BAB III BAHAN DAN METODE

27 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Pengambilan sampel Avicennia marina di Kawasan Wisata Alam Mangrove Angke Kapuk, Kapuk Muara Pantai Indah kapuk, Jakarta Utara. Pengujian sampel dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Ilmu Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan serta Identifikasi sampel dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati ITB. Waktu Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari - Mei 2013.

3.2 Alat dan Bahan

a. Pengambilan Sampel Batang Mangrove  Alat

 Pisau digunakan untuk memotong batang pohon mangrove

 GPS digunakan untuk menentukan titik lokasi sampling mangrove  Refraktometer digunakan untuk mengukur salinitas perairan  Termometer digunakan untuk mengukur suhu perairan

 pH meter digunakan untuk mengukur derajat keasaman perairan  Kapal digunakan untuk menuju lokasi titik penelitian

 Kapas dan kassa steril digunakan untuk membungkus batang mangrove  Kertas label digunakan untuk menandai batang mangrove

 Bahan

 Alkohol steril digunakan untuk mensterilisasi permukaan dari pisau  Batang mangrove Avicennia marina

b. Sterilisasi Alat  Alat

 Autoklaf digunakan untuk mensterilisasi alat dan medium yang akan digunakan

 Bahan

 Medium TSA (Triptic Soy Agar) digunakan untuk kultivasi mikroba endofit dari batang mangrove

 Medium NA (Nutrient Agar) digunakan untuk kutivasi bakteri Staphylococcus aureus dan Vibrio harveyi

 Medium MHB (Mueller Hinton Broth) digunakan untuk fermentasi mikroba endofit

 Erlenmeyer digunakan untuk meletakkan medium yang akan digunakan  Cawan petri digunakan untuk menanam bakteri mangrove

 Tabung reaksi digunakan untuk membuat agar miring dan kultur cair  Eppendorf digunakan untuk fermentasi mikroba endofit

 Kapas dan kassa steril digunakan untuk menutup mulut erlenmeyer dan tabung reaksi

c. Isolasi dan Pemurnian Bakteri Batang Mangrove Avicennia marina  Alat

 Cawan petri digunakan untuk isolasi bakteri endofit dari batang mangrove  Kawat ose digunakan untuk mengambil bakteri endofit yang telah tumbuh  Erlenmeyer digunakan sebagai wadah berisi medium TSA

 Bunsen digunakan sebagai alat sterilisasi aseptis

 Plastik wrap digunakan untuk menutup pinggiran dari cawan petri  Bahan

 Batang mangrove Avicennia sp digunakan sebagai sumber isolat bakteri endofit

 Alkohol 70% digunakan untuk sterilisasi aseptis lingkungan kerja  Medium TSA

 Etanol 70% digunakan untuk sterilisasi permukaan batang mangrove Avicennia marina

 Natrium Hipoklorit 0,3% digunakan untuk sterilisasi permukaan batang mangrove

 Aquades steril digunakan untuk membuat medium serta membersihkan batang mangrove

 Ketokonazol digunakan sebagai anti jamur saat menumbuhkan koloni bakteri

d. Produksi Metabolit Bakteri Endofit  Alat

 Erlenmeyer

 Kapas dan kassa steril  Tabung reaksi

 Eppendorf atau falcon 14 mL  Kertas label

 Mikropipet dan pipet tip

 Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan natan dan supernatan dari suspensi bakteri

 Botol vial digunakan untuk menyimpan supernatan hasil fermentasi  Bahan

 Medium MHB

 Isolat murni bakteri endofit

 Konsentrasi Mc Farland’s 0,5 atau setara dengan kepadatan bakteri 1,5x108

CFU/ml

e. Uji Aktivitas Zona Hambat  Alat

 Cawan petri steril  Pinset steril

 Busen  Kertas label

 Mikropipet dan pipet tip  Bahan

 Medium NA

 Isolat bakteri Vibrio harveyi dan Staphylococcus aureus  Supernatan hasil fermentasi bakteri endofit

 Kertas cakram/kertas saring steril

f. Pewarnaan Gram Bakteri Endofit  Alat

 Objek glass digunakan untuk membuat apusan bakteri  Kawat ose digunakan untuk mengambil bakteri

 Mikroskop digunakan untuk mengamati warna dan morfologi bakteri  Bunsen digunakan untuk fiksasi apusan bakteri

 Pipet tetes digunakan untuk meneteskan zat warna pada bakteri  Nampan digunakan untuk menampung sisa zat warna berlebih  Bahan

