SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-5 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)
SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Diajukan oleh : Reynaldo Tiara NIM : 158114097
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
i
SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-5 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)
SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Diajukan oleh : Reynaldo Tiara NIM : 158114097
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
2 Korintus 10:4
Karena senjata kami dalam perjuangan bukanlah senjata duniawi, melainkan senjata yang diperlengkapi dengan kuasa Allah, yang sanggup untuk meruntuhkan
benteng-benteng.
KARYA INI KUPERSEMBAHKAN UNTUK:
Allah Bapa, Tuhan Yesus Kristus, dan Roh Kudus yang telah menuntunkan dalam setiap perjalanan kehidupanku dengan semua hikmat dan kasih setiaNya.
Papah Tersayang Andry Yatti dan Mamah Tercinta Linda Sunarto atas cinta, kasih sayang, dan senantiasa mendoakan kesuksesanku.
Kedua adik kesayanganku, Figo Stefanus Tiara dan Varel Tiara. You are my best brothers ever.
dan tentunya,
vii PRAKATA
Puji Tuhan penulis panjatkan pada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas penyertaan dan cinta kasih-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan Arilamida-5 dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara dapat diselesaikan dengan baik dan tepat waktu. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt. yang didanai oleh Indonesia Toray Science Foundation (ITSF) Periode 2017-2018 dengan judul “Synthesis, Enzymatic Assay, and Molecular Modelling of Purine Derivatives Targeting Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9 (PEX-9) in The Discovery of Novel Anti-Breast Cancer”. Skripsi ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penyelesaian naskah skripsi ini tidak lepas dari dukungan berbagai pihak, baik langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada:
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
3. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi yang telah membimbing tim penelitian dengan sabar, kasih, semangat, dukungan, motivasi, kritik, dan saran dari awal hingga akhir penyusunan skripsi ini. 4. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. dan Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si.,
M.Sc. selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dan saran yang sangat berharga dalam penulisan naskah ini dari awal hingga akhir.
5. Papah Andry Yatti dan Mamah Linda Sunarto yang telah memberikan pengertian, dukungan, semangat, cinta, kasih, dan doa dalam penulisan naskah ini dari awal dan akhir.
viii
7. Wisnu, Krisna, Kevin, Sangga, dan Ervan, selaku teman seperjuangan skripsi, penulis berterima kasih karena telah bersedia menanggung beban kehidupan bersama dan bertahan hingga akhir.
8. Kelompok “Unknown” Bryant, Tommy, Vani, Alicia, Pipit, Siska, Epen, Elsa, dan Tata, selaku sahabat seperjuangan dan sepermainan selama menjalani aktivitas perkuliahan dari awal hingga akhir. Penulis mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani.
9. Kelompok “Dolan Squad” Wisnu, Krisna, Retha, Lina, Inge, dan Mas Rudi, selaku teman kelas yang berjuang melewati dunia perkuliahan. Penulis mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani.
10. Denny, Chintya, Davor, Beben, dan Alen, selaku sahabat terbaik. Penulis mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani.
11. Bapak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, dan Mas Bimo, selaku laboran yang telah membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian.
12. Seluruh anggota Drug Discovery Research Group, terutama Tito, Diana, Eko, Pandu, Jason, Try, Angel, dan Wiwy, serta Divisi Penelitian dan Pengembangan BEMF Farmasi 2018 penulis berterima kasih atas kerjasama dan dukungan moralnyaselama perjalanan ini.
13. Kak Donny dan Kak Resti, selaku teman Divisi Pengabdian Masyarakat BEMF Farmasi yang selalu memberikan dukungan bagi penulis.
14. Teman-teman FSM C 2015 serta Angkatan 2015 Farmasi yang telah memberikan banyak kenangan dalam masa perkuliahan.
15. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah mendukung dalam penyelesaian penyusunan naskah skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa naskah penelitian ini masih jauh dari kata sempurna dan masih memiliki banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang dapat membangun. Terima kasih.
ix ABSTRAK
Salah satu indikator kanker payudara tipe triple negative dan HER2-positive adalah terjadinya over ekspresi enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9). Enzim ini mendegradasi matriks ekstraseluler yang mengawali terjadinya migrasi sel kanker dan proses metastasis. Penghambat enzim MMP-9 yang telah dirancang selama ini hanya untuk menghambat MMP pada sisi catalytic domain sehingga gagal pada tahap uji klinik, karena bersifat non-selektif terhadap salah satu jenis MMP dan menyebabkan efek samping yang merugikan seperti contohnya nyeri muskuloskeletal dan inflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mensintesis senyawa turunan arilamida-5 serta menguji aktivitasnya sebagai penghambat MMP-9 secara selektif, karena dirancang untuk berikatan dengan hemopexin domain. Sintesis telah dilakukan dengan mereaksikan sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin pada suhu kamar. Senyawa hasil sintesis yang terbentuk berupa serbuk kuning, negatif terhadap DAB-HCl, larut dalam DMSO, dan memiliki titik lebur 193-200°C dengan rendemen sebesar 67,13%. Senyawa hasil sintesis berhasil dipastikan strukturnya dengan metode spektrofotometri inframerah, spektrometri resonansi magnetik inti, dan kromatografi gas-spektrometri massa. Senyawa hasil sintesis diuji aktivitasnya terhadap MMP-9 secara in vitro dan didapatkan nilai persentase penghambatan terhadap enzim MMP-9 sebesar 93% pada 200 µg/mL dan nilai IC50 sebesar 199 µM. Kesimpulannya senyawa turunan arilamida-5 aktif
x ABSTRACT
One of indicators in triple negative and HER2-positive breast cancer is the overexpression of the Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) enzyme. This enzyme degrades the extracellular matrix which initiates cancer cell migration and metastasis. To date, MMP-9 enzyme inhibitors have been designed only to inhibit MMP on the catalytic domain which unfortunately fails at the clinical trial, due to the non-selective inhibition across MMP subfamilies while causing adverse side effects such as musculoskeletal pain and inflammation. This study aims to synthesize arylamide-5 and test its activity as MMP-9 inhibitors. The synthesis was carried out by reacting sulfamerazine and 3-bromopropionyl chloride using pyridine as the catalyst at room temperature. The physical appearance of the synthesized compound (yield 67,13%) is yellow powder, which negatively reacts with DAB-HCl, soluble in DMSO, and having melting range: 193-200°C. The synthesized compound was successfully confirmed its structure by FTIR, NMR, and GC-MS. The synthesized compound was tested for its activity against MMP-9 in vitro showing percentage inhibition of the MMP-9 enzyme being 93% at 200 µg/mL while the IC50 value was equal to 199 µM associating with its potency as
breast cancer drug candidate.
