Lampiran 1 Prosedur uji aktivitas protease (Walter 1984, modifikasi)

(1)

Lampiran 1 Prosedur uji aktivitas protease (Walter 1984, modifikasi)

Pereaksi

Blanko (ml) Standard (ml)

Contoh ml)

Penyangga Tris-HCl (0.2 M) pH 7.5

Substrat Kasein 1%

Enzim ekstrak kasar

Akuades steril

Tirosin standar (5mM)

1

1 -

0.2

1

1 -

-

0.2

1

0.2 -

-

Diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit

Asam trikloroasetat (10%)

Akuades steril

Ekstrak kasar enzim

2 -

0.2

2

0.2 -

2

0.2 -

Dinkubasi pada suhu 10

0

C selama 10 menit selanjutnya disentrifugasi dengan

kecepatan 8600 xgselama 15 menit

Filtrat

Na

2

CO

3

Folin Ciocalteau (1:2)

(0.5 M)

1.5

5

1

1.5

5

1

1.5

5

1 Dikocok kuat dan didiamkan selama 15 menit, absorbansi diukur pada

λ

= 578 nm

A contoh - A blanko

Unit Aktivitas (UA) = x P x 1/T

A standar - A blanko

Keterangan :

UA

= Unit aktivitas (jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu

mikromol produk tirosin permenit, pada kondisi uji)

A contoh

= nilai absorbansi contoh

A standar = nilai absorbansi standar

A blanko

= nilai absorbansi blanko

P

= faktor pengenceran

T

= waktu inkubasi

(2)

Lampiran 2 Prosedur uji aktivitas amilase (Bernfeld 1959)

Pereaksi

Blanko (mL) Standar (mL)

Contoh (mL)

Substrat (pati

terlarut 1%)

1

1 Enzim

-

1 DNS

-

1 -

Aquades

1 -

-

Dikocok dan diinkubasi 10 menit pada suhu ruang

DNS

1 -

1 Enzim

-

1 -

Dikocok dan dipanaskan pada 100

0

C selama 5 menit, kemudian didinginkan

dalam air selama 20 menit, diukur absobansi pada

λ

= 550 nm

Konsentrasi maltosa sampel x FP

UA =

BM maltosa x Vx T

Keterangan :

UA = unit aktivitas enzim

FP = faktor pengenceran

BM = berat molekul ( BM maltosa =360.32 Da)

V = volume sampel enzim

T = waktu inkubasi

(3)

Kurva Standar Maltosa

Konsentrasi Maltosa

(ppm)

Absorban rata-rata

(l=550 nm)

Absorban terkoreksi (l=

550 nm)

0

100

200

300

400

500

0.047

0.571

0.654

0.7

0.794

0.850

0

0.098

0.181

1.227

0.322

0.377 Persamaan regresi linear Y = 0.074X – 0.059

y = 0,074x - 0,059 R² = 0,990 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0 100 200 300 400 500

(4)

Kurva standar protein

Kosentrasi BSA

(mg mL

-1

Absorban rata-rata

)

(

λ

=595 nm)

Absorban terkoreksi

(

λ

= 595 nm)

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.24

0.32

0.36

0.41

0.46

0.53

0

0.08

0.12

0.18

0.22

0.29

y = 2.7316x + 0.0169 R2_{= 0.98} 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 0,05 0,1 0,15 A bs or ba n si ( λ = 550 nm ) Konsentrasi BSA (mg mL-1₎

(5)

Lampiran 3 Pertumbuhan sepuluh Bacillus terseleksi pada media pakan udang

(SF) 1.2 %

Kode isolat Jumlah sel (CFU mL-1)*

0 jam 24 jam 48 jam

L3 9.0 x 105 3.0 x 1011 2.3 x 1013 L5 2.3 x 105 4.8 x 1012 2.7 x 1013 KAt 5.1 1.2 x 106 4.5 x 1010 5.6 x 1012 KPs 7.1.2b 8.5 x 105 2.1 x 1010 4.9 x 1012 KAs 7.1.2 2.6 x 105 2.1 x 1011 3.5 x 1013 DP 5.1.1 4.2 x 105 5.5 x 1011 2.9 x 1012 DP 5.1.2 1.9 x 106 9.9 x 1010 1.2 x 1011 DA 2.2.1 3.4 x 105 8.3 x 1011 3.3 x 1010 DA 5.2.3 1.4 x 105 9.6 x 1011 6.5 x 1013