 Isolat murni batang mangrove Avicennia marina

 NaCl fisiologis digunakan untuk membuat apusan bakteri

 Gentian Violet digunakan sebagai zat warna pertama (warna ungu)  Alkohol 70% digunakan sebagai zat peluntur

 Lugol digunakan sebagai zat pemantek/perekat zat warna pertama  Air Fuchsin digunakan sebagai zat warna kedua (warna merah)

g. Ekstraksi Kulit Batang Mangrove  Alat

 Blender digunakan untuk menghaluskan kulit batang mangrove menjadi serbuk

 Timbangan analitik digunakan untuk menimbang serbuk yang akan digunakan untuk proses ekstraksi

 Ayakan digunakan untuk memisahkan serbuk dengan batang yang masih kasar

 Alumunium foil digunakan untuk menutup mulut erlenmeyer  Kertas label

 Bahan

 Serbuk batang mangrove sebanyak 100 gram

 Metanol 1 L digunakan sebagai pelarut dalam proses ekstraksi 3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode non eksperimental dengan teknik observasi di laboratorium. Tahapan penelitian ini meliputi isolasi bakteri endofit, ekstraksi kulit batang mangrove, identifikasi genus bakteri, dan uji aktivitas antibiotik dari bakteri endofit dan juga kulit batang mangrove terhadap bakteri Vibrio harveyi dan Staphylococcus aureus (Lampiran 1).

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pengambilan Sampel Batang Mangrove

Sampel bakteri endofit diambil dari batang mangrove Avicennia marina. batang yang diambil merupakan bagian ranting kurang lebih sepanjang 5 cm. Ranting batang mangrove yang didapat dipisahkan antara batang tua dan batang muda untuk proses ekstraksi. Daerah mangrove yang akan dijadikan tempat penelitian seluas 99.82 Ha. Dalam wilayah tersebut dipilih 3 perwakilan pohon mangrove yang tegak lurus dengan daratan (Lampiran 2). Pemilihan pohon mangrove yang akan dijadikan sampel dilakukan secara acak. Pemilihan pohon ini dilakukan untuk mewakili keragaman bakteri endofit yang terkandung di dalam batang magnrove Avicennia marina.

3.4.2 Sterilisasi Alat

Alat-alat yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan. Alat kemudian dibungkus dengan kertas pembungkus setelah itu dilakukan sterilisasi. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoclave selama 15-20 menit pada 1210C dengan tekanan 15 lb. Medium TSA (Triptic Soy Agar), MHB (Mueller Hinton Broth), dan NA (Nutrient agar) yang akan digunakan untuk menumbuhkan bakteri baik yang berasal dari batang mangrove Avicennia marina maupun bakteri tantang yang akan digunakan (Vibrio harveyi dan Staphylococcus aureus)

3.4.3 Isolasi Bakteri Endofit dari Batang Mangrove

Isolasi mikroba endofit dilakukan menurut metode F. Tomita (Lumyong et al., 2001). Tanaman dikoleksi dari lapangan dan kemudian sampel tanaman dibersihkan dari kotoran dengan cara mencucinya dengan air mengalir. Kemudian tanaman dipotong-potong dan selanjutnya disterilisasi permukaan menggunakan larutan etanol 70% selama 1 menit, natrium hipoklorit 0,3% selama 5 menit, dan terakhir dengan etanol kembali selama 30 detik. Setelah itu sampel dibilas dengan air steril beberapa kali dan didapatkan batang steril. Batang steril tersebut kemudian dibelah menjadi dua bagian dan diletakkan dengan cara bagian yang didalam batang menghadap media TSA (Triptic Soy Agar) dan ditambah dengan ketokonazol dengan perbandingan 0,3 gram/100 ml. Ketokonazol atau C26H28N4O4Cl2 adalah suatu bahan sintetik yang digunakan sebagai antifungal

azole. Bentuk dari ketokonazol ini berupa serbuk putih hingga abu-abu dan tidak larut dalam air tetapi larut dalam DMSO atau kloroform. Ketokonazol mempunyai pKa (derajat kelarutan asam) sebesar 2,9 hingga 6,5. Media yang telah siap kemudian diletakkan sampel dengan cara membelah bagian tanaman dan meletakkan pada posisi tertelungkup. Cawan petri yang sudah mengandung sampel tanaman kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu kamar (27-290C) selama 5-7 hari. Bakteri yang tumbuh secara bertahap dimurnikan satu per satu dan dipreservasi. Pada satu sampel batang mangrove dilakukan 3 kali

pengulangan penanaman pada cawan petri. Hal ini dimaksudkan sebagai indikasi keberadaan dan keseragaman bakteri endofit yang akan dihasilkan.