xi DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... vi
PRAKATA ... vii
ABSTRAK ... ix
ABSTRACT ... x
DAFTAR ISI ... xi
DAFTAR TABEL ... xii
DAFTAR GAMBAR ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
PENDAHULUAN ... 1
METODE PENELITIAN ... 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ... 5
KESIMPULAN ... 19
SARAN ... 19
UCAPAN TERIMA KASIH ... 19
DAFTAR PUSTAKA ... 20
LAMPIRAN ... 23
xii
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-5 ... 9 Tabel II. Perhitungan %penghambatan turunan arilamida-5 terhadap
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Struktur dan farmakofor dari (a) compound 2; (b) senyawa
Adhipandito dan Ludji ; dan (c) turunan arilamida-5 ... 2 Gambar 2. Mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) antara
sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida menggunakan katalisator piridin ... 6 Gambar 3. Produk hasil sintesis senyawa turunan arilamida-5 setelah
dilakukan proses penetralan pH dan pengeringan (a) dan sulfamerazin (b) ... 7 Gambar 4. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-5 yang
menunjukkan 2 noda yang berbeda, yaitu sulfamerazin (A) dan senyawa turunan arilamida-5 (B) ... 8 Gambar 5. Spektrum IR senyawa turunan arilamida-5 ... 10 Gambar 6. Spektrum IR sulfamerazin (diadaptasi dari Prajapat et al.,
2018) ... 10 Gambar 7. Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa turunan
arilamida-5 ... 13 Gambar 8. Spektrum resonansi magnetik inti 13C senyawa turunan
arilamida-5 ... 15 Gambar 9. Kromatogram hasil kromatografi gas senyawa turunan
arilamida-5 ... 16 Gambar 10. Spektrum massa senyawa turunan arilamida-5 ... 16 Gambar 11. Kurva hubungan log konsentrasi turunan arilamida-5 dengan
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Tahap sintesis senyawa turunan arilamida-5 ... 23
Lampiran 2. Mekanisme reaksi sulfamerazin dengan DAB-HCl ... 23
Lampiran 3. Hasil uji DAB-HCl ... 24
Lampiran 4. Perhitungan bahan dan rendemen ... 24
Lampiran 5. Perbesaran pada sinyal 2,85 ppm dan 2,98 ppm ... 25
Lampiran 6. Perbesaran pada sinyal 3,72 ppm dan 3,87 ppm ... 25
Lampiran 7. Perbesaran pada sinyal 7,76 ppm dan 7,93 ppm ... 26
Lampiran 8. Perbesaran pada sinyal 7,62 ppm dan 8,31 ppm ... 26
Lampiran 9. Mekanisme pola fragmentasi m/z 334 ... 27
Lampiran 10. Mekanisme pola fragmentasi base peak m/z 55 ... 27
Lampiran 11. Rancangan microwell plate untuk uji aktivitas in vitro ... 28
1 PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan sel yang tumbuh
secara tidak normal dan disebabkan oleh mutasi genetik. Mutasi tersebut terjadi
berulang kali dan menyebabkan sel dapat menghindari mekanisme pengendalian normal (Pecorino, 2012). Salah satu enzim yang berperan penting dalam
perkembangan kanker adalah Matrix Metalloproteinase (MMP). MMP merupakan
protease yang akan mendegradasi matriks ekstraseluler (ECM) dan menyebabkan
metastasis, sehingga sel kanker dapat bermigrasi (Merdad et al., 2014). MMP-9
diekspresikan oleh sel kanker payudara jenis triple-negative dan HER2-positive
dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan pada sel payudara normal,
sehingga kedua jenis kanker payudara tersebut disebut sebagai highly metastatic
(Mehner et al., 2014; Yousef et al., 2014).
Marimastat merupakan salah satu MMP-9 inhibitor yang telah dirancang untuk menghambat progresi dari kanker payudara namun tidak selektif dalam menghambat salah satu jenis MMP, sehingga mengakibatkan efek samping berupa
nyeri muskuloskeletal dan inflamasi (Cathcart et al., 2015). Seluruh kelompok
MMP memiliki struktur berupa signal peptide, pro-peptide domain, catalytic
domain, dan hemopexin domain (Bauvois, 2012). Marimastat dirancang dengan
menargetkan catalytic domain yang memiliki homologi sekuens asam amino yang
cukup tinggi (43-65%) pada seluruh jenis MMP, sehingga aktivitas dari MMP selain MMP-9 akan terhambat (Vandenbroucke dan Libert, 2014). Sedangkan
pada hemopexin domain MMP-9 (PEX-9) hanya terdapat homologi sebesar
25-35% dengan PEX pada MMP lainnya. Hal ini menjadikan PEX-9 sebagai target
protein yang lebih selektif dalam menghambat MMP-9 (Dufour et al., 2011).
Penelitian mengenai MMP inhibitor yang selektif terhadap PEX-9 telah
dilakukan oleh Dufour et al., (2011) yang menemukan senyawa CID135415473
(~{N}-[4-(difluoromethoxy)phenyl]-2-[(6-oxo)-4-propyl-1~{H}-pyrimidin-2-yl) sulfanyl]acetamide) (www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) atau disebut juga Compound 2 dengan nilai Kd = 2,2 μM. Gugus yang diduga berperan penting
dalam aktivitas penghambatan PEX-9 adalah cincin planar yang berinteraksi
memberikan efek fleksibel bagi cincin arilamida untuk berinteraksi di kantung aktif yang disajikan pada Gambar 1a
dalam penghambatan
Adhipandito (2017; R= H) dan Ludji (2017; R= NO
Alford et al
selektif terhadap MMP
farmakofor yang serupa dengan (2017) mensintesis 2 senyawa
fragmen dari Compound
masing-masing 11% dan
seperti nitro pada turunan arilamida,
terhadap MMP-9. Penelitian ini melanjutkan seri dari s Ludji dengan menambahkan gugus sulfonamid
yang bersifat EWG dan EDG sehingga diharapkan meningkatkan aktivitas penghambatan terhadap MMP
Gugus difluorometoksi
Cincin arilamida
2
memberikan efek fleksibel bagi cincin arilamida untuk berinteraksi di
yang disajikan pada Gambar 1a. Interaksi tersebut
penghambatan proses pembentukan homodimer pada PEX dapat mencegah proses migrasi sel kanker (Dufour et al, 2010).
ksi (-OCF2) yang bersifat EWG (Electron Withdrawing
Electron Donating Group) belum dijelaskan pengaruhnya terhadap aktivitas penghambatan PEX-9.
(a)
(c)
Struktur dan farmakofor dari (a) compound 2; (b) senyawa
Adhipandito (2017; R= H) dan Ludji (2017; R= NO2); dan (c) turunan arilamida
et al., (2017) juga telah menemukan senyawa yang aktif
selektif terhadap MMP-9 yaitu Senyawa 3c dengan Kd = 0,32 µ
farmakofor yang serupa dengan Compound 2. Adhipandito (2017) dan Ludji
(2017) mensintesis 2 senyawa turunan arilamida (Gambar 1b) yang merupakan Compound 2 dengan %penghambatan terhadap MMP
dan 67%. Berdasarkan strukturnya, penambahan gugus EWG pada turunan arilamida, meningkatkan aktivitas penghambatan . Penelitian ini melanjutkan seri dari senyawa Adhipandito dan Ludji dengan menambahkan gugus sulfonamid-4-metilpirimidin
yang bersifat EWG dan EDG sehingga diharapkan meningkatkan aktivitas penghambatan terhadap MMP-9.
