Isolasi Dan Karakterisasi Flavonoid Pada Fraksi Aktif
Antioksidan Dari Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl)
Hasnirwan
1, Sanusi Ibrahim
2, dan Melida Yanti
31,2 Dosen Kimia FMIPA, Mahasiswa Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang
Abstrak. Isolasi flavonoid dari fraksi etil asetat ekstrak buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) dan uji antioksidan awal dari ekstrak methanol, fraksi methanol-air, fraksi etilasetat dan fraksi n-heksana dengan metode penangkapan radikal beabas DPPH telah dilakukan. Hasil isolasi berupa padatan putih kekuningan yang memberikan noda tunggal terhadap beberapa eluen dengan beberapa perbandingan. Hasil spektroskopi UV memberikan serapan pada λmaks 222 nm dan 305 nm. Spektrum IR memberikan pita serapan penting pada bilangan gelombang 33369 cm-1, 2926 cm-1 , 1660 cm-1, 1449 cm-1, 1085 cm-1, 1273 cm-1 , dan 923 cm-1. Dari analisis spektrum IR, dan spektroskopi UV menggunakan pereaksi geser, kromatografi kertas dua arah (KKt2A) dapat disimpulkan bahwa senyawa hasil isolasi diperkirakan adalah golongan flavon glikosida yang memiliki gugus fungsi : -OH , C=C , -C-H dan -C=O serta memilioki substituent gugus hidroksil pada atom C5 dan C4‘.
Kata kunci : Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl), flavonoid, antioksidan.
PENDAHULUAN
Indonesia memiliki kekayaan alam yang melumpah pada sumber daya alam hayati. Kekayaaan alam ini telah dimanfaatkan oleh masyarakat untuk berbagai keperluan antara lain sebagai bahan baku industry, pangan dan sebagai obat. Banyak jenis tumbuhan yang sudah dimanfaatkan sejak lama sebagai obat-obatan tradisional tapi masih banyak senyawa yang terkandung di dalamnya belum diketahui(1).
Kandungan kimia yang ada pada
suatu tumbuhan tersebut sering
memberikan efek fifsiologis dan
farmakologi sehingga lebih dikenal dengan
senyawa aktif. Senyawa akatif ini
merupakan senyawa metabolisme sekunder dari tumbuhan itu sendiri dimanajumlah dan penyebarannya tiap bagian tidak sama. Hal ini mendorong para ahli untuk melakukan penelitian tentang isolasi, uji bioaktifitas dan pemanfaatannya lebih lanjut.
Tumbuhan mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) di Indonesia ditemukan sebagai tanaman hias dan telah dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Bagian yang dimanfaatkan adalah bagian daging buahnya sedangkan bijinya bersifat racun sehingga tidak dapat digunakan
sebagai obat. Tumbuhan ini dalam
pengobatan digunakan sebagai obat
disentri, asam urat, diabetes, antihistamin, anti alergi dan penyakit kulit (3).
Buah mahkota dewa diketahui mengandung berbagai senyawa metabolit sekunder seperti : alkaloid, terpenoid, saponin, polifenol, tannin, sterol, dan kumarin. Selain itru dari literature lain diketahui tumbuhan ini kuga mengandung senyawa lignin dari golongan polifenol dan senyawa syringaresinol serta asam lemak. Metabolit sekunder yang ada di dalamnya berkhasiat dalam penyembuhan berbagai penyakit degenerative seperti penyakit kanker rahim dan diabetes, dan bersifat antioksidan.
METODOLOGI PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat : seperangkat alat distilasi, rotary
evaporator Heidolph WB 2000,
Spektrofotometer UV dan IR,
spektrofotometer UV-Vis, oven, lampu UV, melting point, kolom kromatografi, kertas saring dan alatgelas lainnya.
Bahan : daging buah mahkotadewa
(Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) , pelarut organic methanol, etilasetat, dan n-heksana, anhidrida asetat, asam sulfat,
kloroform, asam klorida, ammonia,
pereaksi sianidin test, sitroborat, pereaksi geser, diklorometana, akuades, 2,2-DPPH, dan silica gel
Isolasi dan fraksinasi
Sebanyak 3,4 kg buah mahkotadewa yang kering angin dimaserasi dengan methanol sebanyak 1,5 L selama tiga hari . Lalu disaring dan dilakukan berulang-ulang sampai terekstrak dengan sempurna. Hasil
diekstrak digabung dan selanjutnya
dipekatkan dengan alat rotary evaporator
pada suhu 40oC sehingga diperoleh ekstrak
kental methanol..Ekstrak methanol ini difraksinasi beberapa kali dalam corong pisah dengan mengunakan pelarut n-heksana dan dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak n-heksana sebanyak 3,78 g.
Untuk sisa fraksi methanol dari fraksi di atas difraksi lagi dengan pelarut etilasetat berulang-ulang dan hasil ekstrak dipekatkan dengan rotary evaporator dan diperoleh ekstrak etilasetat sebanyak 25,71 g.