3.4.4 Isolasi Biakan Murni Bakteri Endofit

Koloni-koloni yang tumbuh pada cawan petri masih berupa biakan campuran dari batang mangrove Avicennia marina. Setiap koloni yang berbeda warna diambil 1 kali cuplikan dengan menggunakan ose dan kemudian ditanam kembali ke cawan petri yang telah berisi TSA+ketokonazol. Hal ini terus dilakukan hingga diperoleh biakan murni sehingga mempermudah dalam tahap identifikasi selanjutnya.

3.4.5 Produksi Metabolit Bakteri Endofit

Isolat bakteri endofit yang telah murni, ditumbuhkan dalam medium nutrient broth. Proses fermentasi bakteri endofit menggunakan medium Mueller-Hinton Broth (MHB). Media MHB biasa digunakan untuk mengetahui daya antibakteri dengan kandungan pepton (6 g), kasein (17,5 g), pati (1,5 g) dalam 1 Liter air. Isolat yang diambil sebelumnya dipindahkan ke dalam 5 ml medium MHB. Kemudian dihomogenkan menggunakan tube stirrer hingga mencapai kekeruhan 0,5 Mc Farland. Suspensi koloni bakteri tersebut kemudian diambil sebanyak 1 ml dan dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi 9 ml medium MHB. Eppendorf yang telah berisi suspensi bakteri kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 300C dan kecepatan 130 rpm. Setelah 2x24 jam, medium yang telah berisi suspensi bakteri kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil dengan menggunakan mikro pipet steril dan dimasukkan kedalam vial steril. Supernatan tersebut yang akan digunakan sebagai uji aktivitas antibiotik.

3.4.6 Uji Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder  Uji Alkaloid

Sampel sebanyak 1 ml ditambahkan dengan 5 tetes kloroform dan beberapa tetes Pereaksi Mayer. Adanya endapan putih menandakan adanya alkaloid. Pembuatan Pereaksi Mayer yaitu dengan satu gram KI dilarutkan dalam 20 ml aquades hingga larut. Kemudian larutan tersebut ditambahkan dengan HgCl2 hingga larut.

 Uji Saponin

Uji saponin dilakukan dengan cara, sebanyak 2 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan dengan aquades. Campuran tersebut kemudian dikocok dengan kuat selama 10 menit. Terbentuknya busa atau buih menandakan adanya saponin.

 Uji Flavonoid

Sampel sebanyak 1 ml ditambahkan dengan 1 gram bubuk Mg dan beberapa tetes HCL pekat. Timbulnya warna kuning menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

 Uji Tanin

Uji tanin dilakukan dengan memasukkan sebanyak 1 ml sampel ke dalam tabung reaksi. Sampel kemudian ditambahkan dengan FeCl3 5%. Adanya

perubahan warna menunjukkan adanya senyawa tanin (fenolik).

 Uji Terpenoid

Uji terpenoid dan steroid dilakukan dengan cara, sebanyak 1 ml sampel ditambahkan dengan 1 ml CH3COOH glasial dan 1 ml H2SO4 pekat. Timbulnya warna merah menunjukkan adanya terpenoid sedangkan warna biru atau ungu menunjukkan adanya steroid.

3.4.7 Ekstraksi Kulit Batang Mangrove

Proses ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi yakni perendaman sampel dengan menggunakan pelarut tertentu. Proses maserasi ini menggunakan perbandingan sampel dengan pelarut metanol sebanyak 1:10 dan lama waktu perendaman 1x24 jam dengan 1 kali pengulangan. Sampel batang Avicennia marina didapat dari Taman Wisata Alam Mangrove Angke Kapuk Jakarta. Batang mangrove yang didapat, dipisahkan antara batang tua (berwarna coklat) dan batang muda (berwarna hijau), kemudian dibersihkan dengan air mengalir sampai bersih dari kotoran. Setelah bersih sampel yang berupa batang tua dan batang mudda kemudian dipotong-potong hingga bagian terkecil dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada suhu ruang. Setelah kering sampel dihaluskan dengan menggunakan blender selama beberapa kali hingga menjadi serbuk. Sampel yang telah berbentuk serbuk kemudian ditimbang sebanyak 25 gram untuk batang muda dan batang tua kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml. Sampel tersebut kemudian ditambah dengan pelarut metanol sebanyak 250 ml. Sampel yang telah direndam dengan metanol dilakukan pengadukan setiap satu jam sekali. Setelah 1 x 24 jam sampel disaring dan dipisahkan antara filtrat dan residunya. Filtrat hasil penyaringan kemudian diuapkan dengan rotary evaporator dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 650C selama kurang lebih 8 menit untuk didapatkan crude ekstrak (ekstrak kasar). Residu yang yang tersisa setelah proses penyaringan, kemudian dimaserasi dengan pelarut metanol kembali sebanyak volume awal selama 24 jam. Setelah 24 jam, dilakukan kembali penyaringan untuk diambil filtratnya dan diuapkan dalam rotary evaporator. Crude ekstrak diberi nama dengan ekstrak metanol. Ekstrak tersebut kemudian digunakan untuk uji antibiotik terhadap bakteri Vibrio harveyi dan Staphylococcus aureus.