Cincin arilamida
Cincin planar Rantai alkil
Gugus sulfonamid-4-metilpirimidin
memberikan efek fleksibel bagi cincin arilamida untuk berinteraksi di permukaan Interaksi tersebut diduga berperan proses pembentukan homodimer pada PEX-9, sehingga , 2010). Sementara itu, Electron Withdrawing ) belum dijelaskan pengaruhnya
; (b) senyawa ); dan (c) turunan arilamida-5
senyawa yang aktif dan = 0,32 µM dan memiliki Adhipandito (2017) dan Ludji yang merupakan terhadap MMP-9 sebesar Berdasarkan strukturnya, penambahan gugus EWG meningkatkan aktivitas penghambatan enyawa Adhipandito dan pirimidin (Gambar 1c) yang bersifat EWG dan EDG sehingga diharapkan meningkatkan aktivitas
Cincin planar
3 METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Seluruh bahan kimia yang digunakan bermutu analisis, kecuali disebutkan lain. Bahan utama yang digunakan untuk sintesis antara lain sulfamerazin (4-amino-N-(4-methylpyrimidin-2-yl)benzenesulfonamide) mutu obat, 3-bromopropionil klorida, piridin, natrium karbonat mutu teknis (Na2CO3)
10%, akuades, n-heksana, etil asetat, dimetilsulfoksida (DMSO), plat silika gel GF254 (Merck 7730), dan dimetilaminobenzaldehid HCl (DAB-HCl). Bahan untuk
elusidasi struktur yaitu pellet kalium bromida untuk spektrofotometri inframerah dan pelarut DMSO-D6 untuk spektrometri resonansi magnetik inti. Bahan untuk uji aktivitas in vitro yaitu kit enzim MMP-9 yang didapatkan dari Biovision terdiri dari enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat peptida Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)-based MMP-9, dapar Tris HCl, peptida NNGH inhibitor (Asparagin-Asparagin-Glisin-Histidin) sebagai kontrol positif, gliserol untuk mengencerkan enzim, dan dimetilsulfoksida sebagai pelarut sampel.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain timbangan analitik (Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven (Memmert GmbH+Co.KG), labu alas bulat (Pyrex), pengaduk magnetik, lempeng panas, bejana (chamber) kromatografi lapis tipis (KLT), lampu UV254, alat uji titik
lebur (Mettler Toledo®), dan alat gelas pada umumnya. Alat untuk elusidasi struktur digunakan spektrofotometer inframerah (Shimadzu), spektrometer nuclear magnetic resonance (Bruker 176 dan 700MHz), kromatografi gas-spektrometer massa (GC-MS QP2010S Shimadzu). Alat untuk uji aktivitas in vitro digunakan pipet mikro (Eppendorf), micro well plate 96, pipet tips, inkubator, vortex, dan ELISA microplate reader fluorescence (Tecan Infinite 200 PRO).
Prosedur Penelitian
4
mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar lalu ditambahkan 3-bromopropionil klorida tetes demi tetes sebanyak 5,39 mmol (0,61 mL). Campuran diaduk kembali selama 30 menit pada suhu kamar. Hasil sintesis
disaring kemudian dinetralkan dengan Na2CO3 10% hingga pH netral dan dicuci
dengan akuades serta dikeringkan di oven pada suhu 40ºC. Uji Pendahuluan dan Elusidasi Struktur
Produk hasil sintesis yang terbentuk dilakukan uji pendahuluan dengan menggunakan DAB-HCl. Kemudian dilanjutkan pengujian dengan KLT
menggunakan fase diam plat silika gel GF254 dan fase gerak n-heksana : etil asetat
(1:3). Kemudian produk hasil sintesis diuji secara organoleptis (bentuk dan warna), kelarutan, titik lebur, dan perhitungan rendemen senyawa hasil sintesis. Elusidasi struktur dilakukan dengan metode spektrofotometri inframerah,
spektrometri resonansi magnetik inti (1H dan 13C), dan kromatografi
gas-spektrometri massa yang dilakukan di Fakultas MIPA Universitas Gadjah Mada dan Institut Farmasetikal dan Nutrasetikal Malaysia.
Uji Aktivitas In Vitro
5
substrat dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 60 menit. Rancangan microwell plate secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 11.
Setelah inkubasi selesai, fluorosensi dari masing-masing sumuran dibaca dengan menggunakan Tecan Infinite 200 Pro Microplate Reader pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 393 nm. Hasil fluorosensi senyawa sampel, kontrol positif, dan kontrol negatif dikurangi dengan blanko dan akan didapatkan persentase aktivitas enzim dengan rumus
( x 100%). Persentase penghambatan enzim
MMP-9 didapatkan dengan rumus (100% - persentase aktivitas enzim (%)). Pada perhitungan IC50, dibuat seri larutan dengan 4 konsentrasi 50 µg/mL, 100 µg/mL,
200 µg/mL, dan 300 µg/mL. IC50 dihitung dengan menggunakan persamaan
non-regresi linier polinomial y = ax2 + bx + c yang didapatkan dari kurva hasil pengukuran seri larutan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-5
Senyawa turunan arilamida-5 disintesis dengan mengadaptasi farmakofor berupa cincin arilamida dengan perpanjangan rantai alkil. Pada posisi para cincin arilamida ditambahkan gugus sulfonamid-4-metilpirimidin yang bertujuan untuk mengeksplorasi fungsi gugus -OCF2 pada Compound 2 berdasarkan karakternya
yang bersifat penarik elektron sekaligus pendonor elektron. Pada penelitian ini, kedua karakter tersebut diwakili oleh gugus sulfonamid-4-metilpirimidin sehingga diharapkan memiliki kontribusi dalam aktivitas penghambatan terhadap MMP-9 .
yang elektropositif, sehingga amina primer dari sulfamerazin akan lebih mudah menyerang. Gugus amida dapat disintesis melalui beberapa metode, salah s
dengan mereaksikan amina primer dengan asil klorida sehingga Cl pada C
Gambar 2. Mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil sulfamerazin dan 3
Uji Pendahuluan
Produk awal sintesis yang dihasilkan berupa semisolid berwarna kuning. Produk masih berada
berupa asam klorida (HCl)
cincin arilamida, sehingga perlu dinetralkan dengan Na membentuk NaCl, H
kemudian dikeringkan dan menjadi
pada Gambar 3. Serbuk sulfamerazin berwarna putih dan serbuk senyawa turunan arilamida-5 berwarna kuning,
dilakukan. Perubahan oleh perpanjangan kromofor berwarna.
6
yang elektropositif, sehingga amina primer dari sulfamerazin akan lebih mudah Gugus amida dapat disintesis melalui beberapa metode, salah s
dengan mereaksikan amina primer dengan asil klorida sehingga Cl pada C karbonil akan tersubstitusi oleh amina. Reaksi SNA berlangsung ketika nu
2) yang memiliki pasangan elektron bebas dari sulfamerazin)
ang C karbonil pada 3-bromopropionil piridin dan gugus piridin yang menghasilkan senyawa turunan arilamida Mekanisme reaksinya ditunjukkan pada Gambar 2.
Mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SN
sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida menggunakan katalisator piridin
Produk awal sintesis yang dihasilkan berupa semisolid berwarna kuning. berada dalam pH asam, karena produk samping yang dihasilkan asam klorida (HCl). HCl dapat menghidrolisis gugus C karbonil pada cincin arilamida, sehingga perlu dinetralkan dengan Na2CO
membentuk NaCl, H2O, dan CO2 yang dapat dicuci dengan akuades.
kemudian dikeringkan dan menjadi serbuk berwarna kuning seperti ditunjukkan Serbuk sulfamerazin berwarna putih dan serbuk senyawa turunan 5 berwarna kuning, sehingga sintesis dinyatakan telah berhasil
Perubahan warna antara hasil sintesis dengan bahan awal
oleh perpanjangan kromofor (ikatan rangkap yang terkonjugasi) sehingga menjadi yang elektropositif, sehingga amina primer dari sulfamerazin akan lebih mudah Gugus amida dapat disintesis melalui beberapa metode, salah satunya dengan mereaksikan amina primer dengan asil klorida sehingga Cl pada C bromopropionil klorida menggunakan katalisator piridin
Produk awal sintesis yang dihasilkan berupa semisolid berwarna kuning. dalam pH asam, karena produk samping yang dihasilkan . HCl dapat menghidrolisis gugus C karbonil pada CO3 10% dengan
7
(a) (b)
Gambar 3. Produk hasil sintesis senyawa turunan arilamida-5 setelah dilakukan proses penetralan pH dan pengeringan (a) dan sulfamerazin (b)
Senyawa hasil sintesis diuji dengan DAB-HCl untuk identifikasi awal bahwa senyawa turunan arilamida-5 telah berhasil disintesis. Senyawa yang mengandung gugus amina primer akan bereaksi dengan DAB-HCl untuk membentuk basa Schiff yang berwarna jingga, sedangkan jika senyawa amina primer sudah tersubstitusi, maka tidak dapat bereaksi dengan DAB-HCl (Adegoke, 2011). Senyawa turunan arilamida-5 tidak menghasilkan basa Schiff jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi. Senyawa hasil sintesis sudah berwarna kuning sehingga perubahan intensitas warnanya tidak terlalu tampak ketika ditambahkan DAB-HCl. Hal ini telah berbeda dengan sulfamerazin yang berwarna jingga ketika bereaksi dengan DAB-HCl sehingga untuk sementara dapat disimpulkan produk sintesis sudah terbentuk. Mekanisme reaksi DAB-HCl dengan sulfamerazin ditunjukkan pada Lampiran 2 dan hasil reaksinya berupa produk berwarna jingga ditunjukkan pada Lampiran 3.
8
Hasil rendemen dari senyawa turunan arilamida-5 yang terbentuk adalah sebanyak 67,13%. Perhitungan rendemen ditunjukkan pada Lampiran 4. Rendemen yang dihasilkan sudah lebih dari 50% namun masih dapat dioptimasi dengan cara melakukan variasi metode sintesis seperti mol reaktan, suhu reaksi, dan waktu pengadukan pada penelitian selanjutnya.
Gambar 4. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-5 yang menunjukkan 2 noda yang berbeda, yaitu sulfamerazin (A) dan senyawa turunan arilamida-5 (B)
Setelah diperoleh senyawa turunan arilamida-5, produk diuji titik leburnya yang bertujuan untuk mengetahui titik lebur senyawa hasil sintesis dan mendukung kualitas kemurniannya. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa titik lebur produk hasil sintesis adalah 193-200ºC yang sudah berbeda dengan sulfamerazin yang memiliki titik lebur 234-238ºC (O’Neil et al., 2001). Sehingga dapat disimpulkan bahwa produk hasil sintesis berbeda dari senyawa awalnya yang dilihat dari perbedaaan jarak leburnya. Suatu senyawa dinyatakan murni jika jarak leburnya adalah 0,5-1,5ºC (Mohrig et al., 2014). Jarak lebur produk hasil sintesis adalah sebesar 7ºC, sehingga dapat disimpulkan bahwa masih terdapat impurities pada produk hasil sintesis. Hal ini disebabkan karena tidak dilakukan proses pemurnian kembali untuk mendapatkan senyawa hasil sintesis yang murni.
Selain organoleptis, uji warna, dan titik lebur juga dilakukan uji kelarutan senyawa, terutama untuk kepentingan pengujian secara spektroskopi. Uji kelarutan senyawa turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Tabel I. Dari hasil uji kelarutan, senyawa turunan arilamida-5 bersifat semipolar karena larut dalam pelarut semipolar, seperti DMSO.
B
A Rf= 0,55
9
Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-5 Pelarut Senyawa Turunan Arilamida-5
n-heksana tidak larut
Kloroform tidak larut Etil asetat tidak larut
Aseton agak sukar larut (1:80)
Etanol tidak larut
Air tidak larut
DMSO larut (1:20)
Elusidasi Struktur Terhadap Senyawa Turunan Arilamida-5 Spektrofotometri Inframerah
Elusidasi struktur yang dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri inframerah (IR) bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan gugus-gugus fungsional pada senyawa hasil sintesis. Gugus fungsional dengan momen dipol yang tinggi sangat efektif dalam menyerap radiasi IR, sehingga menyebabkan ikatannya bervibrasi secara mengulur (stretching) maupun menekuk (bending) (Supratman, 2010).
Hasil elusidasi struktur senyawa turunan arilamida-5 dan keberadaan gugus-gugus fungsionalnya dengan menggunakan spektrofotometri IR ditunjukkan pada Gambar 5. Berdasarkan spektrum yang dihasilkan, terdapat pita pada daerah dengan bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukkan gugus
karbonil (C=O). Gugus karbonil tersebut diprediksi sebagai gugus C=O amida pada daerah dengan ῡ 1597 cm-1. Keberadaan gugus amida tersebut juga diperkuat
dengan adanya pita yang melebar pada daerah dengan ῡ 3387–3479 cm-1 yang
diduga sebagai gugus -NH amida. Senyawa turunan arilamida-5 diprediksi telah terbentuk dengan dukungan pada daerah sidik jari dengan ῡ 500-1500 cm-1 yang
berbeda dengan daerah sidik jari sulfamerazin sebagai starting material yang ditunjukkan pada Gambar 6. Pada spektrum IR sulfamerazin tidak dijumpai pita ulur tajam pada daerah dengan ῡ 1500 cm-1. Pada daerah dengan bilangan
gelombang 3300 cm-1, pita gugus NH terlihat sebagai pita kembar yang tidak
10
Gambar 5. Spektrum IR senyawa turunan arilamida-5
Gambar 6. Spektrum IR sulfamerazin (diadaptasi dari Prajapat et al., 2018) Spektrometri Resonansi Magnetik Inti 1H dan 13C
Berdasarkan hasil uji kelarutan, senyawa turunan arilamida-5 larut dalam dimetilsufoksida (DMSO), sehingga digunakan DMSO-d6 sebagai pelarut pada pengujian dengan spektrometri resonansi magnetik inti 1H dan 13C. Elusidasi
struktur yang dilakukan dengan menggunakan spektrometri resonansi magnetik inti 1H dan 13C bertujuan untuk mengetahui kerangka hidrokarbon dari senyawa
hasil sintesis (Supratman, 2010). Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa
turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Gambar 7.
