PEMBAHASAN UMUM
Teknologi DNA rekombinan sebagai alternatif pemuliaan pohon kehutanan untuk modifikasi lignin .
Teknologi DNA rekombinan dapat menjadi alternatif sebagai metoda mutasi genetik terarah untuk menghasilkan bibit unggul sengon yang memiliki komposisi lignin yang lebih menguntungkan untuk bahan baku pulp yaitu yang kadarnya rendah ataupun rasio siringil/guaiasilnya lebih tinggi. Teknologi yang dapat diterapkan dapat berupa up regulasi maupun down regulasi enzim-enzim yang berkaitan dengan biosintesis lignin. Salah satu enzim kunci dalam biosintesis lignin yaitu 4-Coumarate CoA ligase telah diterapkan pada beberapa tanaman untuk menekan biosintesis lignin melalui down regulasi ekspresi enzim tersebut baik dengan teknik antisense maupun konstruk RNA interferens (RNAi). Sengon sebagai komoditi tanaman kehutanan yang tumbuh cepat dan banyak dibudidayakan pada hutan tanaman industri, memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai bahan baku pulp karena dimensi serat dan karakteristik yang cocok untuk industri kertas dari kayu sengon yang unggul. Walaupun penelitian mengenai rekayasa metabolik untuk modifikasi kadar lignin telah dilakukan pada beberapa tanaman berkayu seperti poplar, pinus, dan akasia, akan tetapi hingga kini di Indonesia belum ditemukan laporan mengenai penelitian serupa untuk tanaman kehutanan.
Tahapan penelitian yang terdiri dari: (1) analisis kuantitatif dan uji histokimia lignin, (2) induksi embriogenesis dan induksi tunas dari nodal kotiledon, (3) isolasi dan pengklonan cDNA fragmen gen penyandi 4-coumarate:
Coenzyme A ligase dari sengon, dan (4) transformasi genetik sengon dengan
fragmen gen 4CL antisense merupakan rangkaian kegiatan yang telah dilakukan untuk menghasilkan tanaman sengon transgenik yang memiliki karakteristik rasio siringil/guaiasil lignin yang tinggi ataupun rendah kadar ligninnya. Peningkatan rasio siringil lignin sangat penting untuk proses pembuatan pulp yang lebih efisien karena siringil lebih reaktif terhadap proses delignifikasi.
Ketersediaan bibit unggul pohon bahan baku pulp dengan karakteristik kadar lignin rendah tetapi pertumbuhan dan produktivitas kayunya tinggi ataupun
kayu dengan komposisi lignin yang lebih reaktif adalah sangat penting untuk memperoleh rendemen pulp yang tinggi tetapi input bahan kimia dan energi yang ekonomis. Pengaruh modifikasi kadar lignin terhadap proses pulping telah diteliti pada tanaman poplar transgenik antisense COMT dan CAD yang menunjukkan bahwa tanaman transgenik rendah lignin memerlukan bahan kimia yang lebih sedikit dan menghasilkan pulp dengan bilangan Kappa yang lebih kecil dibanding kontrol (Lapierre et al. 1999). Demikian juga dengan tanaman transgenik overekspresi gen F5H memiliki rasio siringil lebih tinggi dan menghasilkan pulp dengan bilangan Kappa lebih rendah dan lebih cerah (Baucher et al. 2003).