* Jumlah rata-rata dari 2 ulangan

Lampiran 4 Aktivitas protease Bacillus sp. L5 dan DA 5.2.3

Kode

Waktu (jam)

Aktivitas

(U mL-1

Kadar Protein

)

(mg mL

-1

Aktivitas

Spesifik

)

( U mg

-1

)

L5 DA 5.2.3 24 1.22 ± 0.02 1.60 ± 0.093 0.05 ± 0.0 0.04 ± 0.0 25.3 ± 0.32 36.72 ± 1.05 L5 DA 5.2.3 48 1.41± 0.013 2.0 ± 0.137 0.06 ± 0.0 0.04 ± 0.0 22.90 ± 1.91 40.9 3 ± 9.19 L5 DA 5.2.3 72 0.74 ± 0.005 1.72 ± 0.100 0.06 ± 0.0 0.07 ± 0.0 11.46 ± 0.35 26.32 ± 0.11 L5 DA 5.2.3 96 1.03±0.001 1.7 ± 0.121 0.05 ± 0.0 0.06 ± 0.0 20.03 ± 0.05 30.06 ± 2.06

(6)

Lampiran 5 Aktivitas amilase Bacillus sp. L5 dan DA 5.2.3

Kode

Waktu (jam)

Aktivitas

(U mL-1

Kadar Protein

)

(mg mL

-1

Aktivitas

Spesifik

)

( U mg

-1

)

L5 DA 5.2.3 24 0.45 ± 0.07 2.06 ± 0.04 0.05 ± 0.0 0.04 ± 0.0 9.11 ± 1.38 47.27 ± 1.50 L5 DA 5.2.3 48 0.38 ± 0.01 1.51 ± 0.00 0.06 ± 0.0 0.04 ± 0.0 6.29 ± 0.27 35.17 ± 0.32 L5 DA 5.2.3 72 0.05 ± 0.01 1.19 ± 0.07 0.06 ± 0.0 0.07 ± 0.0 0.79 ± 0.09 18.47 ± 1.40 L5 DA 5.2.3 96 0 0.20 ± 0.121 0.05 ± 0.0 0.06 ± 0.0 0 3.54 ± 0.64

(7)

Lampiran 6 Pengaruh waktu produksi protease, amilase dan pertumbuhan sel

Bacillus sp. DA 5.2.3

Lampiran 7 Aktivitas protease Bacillus sp. DA 5.2.3 pada rentangan pH

pH Aktivitas (U mL-1

Kadar Protein ) (mg mL-1

Aktivitas Spesifik Aktivitas Relatif ) (U mg-1) (%) 6 7 8 9 0.22 ± 0.01 0.76 ± 0 2.10 ± 0.08 0.50 ± 0.01 0.06 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.06 ± 0.01 0.07 ± 0.01 3.53 ± 0.62 11.15 ± 1.14 33..35 ± 4.26 7.11 ± 1.33 10.66 ± 0.50 33.53 ± 0.85 100 ± 0 21.75 ± 1.21

Lampiran 8 Aktivitas amilase Bacillus sp. DA 5.2.3 pada rentangan pH

pH Aktivitas

(U mL-1 )

Kadar Protein Aktivitas Spesif (mg mL-1) (U mg-1 Aktivitas Relatif ) (%) 6 7 8 9 2.35 ± 0.17 1.08 ± 0.01 1.16 ± 0.11 0.60 ± 0.29 0.06 ± 0.01 40.09 ± 7.58 0.07 ± 0.01 16.00 ± 1.83 0.06 ± 0.01 18.44 ± 0.07 0.0 7± 0.01 9.87 ± 6.09 100 ± 0 40.49 ± 3.09 47.73 ± 9.20 22.55 ± 10.39