Sinyal pada geseran kimia 2,00–3,00 ppm merupakan daerah proton alkil (Vollhardt dan Schore, 2014). Sinyal pada geseran kimia 2,31 ppm (integrasi= 3) menunjukkan sinyal dari proton HG. Proton HG merupakan proton rantai alkil
11
yang berada pada gugus metil yang berdekatan dengan cincin pirimidin. Sinyal pada geseran kimia 2,31 ppm menunjukkan sinyal singlet (tunggal). Hal ini telah sesuai dengan teori, karena tidak memiliki proton tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda.
Sinyal pada geseran kimia 3,72 ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,87 ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) menunjukkan sinyal dari proton HA, sedangkan
sinyal yang terdapat pada geseran kimia 2,85 ppm (integrasi= 2) (J= 7 Hz) dan 2,98 ppm (integrasi= 2) (J= 7 Hz) menunjukkan sinyal dari proton HB. Dengan
munculnya set proton HA dan HB yang merupakan rantai etilen, menegaskan
bahwa senyawa turunan arilamida-5 telah terbentuk. Proton HA merupakan proton
pada rantai etilen yang berdekatan dengan atom halogen (Br), sedangkan proton HB merupakan proton pada rantai etilen yang berdekatan dengan gugus karbonil.
Proton HA terdapat pada geseran kimia yang lebih jauh daripada proton HB,
karena berdekatan dengan atom Br yang bersifat lebih elektronegatif dibandingkan dengan gugus karbonil pada amida sehingga proton HA kurang
terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded). Kedua sinyal tersebut seharusnya menunjukkan pola splitting masing-masing satu triplet, karena kedua set proton tersebut memiliki jumlah proton yang tidak ekuivalen secara magnetik sebanyak dua. Namun hasil penelitian menunjukkan adanya dua sinyal triplet pada jarak yang berdekatan untuk masing-masing proton HA dan HB. Hal ini
kemungkinan disebabkan oleh efek ikatan tunggal pada rantai etilen bersifat rotatable, sehingga pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang sama dapat memiliki lingkungan kimia yang berbeda. Hal ini menyebabkan setiap proton mengenali tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua sinyal triplet. Fenomena ini dipastikan dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut sebanding dengan dua proton. Nilai J coupling constant untuk kedua sinyal triplet tersebut adalah 6,3 dan 7 Hz, yang menunjukkan bahwa kedua set proton tersebut bertetangga secara langsung. Perbesaran spektrum proton HA dan HB ditunjukkan
pada Lampiran 5 dan 6.
12
sinyal yang berbeda, yaitu pada 7,62 ppm (integrasi= 1) (J= 8,4 Hz); 7,76 ppm (integrasi= 2) (J= 8,4 Hz); 7,93 ppm (integrasi= 2) (J= 9,1 Hz); dan 8,31 ppm (integrasi= 1) (J= 5,6 dan 6,3 Hz).
Sinyal pada geseran kimia 7,76 ppm menunjukkan proton HC, sedangkan
sinyal pada geseran kimia 7,93 ppm merupakan proton HD. Proton HC dan HD
merupakan proton yang berada pada gugus benzena cincin arilamida. Proton HC
lebih terlindungi (shielded) dibandingkan dengan proton HD, karena proton HC
berada pada lingkungan kimia yang berdekatan dengan gugus NH yang memiliki karakter EWG yang lebih lemah dibandingkan dengan gugus O=S=O yang berdekatan dengan proton HD. Sinyal pada geseran kimia 7,76 ppm dan 7,93 ppm
menunjukkan sinyal doublet. Hal ini telah sesuai dengan teori, karena memiliki satu proton tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda. Perbesaran spektrum proton HC dan HD ditunjukkan pada Lampiran 7.
Sinyal pada geseran kimia 7,62 ppm menunjukkan proton HF, sedangkan
sinyal pada geseran kimia 8,31 ppm merupakan proton HE. Proton HF dan HE
merupakan proton yang berada pada cincin pirimidin. Proton HF terletak pada
posisi para dari gugus sulfonamida sehingga lebih terlindungi dari medan magnet luar (shielded). Sementara itu, proton HE kurang terlindungi dari medan magnet
luar (de-shielded) dibandingkan dengan proton HF, karena terletak pada posisi
meta dari gugus sulfonamida. Sinyal pada geseran kimia 7,62 ppm menunjukkan sinyal doublet. Hal ini telah sesuai dengan teori, karena memiliki satu proton tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda. Sinyal pada geseran kimia 8,31 ppm menunjukkan sinyal triplet. Hal ini tidak sesuai dengan teori yang seharusnya muncul sebagai sinyal doublet, karena memiliki satu proton tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda. Namun, fenomena ini mungkin terjadi disebabkan oleh long range coupling. Fenomena ini muncul, karena antara proton HE dan salah satu atom H pada HG terhubung oleh rantai hidrokarbon yang
membentuk seperti huruf ‘W’, sehingga jaraknya semakin mendekat dan dapat merasakan proton tetangga yang jauh. Proton ini muncul sebagai triplet, karena bisa merasakan dua proton tetangga yang berasal dari HF dan HG (Dona et al.,
13
Gambar 7. Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa turunan arilamida-5
Spektrometri resonansi magnetik inti 13C hanya dapat digunakan untuk
mengindikasikan pergeseran kimia dan tidak mengindikasikan pola splitting, integrasi, dan J coupling constant. Hal ini disebabkan karena 13C memiliki momen
magnetik yang rendah yaitu 67,28% radians/Tesla. Selain itu, kelimpahan 13C di
alam sangat rendah, yaitu sebesar 1,08% sehingga menyebabkan pola splitting dan integrasi menjadi tidak spesifik (Pavia et al., 2015). Spektrum resonansi magnetik inti 13C senyawa turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Gambar 8.
Menurut tabel geseran kimia untuk spektrometri resonansi magnetik inti
13C, rantai alkil berada pada rentang geseran kimia 10,0-60,0 ppm (Vollhardt dan
Schore, 2014). Atom CM berada pada geseran kimia 22,8 ppm yang menunjukkan
atom C pada alkil yang berdekatan dengan cincin pirimidin. Atom CB berada pada
geseran kimia 28,3 ppm yang menunjukkan atom C yang berdekatan dengan gugus karbonil pada amida, sedangkan atom CA berada pada geseran kimia 39,4
ppm yang menunjukkan atom C yang berdekatan dengan atom Br yang bersifat elektronegatif dibandingkan dengan gugus karbonil pada amida sehingga kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded).