Proses lignifikasi pada kayu sengon
Kadar dan komposisi lignin pada setiap tanaman bervariasi tergantung umur tanaman, jenis sel dan jaringan serta lokasi tumbuh. Lignin kayu sengon dewasa yang diuji dari beberapa daerah (berbeda lokasi tumbuh) tetapi umurnya hampir sama, kadarnya bervariasi 16.58-34.44% dan rata-rata 27.29%. Kadar lignin tersebut merupakan kategori lignin sedang-tinggi. Rata-rata kadar lignin yang diperoleh hampir sama dengan hasil peneliti lain yaitu 26.8% (Pari et al. 1996). Kadar lignin tergantung pada umur yaitu semakin tua kadarnya semakin tinggi yang mencapai 30.19% pada kayu sengon umur 15 tahun (Pari et al.1997) juga bervariasi pada ketinggian pohon yang berbeda. Hasil penelitian mengenai kadar lignin sengon dewasa menunjukkan bahwa pada titik pengambilan sampel (ketinggian pohon) berbeda yaitu pada 2 m kadar ligninnya berbeda dari yang 4 m. Penelitian kadar lignin pada bagian pohon yang lebih tinggi (mendekati ujung pohon) perlu dilakukan untuk mengetahui distribusi lignin yang lebih lengkap. Informasi distribusi atau variasi kadar lignin dari berbagai lokasi tumbuh merupakan informasi yang sangat penting untuk menentukan target besarnya penurunan kadar lignin melalui modifikasi genetik. Informasi mengenai kisaran kadar lignin kayu sengon yang dikoleksi dari berbagai daerah sangat berguna untuk penentuan keberhasilan percobaan penghambatan ekspresi gen 4CL untuk menurunkan kadar lignin. Dengan demikian penurunan kadar lignin yang harus dicapai untuk menentukan keberhasilan ekspresi gen 4CL antisense haruslah mencapai kadar yang lebih rendah dari 16.58%.
Selain pengamatan secara spasial, pengamatan deposisi lignin secara temporal juga penting dilakukan untuk mengetahui mulainya proses lignifikasi sengon seiring dengan perkembangan tanaman. Penelitian mengenai perkembangan dinding sel tanaman terkait dengan lignifikasi pada tanaman tingkat tinggi khususnya tanaman berkayu belum banyak dilaporkan. Pada tanaman jenis legum yaitu kedelai, diketahui bahwa lignifikasi telah terjadi pada tahap awal perkecambahan yaitu ketika umur 5 hari (De Micco 2008). Jika dibandingkan dengan sengon yang juga merupakan kelompok legum, pembentukan lignin yang diamati dengan pewarnaan phloroglucinol mulai terjadi pada umur 2 minggu dan deposisinya meningkat hingga 3 kali pada umur 2 bulan. Informasi mengenai deposisi lignin sangat penting untuk menentukan umur tanaman yang akan digunakan untuk isolasi gen penyandi lignin. Selain itu, uji histokimia juga berguna sebagai deteksi dini untuk mengetahui kadar lignin secara kualitatif pada bibit sengon transgenik. Walaupun masih memerlukan penelitian lebih lanjut, dapat diduga bahwa pada tanaman berkayu proses awal pembentukan deposisi lignin lebih lambat dibanding tumbuhan tingkat rendah yang perkembangannya lebih cepat. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa proses lignifikasi pada awal perkembangan tanaman terjadi sangat cepat. Hal ini tampak dari kadar lignin sengon pada umur 2 bulan yang mencapai 13.94% jika dibandingkan dengan kadar lignin pohon sengon umur 10 tahun dengan rata-rata 26.8%. Peranan proses lignifikasi yang sangat cepat pada awal perkembangan bibit sengon sangat menarik untuk dipelajari lebih lanjut terutama keterkaitannya dengan pembentukan mikrofibril selulosa.
Peranan gen 4CL dalam biosintesis lignin kayu sengon.
Ekspresi antisense 4CL tidak saja dapat digunakan untuk memperoleh bibit sengon transgenik tinggi rasio siringil/guaiasil ataupun rendah kadar lignin, tetapi dapat juga digunakan untuk mengkaji peranan gen 4CL pada biosintesis lignin dan lebih jauh lagi pada pertumbuhan tanaman. Hasil penelitian menunjukkan konstruk antisen 4CL yang diintroduksikan pada pohon sengon mempengaruhi kadar dan komposisi lignin serta pertumbuhan. Penurunan kadar lignin diduga terjadi karena ekspresi gen 4CL terhambat karena adanya inteferensi transkrip
mRNA endogen sengon oleh transkrip mRNA dari konstruk antisense. Walaupun mekanismenya belum jelas, represi ekspresi gen 4CL juga berpengaruh terhadap rasio S/G lignin sengon.