Lampiran 9 Aktivitas protease Bacillus sp. DA 5.2.3 pada rentangan salinitas

Waktu (jam) Aktivitas Amilase (U mL-1 Aktivitas Spesifik ) Potease (U mg-1 Aktivitas Protease ) (U mL-1 Aktvitas Spesifik Protease ) (U mg-1 Jumlah sel ) (log CFU mL-1) 12 24 36 48 60 72 84 96 1.02 ± 0.13 1.22 ± 0.08 0.90 ± 0.24 0.77 ± 0.10 1.16 ± 0.23 0.8 ± 0.07 0.78 ± 0.05 0.44 ± 0.07 21.60 ± 2.79 22.5 ± 0.74 16.7 ± 3.73 16.7 ± 3.5 17.38 ± 3.84 11.85 ± 0.77 14.0 ± 1.48 7.12 ± 1.03 0.12 ± 0.01 0.2 ± 0.013 0.5 ± 0.03 1.1 ± 0.01 0.8 ± 0.04 0.4 ± 0.02 0.6 ± 0.01 0.4 ± 0.06 0.12 ± 0.01 0.18 ± 0.01 0.50 ± 0.03 1.07 ± 0.01 0.80 ± 0.04 0.37 ± 0.02 0.61 ± 0.01 0.42 ± 0.06 8.38 ± 0.12 9.34 ± 0.04 12.07 ± 0.31 13.00 ± 0.27 13.80 ± 0.33 13.73 ± 0.2 0.54 ± 0.36 0.83 ± 0.39

(8)

Salinitas

Aktivitas Kadar Protein (U ml-1 Aktivitas Spesifik ) (mg mL-1) (U mg-1 Aktivitas Relatif ) (%) 0 1.5 2.5 3.5 0.74 ± 0.04 0.62 ± 0.01 0.41 ± 0.00 0.51 ± 0.02 0.06 ± 0.01 13.29 ± 0.94 0.07 ± 0.01 9.65 ± 0.42 0.06 ± 0.01 7.92 ± 0.84 0.07 ± 0.01 8.80 ± 0.88 100 ± 0 73.18 ± 8.31 60.32 ± 10.58 66.10 ± 1.96

Lampiran 10 Aktivitas amilase Bacillus sp. DA 5.2.3 pada rentangan salinitas

Salinitas (%)

Aktivitas (U mL-1

Kadar Protein Aktivitas Spesifik ) (mg mL-1) (U mg-1 Aktivitas Relatif ) (%) 0 1.5 2.5 3.5 0.77 ± 0.03 1.56 ± 0.02 1.03 ± 0.03 0.71 ± 0.00 0.06 ± 0.01 13.72 ± 0.29 0.07 ± 0.01 24.21 ± 0.84 0.06 ± 0.01 20.12 ± 2.62 0.07 ± 0.01 12.21 ± 0.82 56.69 ± 0.75 100 ± 0 82.83 ± 7.94 50.59 ± 5.13

Lampiran 11 Stabilitas protease Bacillus sp. DA 5.2.3 pada pH 8, salinitas 0

(kondisi optimum reaksi enzim)

Waktu nkubasi (jam) Aktivitas Protease (U ml-1 Aktivitas Relatif ) (%)

0

0.12 ± 0.01 100 ± 0

1

0.16 ± 0.01 133.03 ± 8.59

2

0.47 ± 0.04 384.08 ± 43.08

3

0.30 ± 0.01 245.75 ± 10.50

4

0.28 ± 0.04 227.10 ± 28.69

5

0.23 ± 0.01 187.75 ± 3.62

6

0.19 ± 0.02 150.07 ± 14.89

Lampiran 12 Stabilitas protease Bacillus sp. DA 5.2.3 pada kondisi umum

tambak udang (pH 8, salinitas 2.5%)