14
merupakan atom C yang terletak pada gugus benzena cincin arilamida. Atom CE
berada pada geseran kimia 111,4 ppm, sedangkan atom CF pada 127,2 ppm. Atom
CF kurang terlindungi dibandingkan dengan atom CE, karena atom CF terletak
berdekatan dengan gugus O=S=O yang memiliki karakter EWG yang lebih kuat daripada gugus NH yang berdekatan dengan atom CE. Atom CD berada pada
geseran kimia 129,4 ppm, sedangkan atom CG pada 168,1 ppm. Atom CG kurang
terlindungi dibandingkan dengan atom CD, hal ini juga disebabkan karena atom
CG berdekatan dengan gugus O=S=O yang memiliki karakter EWG yang lebih
kuat daripada gugus NH yang berdekatan dengan atom CD.
Pada cincin pirimidin, terdapat atom CI, CJ, CK, dan CL yang berada pada
geseran kimia 156,3 ppm; 142,1 ppm; 117,6 ppm; dan 128,5 ppm secara berturut-turut. Atom CK paling terlindungi (shielded) dibandingkan dengan ketiga atom C
lainnya pada cincin pirimidin, karena atom CK tidak berdekatan dengan atom
elektronegatif. Atom CL berikatan dengan atom N yang bersifat elektronegatif dan
gugus metil, sehingga lebih terlindungi dibandingkan dengan atom CJ yang
berikatan dengan atom N dan atom H. Hal ini disebabkan, karena gugus metil bersifat EDG dibandingkan dengan atom H. Atom CI paling tidak terlindungi
(de-shielded), karena atom CI berikatan dengan atom N heterosiklik yang bersifat
EWG.
C karbonil (C=O) amida berada pada rentang geseran kimia 150,0-180,0 ppm (Silverstein et al., 2005). Hasil elusidasi struktur menunjukkan bahwa atom C pada amida berada pada geseran kimia 168,3 ppm yaitu atom CC sehingga telah
sesuai dengan teori.
15
Gambar 8. Spektrum resonansi magnetik inti 13C senyawa turunan arilamida-5
Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
senyawa turunan arilamida Kromatogram dari produk hasil si
Gambar 9. Kromatogram hasil kromatografi gas senyawa turunan arilamida dengan intensitas relatif A
Bobot molekul dari puncak yang terpisah akan dideteksi dengan spektrometer massa yang menunjukkan
334. Bobot molekul utuh produk hasil sintesis seharusnya adalah 399. Kehilangan massa relatif per ion sebesar 65 diduga akibat fenomena fragmentasi SO Fenomena yang unik dari setiap senyawa yang memiliki gugus sulfonamid adalah selalu terjadi proses fragmentasi SO
amina pada sulfonamida yang terikat pada terlepas sebagai m/z 65
ulang ini dapat dilihat pada
menunjukkan fragmentasi yang paling banyak te massa relatif per ion sebesar
peak dapat dilihat pada
Gambar 10
16
senyawa turunan arilamida-5, karena memiliki intensitas relatif yang paling tinggi. Kromatogram dari produk hasil sintesis ditunjukkan pada Gambar 9
Kromatogram hasil kromatografi gas senyawa turunan arilamida dengan intensitas relatif A (15%), B (22,5%), dan C (62,5
Bobot molekul dari puncak yang terpisah akan dideteksi dengan spektrometer massa yang menunjukkan massa relatif per ion (m/z)
Bobot molekul utuh produk hasil sintesis seharusnya adalah 399. Kehilangan massa relatif per ion sebesar 65 diduga akibat fenomena fragmentasi SO Fenomena yang unik dari setiap senyawa yang memiliki gugus sulfonamid adalah selalu terjadi proses fragmentasi SO2 diikuti dengan penataan ulang gugus
sulfonamida yang terikat pada posisi para dari benzena
terlepas sebagai m/z 65 (Sun et al., 2008). Mekanisme fragmentasi dan penataan ilihat pada Lampiran 9. Fragmen yang tertinggi (
menunjukkan fragmentasi yang paling banyak terjadi dan stabil yang
massa relatif per ion sebesar 55. Mekanisme fragmentasi yang menghasilkan dapat dilihat pada Lampiran 10.
Gambar 10. Spektrum massa senyawa turunan arilamida
C
A B
yang paling tinggi. ntesis ditunjukkan pada Gambar 9.
Kromatogram hasil kromatografi gas senyawa turunan arilamida-5 62,5%)
Bobot molekul dari puncak yang terpisah akan dideteksi dengan (m/z) terbesar adalah Bobot molekul utuh produk hasil sintesis seharusnya adalah 399. Kehilangan massa relatif per ion sebesar 65 diduga akibat fenomena fragmentasi SO2.
Fenomena yang unik dari setiap senyawa yang memiliki gugus sulfonamida diikuti dengan penataan ulang gugus dari benzena setelah SO2
., 2008). Mekanisme fragmentasi dan penataan . Fragmen yang tertinggi (base peak) yang muncul pada 55. Mekanisme fragmentasi yang menghasilkan base
17
Secara keseluruhan berdasarkan hasil elusidasi struktur dengan spektrofotometri inframerah, spektrometri resonansi magnetik inti 1H dan 13C, dan
kromatografi gas-spektrometer massa dapat disimpulkan bahwa produk hasil sintesis dipastikan strukturnya sebagai senyawa turunan arilamida-5.
Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim MMP-9
Setelah senyawa turunan arilamida-5 berhasil disintesis, dilakukan uji aktivitas in vitro untuk melihat aktivitas penghambatannya terhadap enzim MMP-9. Enzim MMP-9 merupakan suatu protease, sehingga dapat memotong ikatan peptida pada substrat melalui aktivitas proteolisis. Substrat yang digunakan dalam pengujian merupakan suatu peptida yang terikat dengan gugus fluorofor. Enzim MMP-9 akan memotong ikatan peptida pada substrat, sehingga fluorofor akan terlepas dan terbaca fluorosensinya ketika dilakukan pengukuran dengan menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang 325/393 nm yang menunjukkan aktivitas enzim. Semakin tinggi fluorosensi yang terbaca menunjukkan semakin tinggi pula aktivitas enzim dalam memotong ikatan peptida pada substrat (Nicolotti, 2012).