Pemurnian senyawa hasil isolasi
Pemisahan komponen senyawa yang terdapat dalam fraksi dilakukan dengan metode kromatografi kolom vacum cair.
Sebelum dilakukan fraksinasi dengan
kromatografi kolom terlebih dahulu
dilakukan KLT (Kromatografi Lapisan Tipis) baik untuk ekstrak pekat fraksi n-heksana dan fraksi etilasetat. Pemisahan
ekstrak etilasetat dilakukan dengan dengan kromatografi kolom vacuum cair dan fasa diamnya dipakai silika gel dan sampel dipreabsorbsi terlebih dahulu dengan cara mencampurkan sampel sebanyak 6 gram dengan silica gel 6 gram (1:1) hingga homogen.
Kolom silica gel dibuat dengan cara mensuspensikan 60 gram silica gel dengn pelarut n-heksana dan setelah kolom selesai dibuat baru di masukkan sampel yang telah dipreabsorbsi ke dalam kolom/ Selanjutnya proses elusi dilakukan dengan sisitem SGP dimulai dari pelarut n-heksana, n-heksana : etilasetat (9:1) dan seterusnya sampai eluen methanol. Tiap-tiap fraksi yang dapat dimonitor dengan menggunakan KLT dan fraksi pola noda yang sama digabung. Hasil fraksi diuji memakai uji sianidin untuk mengetahui fraksi yang positif mengandung flavonoid dan didapatkan enam fraksi yang lebih besar.
Fraksi yang positif mengandung
flavoinoid dimurnikan dengan cara
rekristalisasi berulang-ulang dengan
memakai dua pelarut yaitu etilasetat dan n-heksana sehingga didapatkan kristal yang bebas dari pengotor . Hasil yang didapat dimonitor kembali dengan KLT dengan menggunakan berbagai pelarut dan berbagai perbandingan pelarut.
Karekterisasi senyawa hasil isolasi
Karakterisasi senyawa hasil isolasi meliputi pemeriksaan kimia dan fisika yaitu
pengujian uiji sianidin, titik leleh,
kromatografi dua arah, pemeriksaan UV dengan menggunakan pereaksi geser dan pemeriksaan spektrofotometer inframerah.
Metode Pengujian Aktivitas Antioksidan
Ditimbang ekstrak sampel sebanyak 25 mg kemudian dilarutkan dengan 25 mL methanol dalam labu ukur 25 mL dan didapatkan konsentrasi larutan sampel 1
mg/mL. Kemudian untuk penentuan
di masukkan ke dalam vial dan ditambahkan 3,8 mL larutan
2,2-difenil-1-pikrilhidrazil 50 µM. Campuran
dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit ditempat yang gelap dan selanjutnya diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 515 nm.
Pengolahan Data
Aktivitas antioksidan dari sampel
ditentukan oleh besarnya hambatan serapan
radikal bebas melalui perhitungan
persentase inhibisi serapan 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil dengan menggunakan rumus :
Persentase inhibitor = Abs kontrol - Abs sampel X 100 % Abs kontrol
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada pemeriksaan pendahuluan profil
fitokimia pada buah tumbuhan
mahkotadewa (Phaleria macrocarpa
(Scheff) Boerl) didapatkan hasil bahwa buah mahkotadewa mengandung banyak senyawa metabolit sekunder yaitu : flavonoid, fenolik, alkaloid, triterpenoid, saponin dan kumarin sementara steroid memberikan hasil uji yang negative.
Hasil ekstrak dengan menggunakan pelarut methanol didapatkan sebanyak 966 gram yang berwarna coklat. Selanjutnya ekstrak pekat ini difraksinasi dengan pelarut n-heksana didapatkan ekstrak pekatnya 3,78 gram berwarna hijau dan dengan pelarut etilasetat didapatkan pula ektrak pekatnya sebanyak 25,71 gram yang berwarna coklat .Uji antioksidan terhadap ekstrak dari fraksi metanol, n-heksana, dan etilasetat dapat dilihat pada tabel 1.
Dari tabel 1 dapat diketahui bahwa fraksi methanol dan etilasetat memberikan respon positif terhadap antioksidan dan memiliki inhibisi yang besar. Selanjutnya fraksi etilasetat dilanjutkan karena mengandung flavonoid dan memiliki jumlah ekstrak yang cukup banyak.
Tabel 1 : Hasil Uji antioksidan pada fraksi methanol, n-heksana, dan etilasetat dengan metode penangkapan radikal DPPH
No. Fraksi Inhibisi (%)
1. Ekstrak methanol 20,00 2. Ekstrak n-heksana 3,68 3. Ekstrak etilaetat 18,42
Selanjutnya dari fraksi etrilaetat ini
dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom secara SGP dan didapatkan enam (6) fraksi. Fraksi III, IV, V, dan VI mengandung senyawa flavonoid. Untuk fraksi IV diteruskan pengerjaannya karena pada fraksi ini ditemukan terbentuk endapan dan filtrate. Pada pemisahan endapan dengan filtrate hasilnya dimonitor dengan KLT untuk mengetahui adanya flavonoid. Ternyata untuk endapan
jumlahnya banyak dan mengandung
flavonoid dan dipisahkan dengan
kromatografi kolom. Pada pemisahan ini didapatkan senyawa flavonoid murni dalam bentuk kristal setelah diuji dengan KLT dengan berbagai palarut seperti : n-heksana : etil asetat (2:8), etil asetat, etilasetat : methanol (8:2), etilasetat : methanol (6:4) dan etilasetat : methanol (4:6).