Waktu Inkubasi (jam) Aktivitas Protease (U ml-1 Aktivitas Relatif ) (%) 0 1 2 3 4 5 6 0.70 ± 0.00 0.56 ± 0.02 0.58 ± 0.01 0.46 ± 0.01 0.32 ± 0.02 0.27 ± 0.02 0.17 ± 0.03 100 ± 0 80.29 ± 9.13 82.22 ± 5.78 65.28 ± 5.44 57.20 ± 2.15 47.10 ± 3.69 38.00 ± 13.81

(9)

pH 6, salinitas 1.5% (optimum)

Waktu Inkubasi (jam) Aktivitas (U ml-1 Aktivitas Relatif ) (%) 0 1 2 3 4 5 6 1.10 ± 0.02 1.37 ± 0.15 1.25 ± 0.10 1.21 ± 0.01 1.03 ± 0.12 0.83 ± 0.16 0.77 ± 0.05 100.00 ± 0 124.44 ± 8.57 113.67 ± 15.85 109.92 ± 1.96 93.69 ± 7.92 75.95 ± 13.81 69.80 ± 7.11

Lampiran 14 Stabilitas amilase Bacillus sp. DA 5.2.3 pada kondisi umum

tambak (pH 8, salinitas 2.5%)

Waktu nkubasi (jam) Aktivitas Protease (U ml-1 Aktivitas Relatif ) (%) 0 0.26 ± 0.01 100 ± 0.00 1 0.78 ± 0.01 115.28 ± 36.11 2 0.45 ± 0.01 120.94 ± 11.71 3 0.28 ± 0.00 110.94 ± 30.66 4 0.30 ± 0.01 95.84 ± 9.25 5 0.31 ± 0.01 121.69 ± 9.23 6 0.22 ± 0.02 123.00 ± 3.08

Lampiran 15 Komposisi larutan untuk SDS-PAGE

Pembuatan Larutan

1. Larutan A : larutan Akrilamid 100 ml

30% (w/v) akrilamid, 0.8% (w/v) bis-akliramid

a. 29.29 gram akrilamid

b.

0.89 gram bis-akrilamid

Kedua bahan diatas ditambah dengan air destilata sampai 100mL diaduk

sampai larut sempurna.

Larutan ini dapat disimpan dalam refrigerator selama beberapa bulan.

2. Larutan B : (bufer gel pemisah 4x) 100 mL

a. 2 M Tris HCL (pH 8-8) 75 mL

b. 10% SDS 4 ml (0.4%)

c.

H

2

Stabil disimpan beberapa bulan dalam refrigerator

O 21 ml

3. Larutan C

a.

0.1M Tris-HCl (pH 6.8) 50 mL

b.

10% SDS 4 mL (0.4%)

c.

H

2

Stabil disimpan beberapa bulan dalam refrigerator

O 4.5 mL

(10)

4. Ammonium Persulfat 10%, 5 mL

a. 0.5 g ammonium persulfat

b. H

2

Stabil disimpan beberapa bulan dalam tabung tertutupdalam refrigerator

O 5 mL

5. Bufer eleksoforesis, 1 L

a. 3 g Tris 25 mM

b. 14.4 g glisin 25 mM

c. SDS 1 gr 0.1%

d.

Tambahkan H

2

pH sekitar 8.3 , stabil disimpan pada suhu ruang

O menjadi 1 L

6. Bufer sampel 5x, 10 mL

a.

1 M Tris – HCl 0.6 mL (pH 6.8) 60 mM

b.

Gliserol 50% 5 mL

c.

SDS 10% 2 ml 2%

d.

2- merkaptoetanol 0.5mL

e.

Bromophenol blue 1%, 1 mL

f.

