METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN) UNTUK MENGHITUNG NITROSOMONAS (Laporan Praktikum Biologi dan Kesehatan Tanah)
Oleh
Karina Zulkarnain 1314121095
kelompok 6
JURUSAN AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan, pada suatu saat tertentu tanpa
memberikan perlakuann terlebih dahulu, sedangkan jumlah mikroorganisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana di warnai atau tidak di warnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber), sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan yang masih hidup saja.
Metode Most Probable Number (MPN) memungkinkan kita untuk menduga populasi mikroorganisme tanpa menghitung jumlah sel atau koloni. Jumlah populasi diduga berdasarkan pengenceran tertinggi di mana pertumbuhan diamati pada pengenceran 10-4 dan tidak pada pengenceran 10-5 ,maka jumlah sel yang hidup antara 104 dan 105. Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui
berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Metode cawan agar merupakan metode yang paling sering dipakai untuk menghitung jumlah mikroorganisme. Pendugaan
mikroorganisme yang terdapat di dalam tanah yang terbawa erosi, air, air limbah, hasil pertanian, dan makanan juga menggunakan metode ini.
Jumlah total mikroorganisme yang terdapat di dalam tanah digunakan sebagai indeks kesuburan tanah tanpa mempertimbangkan hal-hal lain. Tanah yang subur mengandung banyak mikroorganisme karena populasi yang tinggi
ekologi lain yang mendukung perkembangan mikroorganisme tanah tersebut. Namun demikian, pada dua jenis tanah yang mempunyai jumlah dan aktivitas mikroorganisme yang sama dan sebanding belum tentu menggambarkan
produktivitas tanah yang sama. Hal ini dapat disebabkan karena pada tanah yang satu, unsure hara makro dan mikro yang dibutuhkan tanaman hanya dapat mencukupi keperluan mikroorganisme tanah dan tidak cukup untuk mendukung pertumbuhan tanaman secara maksimal. Oleh karena itu, jumlah mikroorganisme dalam tanah harus dipertimbangkan sebagai deskripsi dan tidak untuk indeks kesuburan tanah semata.
1.2 Tujuan
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut : 1. Mengetahui proses atau cara kerja metode Most Probable Number (MPN). 2. Mengetahui cara menghitung nitrosomonas dengan metode MPN.
II. METODOLOGI KERJA
2.1 Alat dan Bahan
Adapun alat yang di gunakan dalam praktikum ini, yaitu: cawan agar, tabung reaksi, kapas, autoclave, label.
Sedangkan bahan yang digunakan adalah sebagai berikut: sample tanah, medium, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, MgSO4, Fe-sitrat , Phenol red, akuades, 0,1 N
HCl, 0,1 N NaOH, 1 ml larutan tanah, nitrosomonas.
2.2 Prosedur Kerja - Diambil 20 g sample tanah
- Disiapkan seri pengenceran 10-1 – 10-8
- Disiapkan medium untuk penetapan nitrosomonas\
- Dicocokkan pH medium menjadi 7.4 dengan menambahkan 0,1 N HCl atau NaOH
- Ditambahkan akuades sehingga volumenya 1000 ml
- Dimasukkan larutan medium tersebut sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi - Ditutup tabung dengan kapas
- Diautklaf selama 20 menit pada temperature 121˚C - Didinginkan medium
- Dimasukkan 1 ml larutan tanah dari seri pengenceran 10-8 – 10-4, masing-masing sebanyak 5 tabung reaksi dan 5 ulangan
III. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga
dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam MPN/satuan volume atau massa sampel. Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sample sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sample yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Semua tabung positif yang
dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya kedalam media.
sampel. Prosedur perhitungan adalahdengan penumbuhan dalam agar. Sampel suspensi sel diinokulasi ke dalam media agar nutrien dan diinkubasi. Lantas jumlah koloni yang terbentuk dihitung. Satu koloni yangterbentuk dari satu sel, maka jumlah koloni menunjukkan jumlah sel dalam larutanasalnya.
Prosedur ini hanya menghitung sel-sel yang hidup. Bakteri Nitrosomonas adalah bakteri yang mampu menambat nitrogen dari udara. Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisadengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya,
tujuananalisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif
Nitrosomonas.Jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlahmikroorganisme dalam sampel tidak diketahui
sebelumnya, maka untuk memperolehsekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhisyarat tersebut maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlahorganisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloniyang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan.