Senyawa turunan arilamida-5 memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim MMP-9 yang ditunjukkan dengan persentase penghambatan sebesar 93% pada konsentrasi 200 µg/mL. Senyawa turunan arilamida-5 menunjukkan persentase penghambatan lebih dari 50 %, sehingga dapat ditentukan nilai IC50
-nya. IC50 merupakan konsentrasi terkecil dari sampel yang dapat menghambat
aktivitas enzim sedikitnya 50%. Nilai IC50 didapatkan dengan membuat 4 seri
konsentrasi larutan, yaitu 50, 100, 200, dan 300 µg/mL. Kurva hubungan log konsentrasi turunan arilamida-5 dengan persentase inhibisi ditunjukkan pada Gambar 9. Kurva tersebut menunjukkan peningkatan konsentrasi sampel proporsional terhadap persentase inhibisi enzim MMP-9. Secara statistik, korelasi dapat dikatakan kuat karena memiliki r2 sebesar 0,989. Berdasarkan non-regresi linier polinomial, diperoleh persamaan y = -169,6x2 + 807,6x – 878,0. y adalah persentase inhibisi dan x adalah log konsentrasi sampel. Untuk mendapatkan nilai IC50, angka 50 dimasukkan sebagai y sehingga diperoleh x sebagai konsentrasi
18
(2013), spektrum aktivitas secara umum untuk aktivitas biologi dari suatu senyawa dibagi menjadi 6 yaitu <1 µM (sangat aktif), 1-25 µM (aktif), 25-50 µM (sedang), 50-100 µM (rendah), 100-500 µM (sangat rendah), dan >500 µM (tidak aktif). IC50 yang terhitung adalah 199 µM sehingga aktivitas dari senyawa turunan
arilamida-5 termasuk dalam kategori aktivitas rendah. Namun Zhu et al., (2013) juga menyebutkaan dalam review-nya bahwa terdapat 56 publikasi penelitian yang menyatakan bahwa IC50 100-500 µM sudah dapat dikatakan aktif untuk studi
pendahuluan seperti yang dilakukan dalam penelitian ini. Sintesis dan uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5 merupakan studi pendahuluan yang belum pernah dilakukan sebelumnya. Sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa turunan arilamida-5 aktif dalam menghambat enzim MMP-9 secara in vitro. Tabel II menyajikan pengolahan data uji aktivitas in vitro arilamida-5.
Tabel II. Perhitungan %penghambatan turunan arilamida-5 terhadap MMP-9 Sampel Reading 1 Reading 2 Reading 3 Purata
Blanko 9683 9349 9217 9416
Kontrol Negatif 32989 33687 30321 32332
19
Gambar 11. Kurva hubungan log konsentrasi turunan arilamida-5 dengan %penghambatan
KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa turunan arilamida-5 dapat disintesis dengan mereaksikan sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA). Senyawa turunan arilamida-5 memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim MMP-9 setelah melalui uji in vitro. Pada uji aktivitas in vitro menunjukkan persentase penghambatan sebesar 93% pada konsentrasi 200 µg/mL dan nilai IC50
sebesar 199 µM dalam menghambat aktivitas enzim MMP-9 sedikitnya 50%. SARAN
Berdasarkan hasil dari uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5 dalam menghambat enzim MMP-9, dapat dilakukan penelitian lebih lanjut yaitu uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5 pada sel kanker payudara MDA MB-231.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis berterima kasih kepada Indonesia Toray Science Foundation (ITSF) Periode 2017-2018 dan Divisi Penelitian & Pengembangan BEMF Farmasi USD 2018 atas dukungan dana untuk penelitian ini.
20
DAFTAR PUSTAKA
Adegoke, O.A., 2011. Analytical, Biochemical, and Synthetic Applications of
Para-Dimethylaminobenzaldehyde. International Journal of
Pharmaceutical Sciences Review and Research, 11 (2), 17-29.
Adhipandito, C.F., 2017. Sintesis Analog Purin (FFUSD-001) dan Studi In Silico Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 Hemopexin Domain sebagai
Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.
Arifiyanto, A., 2001. Pengaruh Penambahan Basa Natrium Hidroksida dan Piridin
dalam Sintesis Benzoilanilida. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.
Alford, V.M., Kamath, A., Ren, X., Kumar, K., Gan, Q., Awwa, M., et al., 2017.
Targeting the Hemopexin-like Domain of Latent Matrix Metalloproteinase-9 (proMMP-9) with a Small Molecule Inhibitor
Prevents the Formation of Focal Adhesion Junctions. ACS Chemical
Biology, 12, 1-44.
Bauvois, B., 2012. New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers: Outside-in signaling and relationship to tumor
progression. Biochimica et Biophysica Acta, 1825, 29-36.
Cathcart, J., Pulkoski-Gross, A., dan Cao, J., 2015. Targeting matrix Veselkov, K., dan Everettc, J.R., 2016. A guide to the identification of
metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural
Biotechnology Journal, 19.
Dufour, A., Zucker, S., Sampson, N.S., Kuscu, C., dan Cao, J., 2010. Role of Matrix Metalloproteinase-9 Dimers in Cell Migration: Design of
Inhibitory Peptides. Journal of Biological Chemistry, 285 (46),
35944-35956.
Dufour, A., Sampson, N.S., Li, J., Kuscu, C., Rizzo, R.C., DeLeon, J.L., et al.,
2011. Small-Molecule Anticancer Compounds Selectively Target the
Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9. Cancer Research, 71
(14), 4977-4988.
Koltunov, K.Y., Sobolev, V.I., dan Bondareva, V.M., 2016. Oxidation, oxidative esterification and ammoxidation of acrolein over metal oxides: Do these
reactions include nucleophilic acyl substitution?. Catalysis Today, 279,
1-5.
Ludji, D.P.K.S., 2017. Sintesis Analog Purin (FUSD-002) dan Studi In Silico Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 Hemopexin Domain sebagai
21
Mehner, C., Hockla, A., Miller, E., Ran, S., Radisky, D.C., dan Radisky, E.S., 2014. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast
cancer. Oncotarget, 5 (9), 2736-2749.
Merdad, A., Karim, S., Schulten, H.J., Dallol, A., Buhmeida, A., Al-Thubaity, F., et al., 2014. Expression of Matrix Metalloproteinases (MMPs) in Primary Human Breast Cancer: MMP-9 as a Potential Biomarker for Cancer
Invasion and Metastasis. Anticancer Research, 34, 1355-1366.
Mohrig, J.R., Alberg, D.G., Hofmeister, G.E., Schatz, P.F., dan Hammond, C.N.,
2014. Laboratory Techniques in Organic Chemistry: Supporting
Inquiry-Driven Experiments. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. USA.
Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A., et
al., 2012. Design, synthesis and biological evaluation of hydroxy,
5-substituted pyrimidine-2,4,6-triones as potent inhibitors of gelatinases MMP-2 and MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry, 58, 368-376.
O’Neil, M.J., Smith,A., Heckelman, P.E., Obenchain Jr., J.R., Gallipeau, J.A.R., et al., 2001. The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. 13th Edition. MERC & CO., INC. 1406.
Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S., dan Vyvyan, J.R., 2015. Introduction To
Spectroscopy. 5th Edition. Cengage Learning. United States of America.
Pecorino, L., 2012. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and
Therapeutics. 3rd Edition. Oxford University Press. United Kingdom. Prajapat, G., Gupta, R., dan Bhojak, N., 2018. Thermal, Spectroscopic and
Antimicrobial Properties of Novel Nickel (II) Complexes with
Sulfanilamide and Sulfamerazine Drugs. Chemical Science International
Journal., 24 (2), 1-13.
Silverstein, R.M., Webster, F.X., dan Kiemle, D.J., 2005. Spectrometric
Identification of Organic Compound. 7th Edition. John Wiley & Sons, Inc. USA.