H

2

Stabil disimpan beberapa minggu dalam refrigerator atau beberapa bulan

O 0.9 mL

pada -20

0

C

Penghitungan X % gel pemisah

Larutan A X/3 mL

Larutan B 2.5 mL

H

2

10% Ammonium persulfat 50 µl

O 7.5. X/3) mL

Total volume 10 mL

TEMED 5 µl (10 µl jika X<8)

Persiapan gel pemisah (8%)

2.7 mL larutan A

2.5 mL larutan B

4.8 mL H

2

50 µl 10% Ammonium persulfat

O

5 ml TEMED

Persiapan gel penahan

H

2

Larutan A 0.67 mL

O 2.3 mL

Larutan C 10 mL

(11)

1.2%

A. Bacillus sp. DA 5.2.3

Waktu N Berat akhir (gr) Berat Awal (gr) Volume (mL) RerataTSS Penurunan TSS ± SE ( hari) ( Spl + K) (K) ( Spl) (mg L-1₎ _(%) 0 1 0.13 0.11 15 2 0.14 0.12 15 1745 0 ± 0 1 1 0.13 0.11 15 2 0.14 0.11 15 1366 22 ± 89 2 1 0.14 0.12 20 2 0.12 0.11 20 889 49±41 3 1 0.16 0.14 20 2 0.14 0.12 20 868 50±76 4 1 0.13 0.11 20 2 0.14 0.13 20 842 52±49

Keterangan: N = ulangan Spl = sampel TSS = total suspended solid K = kertas saring SE = standard error

B. Bacillus sp. SP

Waktu N Berat akhir (gr) Berat Awal (gr) Volume RerataTSS Penurunan TSS ±SE

( hari) (Spl + K) (K) Spl (mL) (mg L-1₎ _(%) 0 1 0.13 0.11 15 2 0.13 0.10 15 1743 0±73 1 1 0.14 0.11 15 2 0.14 0.11 20 1739 0±39 2 1 0.14 0.11 20 2 0.13 0.10 20 1370 21±46 3 1 0.14 0.12 10 2 0.15 0.14 10 986 45±98 4 1 0.15 0.13 10 2 0.15 0.13 20 836 51±32

(12)

A. Kontrol (tanpa bakteri)

Waktu N Berat akhir (gr) Berat awal (gr) Volume RerataTSS Penurunan TSS±SE ( hari) (Spl + K) (K) Spl (mL) (mg L-1₎ _(%) 0 1 0.13 0.10 15 2 0.13 0.11 15 1750 0±43 1 1 0.14 0.11 20 2 0.14 0.11 20 1705 1±67 2 1 0.17 0.14 20 2 0.15 0.12 20 1393 20±92 3 1 0.16 0.13 20 2 0.13 0.10 20 1366 22±46 4 1 0.16 0.13 20 2 0.14 0.12 20 1306 25±51

Lampiran 17 Sekuen 16s rRNA Bacillus sp. DA 5.2.3

> Bacillus sp. DA 5.2.3

AAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATA ACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATT GAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTG AGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCG CAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCG TAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACG GT ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG TGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTC TGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAG TGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAG GAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGC GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCT AAGTGTTAGAGGGTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG GGAGTACGGCCCCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC TGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGG TTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT GATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGG AGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT GCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAA ACCGTTCTTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTA GTAATCGCGGA

(13)

Lampiran 18 Hasil analisis Blast sekuen gen penyandi 16S rRNA Bacillus sp.

DA 5.2.3

Nomor akses Spesies Bacillus homolog % Permintaan

terpenuhi % kesamaan maksimum GU 125426.1 GU 125425.1 GU113075.1 EU333128.1 EU333125.1

Gen 16S rRNA Bacillus cereus strain IMAU800004

Gen 16S rRNA Bacillus cereus strain IMAU80003 Gen 16S rRNA Bacillus sp. PS(2009)

Gen 16S rRNA Bacillus cereus strain DBT3ST4 Gen 16S rRNA Bacillus sp. Pc60

100 100 100 100 100 99 99 99 99 99