Pada table diatas didapat nilai P1= 2, P2= 1, dan P3= 0, sehingga jika
digabungkan P1, P2, dan P3 mendapatkan nilai perhitungan sebesar 0.068 x 104. pada 10-6, 10-7, dan 10-8 tidak terdapat bakteri karena tabung tidak mengalami perubahan ke warna kuning (positif), tetapi bewarna agak keruh dan kemerahan. Bakteri Nitrosomonas merupakan bakteri penitrifikasi. Bakteri ini dapat
mengoksidasiamonium (NH4+) menjadi nitrit. Bakteri ini tergolong gram
negative yang memeiliki bentuk sel batang (panjang 0.6 – 0.4 mikrometer), spiral, sferikal, ellipsoid. Bakteri ini mempunyai sel yang tidak motil dan motil dengan flagella polar sampai sub polar atau peritrik.
Bakteri nitrosomonas adalah bakteri aerob khemolitotrof obligat yang
utama karbon.
Bentuk bakteri ini yaitu batang (basil), pendek, kadamg-kadang berbentuk elips, motil, dan non motil. Bakteri ini dapat tumbuh optimum pada temperature 5-30˚C dan pH optimum berkisar antara 5.8 sampai 8.5, serta hidup pada habitat air laut, air tawar, dan tanah.
Adapun factor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri nitrosomonas yaitu :
1. DO (Dissolvid Oxygen) = Oksigen terlarut, sebagai penyeimbang electron dari substrat bernitrogen sehingga memerlukan kurang lebih 4.5 mg oksihen 2. Suhu (T) = bakteri ini dapat tumbuh optimal antara suhu 20-30˚C, jika temperature menurun, maka aktivitas bakteri itu sendiri menurun. Jika suhu lebih dari 35˚C, bakteri ini akan mengalami stress, sehingga enzim dapat rusak karena suhu tinggi itu
3. pH = pH optimum yaitu antara 7.5-8.5. pH yang baik yaitu apabila dapat dipertahankan stabil.
4. Cahaya = bakteri ini sensitive terhadap kehadiran cahaya yang mendekati spectrum ultraviolet, karena terdapat hubungan superoksida radikal yang diproduksi menghambat membrane oksigen.
5. Konsentrasi nitrit nitrogen = bakteri ini dapat tumbuh jika kebutuhan sumber nitrogen terendah menunjukkan angka 0,1 mg/L.
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) (Penn, 1991).
jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan
pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Sutedjo, 1991).
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk
berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count/TPC), perhitungan melalui pengenceran,
perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sopiah. 2007)
MPN (most Probable Number). Metode hitungan cawan dengan menggunakan medium padat, tetapi pada metode MPN dengan menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik yang membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas (tabung reaksi) yang digunakan juga lebih banyak (Dwidjosepuutro, 2005).
susu, biakan cair dan sebagainya. Serentetan pengenceran dibuat untuk kemudian ditanam dalam medium pembiakan bulyon agar dan setelah inkubasi jumlah koloni dihitung. Setelah dikonversi sesuai dengan pengencerannya, akan diketahui jumlah bakteri per milliliter. Karena pengenceran dikerjakan secara lipat ganda atau secara desimal, maka angka yang diperoleh hanya angka perkiraan, yang biasa disebut Most Probable Number (MPN) (Irianto, 2006).
Prinsip untama dari metode MPN ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang
dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung reaksi positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang
menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dari probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya kedalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negative (tidak) ini
menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan (Dwidjoseputro, 2005).
Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada pengenceran pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung 1 jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan tabung yang lain mengandung sel sama sekali. Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positifm sedangkan tabung lainnya negatif (Waluyo, 2004).
berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspense 1:10 dari sampel tersebut. Kelompok jasad renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan
IV. KESIMPULAN
Didapatkan kesimpulan dari praktikum kali ini adalah sebagai berikut : 1. Semakin rendah seri pengenceran, maka tidak terdapat bakteri
nitrosomonas
2. Hasil perhitungan atau analisis yang didapatkan pada P1, P2, dan P3 yaitu 0.068x 104
3. Bakteri Nitrosomonas dapat tumbuh dengan factor-faktor seperti oksigen, suhu, pH, cahaya, dan konsentrasi nitrit nitrogen.
DAFTAR PUSTAKA
Fardiaz. 1996.Menentukan Jumlah dan Ukuran Mikroba. IPB : Bogor
Irianto. 2006. Isolasi dan Seleksi Bakteri Penitrifikasi. IPB : Bogor
Nida Sopiah. 2007. Teknik Biofilter Untuk Pengolahan Limbah Ammonia. Jurnal BPPT : Jakarta
Penn, C. 1991.Handling Laboratory Microorganism. Open University. Milton
Sutedjo, M. M., A. G. Kartasapoetra dan RD. S. Sastroatmodjo. 1996.
Mikrobiologi Tanah. PT. Rineka Cipta. Jakarta. 447 hal.
Sutedjo, Mul Mulyani, dkk. 1996. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta, Jakarta.
Tim lab. 2006. Penuntun Praktikum Purwokerto Prodi Ilmu Tanah. Faperta UNSOED, Purwokerto.