Sun, M., Dai, W., dan Liu, Q.D., 2008. Fragmentation of aromatic sulfonamides
in electrospray ionization mass spectrometry: elimination of SO2 via
rearrangement. Journal of Mass Spectrometry, 43, 383-393.
Supratman, U., 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Widya Padjadjaran.
Indonesia.
Triono, S., 2007. Konsultasi GC-MS. Wawancara oleh Maywan Hariono pada
tahun 2007 di Fakultas MIPA Kimia Universitas Gadjah Mada.
Vandenbroucke, R.E., dan Libert, C., 2014. Is there new hope for therapeutic
22
Vollhardt, P. dan Schore, N., 2014. Organic Chemistry Structure and Function.
7th Edition. W. H. Freeman and Company. USA.
Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., dan Gaboury, L.A., 2014. MMP-9
expression varies according to molecular subtypes of breast cancer. BMC
Cancer, 14 (609), 1–12.
Zhu, T., Cao, S., Su, P.C., Patel, R., Shah, D., Chokshi, H.B., et al., 2013. Hit
Identification and Optimization in Virtual Screening: Practical
Recommendations Based Upon a Critical Literature Analysis. Journal of
LAMPIRAN
Lampiran 1. Tahap sintesis senyawa turunan a proses pengadukan selama 30 menit
Lampiran 2. Mekanisme reaksi antara sulfamerazin dengan DAB membentuk basa Schiff yang berwarna jingga
23
ahap sintesis senyawa turunan arilamida-5 setelah dilakukan oses pengadukan selama 30 menit
Mekanisme reaksi antara sulfamerazin dengan DAB asa Schiff yang berwarna jingga
5 setelah dilakukan
24
Lampiran 3. Hasil uji DAB-HCl dengan sulfamerazin (A) dan senyawa turunan arilamida-5 (B). Pembentukan basa Schiff ditandai dengan warna jingga
Lampiran 4. Perhitungan Bahan Sintesis dan Hasil Rendemen Senyawa Turunan Arilamida-5
Perhitungan bahan:
1. Sulfamerazin digunakan x 3,59 mmol = 0,00359 mol Berat molekul = 264,30 g/mol
0,00359 mol x 264,30 g/mol = 0,95 g 2. Piridin digunakan x 7,18 mmol = 0,00718 mol
Berat molekul = 79,1 g/mol Massa jenis = 0,982 g/mL
0,00718 mol x 79,1 g/mol = 0,57 g atau 0,57 g:0,982 g/mL = 0,58 mL 3. 3-bromopropionil klorida digunakan x 5,39 mmol = 0,00539 mol
Berat molekul = 171,418 g/mol Massa jenis = 1,701 g/mL
0,00539 mol x 171,418 g/mol = 0,92 g atau 0,92 g:1,701 g/mL = 0,61 mL Hasil rendemen:
Senyawa turunan arilamida-5 yang seharusnya (teoritis) = 0,00359 mol x 399,225 g/mol = 1,43 g
Senyawa turunan arilamida-5 = x 100% = , , x 100% = 67,13 %
25
Lampiran 5. Perbesaran pada sinyal 2,85 ppm (integrasi= 2) dan 2,98 ppm (integrasi= 2) menunjukan sinyal triplet of triplet. Integrasi= 2 menandakan bahwa terdapat 2 atom H yang terdeteksi yaitu proton HB dari senyawa turunan
arilamida-5
Lampiran 6. Perbesaran pada sinyal 3,72 ppm (integrasi= 2) dan 3,87 ppm (integrasi= 2) menunjukan sinyal triplet of triplet. Integrasi= 2 menandakan bahwa terdapat 2 atom H yang terdeteksi yaitu proton HA dari senyawa turunan
26
Lampiran 7. Perbesaran pada sinyal 7,76 ppm (integrasi= 2) dan 7,93 ppm (integrasi= 2) menunjukan sinyal doublet. Integrasi= 2 menandakan bahwa terdapat 2 atom H yang terdeteksi yaitu proton HC (7,76 ppm) dan HD (7,93 ppm)
dari senyawa turunan arilamida-5
Lampiran 8. Perbesaran pada sinyal 7,62 ppm (integrasi= 1) dan 8,31 ppm (integrasi= 1) menunjukan sinyal doublet dan triplet. Integrasi= 1 menandakan bahwa terdapat 1 atom H yang terdeteksi yaitu proton HE (8,31 ppm) dan HF (7,62
Lampiran 9. Mekanisme pada kromatografi gas
Lampiran 10. Mekanisme arilamida-5 pada kromatografi gas
27
Mekanisme pola fragmentasi m/z 334 senyawa turunan arilamida pada kromatografi gas-spektrometri massa
Mekanisme pola fragmentasi base peak m/z 55 senyawa turunan 5 pada kromatografi gas-spektrometri massa
senyawa turunan arilamida-5
28
Lampiran 11. Rancangan microwell plate untuk uji aktivitas in vitro
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
29
Lampiran 12. Perhitungan Nilai IC50 Senyawa Turunan Arilamida-5
1. Perhitungan purata dari 3 reading semua sampel
Sampel Reading 1 Reading 2 Reading 3 Purata
Blanko 9683 9349 9217 9416
Kontrol Negatif 40684 41975 41625 41428
Konsentrasi 50 µg/mL 42337 41688 37109 40378 Konsentrasi 100 µg/mL 18355 25247 21114 21572 Konsentrasi 200 µg/mL 17306 16518 16267 16697 Konsentrasi 300 µg/mL 15205 15348 13311 14621
2. Perhitungan persentase aktivitas enzim dan persentase inhibisi enzim
Sampel Purata - Blanko Enzim (%) Aktivitas Enzim (%) Inhibisi
3. Perhitungan log konsentrasi sebagai x dan persentase inhibisi enzim sebagai y untuk kurva regresi non linier
Konsentrasi Sampel Log Konsentrasi (x) %Inhibisi Enzim (y)
30 300
µg/mL
R1 15205 5789 18 82
4
R2 15348 5932 19 81
R3 13311 3895 12 88
5. Persamaan regresi non linier y = 50 untuk IC50
y = -169,6x2 + 807,6x – 878,0 50 = -169,6x2 + 807,6x – 878,0 0 = -169,6x2 + 807,6x – 878,0 - 50 0 = -169,6x2 + 807,6x – 928
6. Perhitungan nilai IC50
X1,2 = ±√
X1,2 = , ± ,( (, ) , )( )
X1,2 = , ±√ ,, ,
X1,2 = , ±√, ,
X1,2 = , ±, ,
X1 = , , , ; X2 = , , ,
X1 = ,, ; X2 = ,,
X1 = 1,9 ; X2 = 2,8
AntiLog X1 = 101,9 = 79,4 ppm
AntiLog X2 = 102,8 = 631 ppm
7. Perhitungan nilai IC50 dalam satuan mikromolar (µM)
X = x 1000
X1 = , x 1000 = 199 µM
31
BIOGRAFI PENULIS
