai ujung akhir (berwarna hitam) diukur. Demikian pula panjang usus dari pilorus sampai rektum dari masing-masing hewan.
8) Kemudian dihitung rasio normal jarak yang ditempuh marker terhadap panjang usus seluruhnya. Umumnya pada mencit normal diperlukan waktu selama 1.5 jam-2 jam untuk membawa marker dari pilorus sampai rektum. 9) Nilai rasio kemudian dirata-ratakan untuk masing-masing kelompok
kemudian dibandingkan.
Data hasil pengamatan yang diperoleh, selanjutnya dianalisis secara statistik dengan menggunakan SPSS (Statistical Product and Service Solution) versi 20.0 dengan metode uji Anova (Analisis Variansi). Jika ada perbedaan yang bermakna, maka pengujian dilanjutkan dengan uji Post Hoc Test yaitu menggunakan analisis Tukey Homogenous Subset dengan nilai α = 0,05 untuk membandingkan bobot feses, frekuensi feses, dan konsistensi feses.