3.4.8 Uji Aktivitas Antibiotik

Antibiotika adalah suatu substansi kimia yang dibentuk atau diperoleh dari berbagai spesies mikroorganisme, yang dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya. Tes sensitivitas dilakukan dengan metode difusi Kirby-Bauer pada media Nutrient Agar. Prosedur

difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode Kirby-Bauer) merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri. Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk. Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya, sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik.

Zona hambat adalah daerah yang tidak ditumbuhi oleh bakteri uji dikarenakan adanya kemampuan dari zat antibiotik yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji. Pengujian antibiotik dilakukan dengan cara merendam paper disk yang telah steril selama 30 menit di dalam supernatan bakteri. Setelah 30 menit, paper disk diambil dengan menggunakan pinset steril dan dituntaskan ke dinding vial untuk mengurangi supernatan berlebih. Paper disk yang sudah tuntas kemudian diletakkan ke dalam cawan petri yang telah berisi medium dan bakteri diuji. Bakteri uji yang digunakan Vibrio harveyi dan Staphylococcus aureus. Cawan petri yang telah berisi bakteri uji dan paper disk kemudian disimpan di dalam inkubator selama 1x24 jam pada suhu 300C. Setelah 1x24 jam dilakukan pengamatan dan pengukuran zona hambat. Pengukuran zona hambat yang terbentuk berdasarkan zona bening yang terbentuk di sekitar kertas saring. Semakin besar zona hambat yang terbentuk menunjukkan peka/tahan terhadap bakteri patogen yang diberikan. Sebaliknya, semakin kecil zona hambat yang terbentuk maka menunjukkan bakteri tersebut resisten terhadap bakteri uji yang diberikan.

3.4.9 Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Endofit 3.4.9.1 Pengamatan Morfologi Bakteri

Karakterisasi keragaman bakteri yang diamati meliputi morfologi koloni berupa warna, bentuk, tepian, kenaikan permukaan, dan kepekatan warna koloni (Cappucino & Sherman 2005). Pengamatan dilakukan setelah 24 jam waktu inkubasi.

3.4.9.2 Pewarnaan Bakteri

Pewarnaan Gram pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histologik Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama “kristal violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup ”fuchsin”. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :

1. Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya violet).

2. Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol

3. Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol

4. Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.

Perbedaan sifat yang terjadi antara kedua golongan Gram bakteri, tidaklah absolut tegas dan spesifik, melainkan tergantung juga pada beberapa faktor, antara lain:

a. Bakteri-bakteri Gram positif sering kali tidak dapat menyerap dan mengikat zat warna kristal violet, terutama apabila dibuat preparat dari bakteri-bakteri biakan murni yang telah tua (rough).

b. Ada bakteri-bakteri tertentu yang sangat peka terhadap cara-cara yang mengalami sedikit perubahan.

c. Selain daripada itu ada juga bakteri-bakteri yang bersifat ”gram variable”, dll. Gentian violet dapat diganti dengan crystalviolet atau methylviolet.

Tahapan yang dapat dilakukan yaitu :

1. Bakteri yang akan diidentifikasi, dibuat sediaan (NaCl fisiologis dan satu cuplikan bakteri) pada objek gelas, dikeringkan atau direkatkan (fiksasi) dengan 3x melewati api Bunsen.

2. Bentuk sedian yang telah menempel / kering, kemudian ditetesi dengan zat warna utama yaitu larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin), dibiarkan selama 45 detik.

3. Zat warna berlebih kemudian dibuang dan dibilas dengan akuades

4. Selanjutnya sediaan dibubuhi dengan larutan mordant (lugol), didiamkan selama kira-kira 20 detik.

5. Lugol dibuang dan preparat dicuci dengan alkohol 96%, sampai warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada yang luntur lagi) dan dibilas kembali dengan akuades.