Pertumbuhan bibit sengon transgenik ada yang terhambat atau kerdil, hal ini mungkin terjadi karena berkurangnya massa yang ditunjukkan oleh kadar lignin yang sangat rendah yang mengganggu pertumbuhan. Kemungkinan lainnya adalah lokasi integrasi gen yang tersisip pada gen-gen fungsional yang berkaitan dengan pertumbuhan. Fenomena serupa terjadi pula pada tanaman lainnya hasil transformasi konstruk antisense ataupun RNAi gen-gen penyandi enzim yang berkaitan dengan biosintesis lignin yaitu penurunan lignin yang sangat tinggi akibat aktivitas enzim biosintesis lignin yang sangat rendah menyebabkan abnormalitas morfologi dan pertumbuhan tanaman. Penurunan kadar lignin pada tanaman transgenik poplar antisense CCoAOMT (Caffeoyl Coenzyme A
O-methyltransferase) dengan tingkat penurunan sedang yaitu sebanyak 27%
memperlihatkan pertumbuhan yang normal (Zhong & Morrison 2000). Hasil serupa juga ditunjukkan pada sengon transgenik antisense 4CL, penurunan lignin antar 8.31 – 45.57% dibanding kontrol masih menghasilkan tanaman dengan pertumbuhan normal. Penurunan lignin yang terlalu tinggi hingga 8% saja dapat mengganggu pertumbuhan pohon yaitu menjadi kerdil seperti yang terjadi pada
P. radiata (Wagner 2009).
Penurunan kadar lignin dengan persentase penurunan hingga sekitar 50% tampaknya tidak mengganggu pertumbuhan tanaman. Pengaturan ekspresi gen yang terkait dengan biosintesis lignin, tidak saja berpengaruh pada kadar maupun komposisi lignin, tetapi juga berpengaruh pada deposisi selulosa. Transformasi konstruk antisense 4CL pada Populus tremuloides menyebabkan penurunan lignin sebesar 52% dan menyebabkan peningkatan S/G rasio dan selulosa hingga 65% dan 30% (Li et al. 2003). Analisis FTIR terhadap kayu sengon transgenik menunjukkan adanya peningkatan S/G sebesar 50% terhadap kontrol. S/G rasio rata-rata kayu sengon transgenik sebesar 0.77 pada umur 4 bulan yang lebih tinggi dibandingkan kontrol yaitu sebesar 0.4. S/G rasio alami kayu bervariasi tergantung jenis tanaman, jenis jaringan dan umur tanaman (Watanabe 2004, Nurhayati et al. 2009). Pada kayu daun lebar pada umumnya rasio siringil lebih
tinggi dibanding guaiasil seperti pada Eucalyptus camaldulensis (2.99), E. grandis (2.93), E. urophylla (2.57), Acacia hybrid (1.27), A. auriculiformis (1.08), A.
mangium (0.98) (Nurhayati 2009). Diharapkan S/G rasio kayu sengon transgenik
akan meningkat seiring dengan bertambahnya umur tanaman, seperti yang terjadi pada tanaman poplar transgenik antisense caffeic acid o-methyl transferase (CAD) yang rasio siringilnya meningkat sebesar 44% pada tanaman umur tiga bulan dibandingkan dengan tanaman umur 2 tahun (Lapierre et al. 1999).
Upaya lebih lanjut pengembangan pohon sengon transgenik rendah lignin Hasil penelitian yang telah dilakukan adalah diperolehnya dua tanaman transgenik yang unggul rendah lignin (15.53%) yaitu 4CLAS-4 dan yang memiliki rasio S/G tinggi dibanding control yaitu 4CLAS-1 dan menunjukkan pertumbuhan yang paling baik serta morfologi yang normal. Selanjutnya tanaman tersebut perlu diperbanyak melalui propagasi in vitro untuk menghasilkan bibit dalam jumlah yang besar untuk pengujian lebih lanjut di lapangan terbatas dengan melengkapi persyaratan keamanan hayati untuk uji lapangan terbatas tanaman trasngenik. Untuk keperluan tersebut perlu dilengkapi data-data lainnya seperti jumlah kopi gen dengan analisis Southern Blot dan uji pendahuluan keamanan hayati di rumah kaca fasilitas uji terbatas. Berdasarkan hasil penelitian ini diharapkan dimasa yang akan datang akan tersedia kayu dari tanaman transgenik rendah lignin dan rasio S/G tinggi yang dapat digunakan untuk mendukung kajian efisiensi proses dalam industri pulp.