Karakterisasi senyawa flavonoid yang didapat dilakukan penentuan titik lelehnya dan didapatkan titik lelehnya : 207,8 -208,2 oC. Pengukuran dengan spektrofotometer UV didapatkan puncak pada panjang gelombang 307 nm. Selanjutkan untuk menentukan posisi gugus hidroksil pada cincin aromatis dilakukan dengan memakai pereaksi geser dan dilihat pergeseran spektrum yang terjadi. Data pergeseran χmaks dari spektrum UV dengan pereaksi geser dapat dilihat pada table 2.
Tabel 2 Panjang gelombang maksimum senyawa hasil pemurnian dengan pereaksi geser
No. Pereaksi Pita I
χmaks(nm) Pergeseran pita I χmaks(nm) Pita II χmaks(nm) Pergeseran pita II χmaks (nm) Posisi gugus OH 1. Metanol 305,00 - 222,60 - - 2. Metanol +Na metoksida 331,00 + 26 240,00 + 18 4‘-OH 3. Metanol + Na asetat 305,00 0 222,60 0 - 4. Metanol + Na asetat + as. borat 305,00 0 222,60 0 - 5. Metanol + AlCl3 362,2 + 57,2 310,00 + 87,4 5-OH 6. Metanol + AlCl3 + HCl 362,20 + 57, 2 310,00 +87,4 -
Untuk interpretasi data spectrum
inframerah memberikan beberapa informasi serapan penting tentang gugus fungsi yang terdapat pada senyawa murni. Spektrum inframerah menunjukkan adanya serapan
pada daerah 3369 cm-1 mengindikasikan
vibrasi –OH dan didukung dengan adanya
serapan C-O muncul pada angka
gelombang 1244-1039 cm-1. Gugus fungsi
C=O muincul pada serapan 1660 cm-1 yang
diperkuat dengan adanya sedrapan pada
angka gelombang 923 cm-1. Serapan C-H
alifatis ditunjukkan pada angka gelombang
2926 cm-1. Pada angka gelombang 1449
cm-1 menunjukkan adanya serapan C=C
aromatis dan mengindikasikan adanya kromofor yang khas dari senyawa flavonoid untuk system ikatan rangkap berkonyugasi. Selain itu serapan pada angka gelombang
1085 cm-1 dan 1139 cm-1 menandakan
adanya peregangan C-O-C molekul eter. Dari data di atas dapat disimpulkan atau gambaran bahwa senyawa hasil permurnian
merupakan senyawa golongan flavon
glikosida.
DAFTAR PUSTAKA
rbain,D, 1997 ― Hutan Sumatera : dari sumber alam tradisional ke sumber Daya lam Ilmu Pengetahuan dan Ekonomi ― FMIPA Unanfd Padang
Dachriyanus, 2 3 ― Kimia Bahan lam 1 ― Univesitas ndalas Padang
Saufi, hmad, 2 7 ― Lignan in Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl and in Linum flavum far compactum L ― Universitas
Dusseldorf, Heinrich-Heine.
Markham, K.R, 1988 ― Techniques of
Flavonoid Identifacation ( Cara-cara
mengidentifikasi Flavonoid )., Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung. Brown, D.W, 1988 ― Organic Spectroscopy
― John Willey and Sons, hal. 3-30, 135-179.
Harbone, J.B,1984 ― Metode fitokimia,
penentuan cara modern menganalisis tumbuhan, Padmawinata, ITB, Bandung,
hal. 3-9, 47-65, 123-158.
Molyneux, P, 2 4, ― The Use of the Stable
Free Radical Diphenyl Picrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity ― J, Sci. Technol, 26 2 ,
211-219.
Trilaksani, W, 2 3, ― Antioksidan : Jenis,
Sumber, Mekanisme Kerja dan Peran Terhadap Kesehatan ―, Institut Pertanian
Bogor, Bogor, hal. 1-12.
Okawa, M, Kinjo. J, Nohara. T and Ono, M, 2 1, ― Modification Method DPPH
Scavenging Activity of Falvonoids Obtained from some Medical Plants ―,
Biol. Pharm. Bull, 24(10), 1202.
Brand-Williams, W. M.E, Cuveliuer, and C. Berset, 1995, ― Use of a Free Radical
Method to Evaluate Antioxydant Activity
―, Lebensmittel-Wissenchaft and
Technologie, 25-30.
Miller, L.P, 1973 ― Phytochemistry of
Organic Metabolite ―, Vol. II, Van
Norstrand Reinhold, Co, New York. Murray, R.D.H, and Brown J. Mendez,
1982, ― The Natural Coumarine ―, Jhon Willey and Son Ltd, New York.