6. Sediaan dibubuhi dengan zat warna kedua yaitu larutan fuchsin, biarkan kira-kira 30 detik.

7. Terakhir sediaan dicuci dengan akuades dan dikeringkan dalam temperatur kamar, Kemudian dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop 8. Pengamatan di bawah mikroskop dilakukan dengan menambahkan 1 tetes

minyak imersi di atas gelas objek untuk menghindari indek bias pada saat pembesaran.

9. Hasil pengamatan di bawah mikroskop, jika warna sel bakteri berwarna ungu artinya bakteri tersebut golongan bakteri Gram positif, sedangkan jika warna sel berwarna merah menandakan bakteri tersebut bakteri Gram negatif.

3.4.9.3 Uji Biokimia

Pada dasarnya setiap mikroorganisme akan dikelompokkan dan diidentifikasi ke dalam beberapa kelompok besar karena beberapa alasan (Cappuccino and Sherman 2005) :

 Berdasarkan sifat patogennya dalam menimbulkan infeksi penyakit

 Isolasi dan pemilihan dari jenis mikroorganisme yang dapat melakukan proses fermentasi. Hal ini erat kaitannya denga hasil industri alkohol, minyak, vitamin, asam organik, antibiotik, industri enzim

 Isolasi dan pengembangan dari jenis mikroba yang cocok untuk pengembangan kualitas usaha dalam bidang makanan seperti yogurt, keju, dan susu

 Perbandingan aktivitas biokimia untuk melihat susunan taksonominya Berdasarkan alasan yang diuraikan di atas, menunjukkan setiap mikroorganisme memiliki spesifikasi dan karakteristik berdasarkan sifat dari aktivitas biokimia atau metabolisme tubuhnya (Gambar 4). Biokimia fingerprints berfungsi sebagai kontrol aktifitas sel-sel enzimatis serta bertanggung jawab terhadap bioenergi, biosintesis, serta biodegradasi yang terjadi di dalam tubuh mikroorganisme (Cappuccino and Sherman 2005).

*Uji IMViC dan Triple sugar-iron test khusus dilakukan untuk memisahkan/membedakan organisme yang berada pada saluran pencernaan

3.4.9.4 Identifikasi Isolat Bakteri Endofit

Identifikasi bakteri dilakukan pada masing - masing isolat bakteri yang telah dikarakterisasi melalui morfologi bakteri, pewarnaan Gram bakteri serta aktivitas biokimianya.

3.5 Parameter Pengamatan

a. Morfologi Bakteri Endofit (Gambar 5) yang diamati meliputi :  Elevasi

o Flat : ketinggian tidak terukur, nyaris rata dengan medium

o Raised : Ketinggian nyata terlihat, namun rata pada seluruh permukaan o Convex : betuk cembung seperti tetesan air

o Umbonate : bentuk cembung dibagian tengah lebih menonjol

Gambar 5. Morfologi Koloni Bakteri Sumber : Cappucino & Sherman 2005  Bentuk Koloni

o Sirkular : bulat, bertepi

o Irregular : tidak beraturan, bertepi o Rhizoid : bentuk seperti akar, menyebar  Ukuran

o Kecil o Moderat / sedang o Besar  Warna o Putih o Kuning o Merah o Ungu  Margin o Entire : rata o Lobate : berlekuk o Undulate : bergelombang o Serrate : bergerigi

o Filamentous : seperti benang

b. Zona Hambat Bakteri

Zona hambat (Gambar 6) adalah daerah yang terbentuk karena adanya kemampuan bakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen maupun uji antibiotik. Adapun interpretasi yang sering digunakan dalam penghitungan zona hambat menurut Davis Stout (1971) dalam Hardiningtyas (2009), yaitu sebagai berikut:

 daerah hambatan dengan diameter 20 mm atau lebih menandakan memiliki potensi sangat kuat

 daerah hambatan dengan diameter 10-20 mm memiliki potensi antibakteri kuat  daerah hambatan dengan diameter 5-10 mm memiliki potensi antibakteri

sedang

 daerah hambatan dengan diameter 5 mm atau kurang potensi antibakterinya lemah

Gambar 6. Bentuk Zona Hambat Sumber : Modul Mikrobiologi

3.6 Analisis Data

Data yang didapat berupa diameter zona hambat pertumbuhan bakteri Vibrio harveyi dan Staphylococcus aureus akibat pengaruh aktivitas antibiotik senyawa metabolit sekunder yang berasal dari bakteri endofit batang mangrove Avicennia marina dan dari kulit batang mangrove Avicennia marina. Data yang ada kemudian dianalisis secara deskriptif dan ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar.