KAJIAN PROSES PRODUKSI XILANASE DARI ISOLAT
BAKTERI ALKALOFILIK MENGGNAKAN MEDIA
XILAN TONGKOL JAGUNG
NUR RICHANA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Kajian Proses Produksi Xilanase dari Isolat Bakteri Alkalofilik Lokal Menggnakan Media Xilan Tongkol Jagung adalah karya saya sendiri dengan arahan komisis pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini
Bogor, Juli 2006
NUR RICHANA NIM P25600006
ABSTRAK
NUR RICHANA, Kajian Proses Produksi xilanase dari Isolat Bakteri Alkalofilik Menggnakan Media Xilan Tongkol Jagung dibimbing oleh TUN TEDJA IRAWADI, M. ANWAR NUR, ILLAH SAILAH, KHASWAR SYAMSU, YANDRA ARKEM AN.
Xilanase merupakan enzim ekstraseluler yang dihasilkan oleh mikroba, dapat menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi xilo-oligosakarida dan xilosa. Xilanase yang bersifat termostabil dan tahan pada pH tinggi dapat digunakan untuk pemutihan pulp pada proses pembuatan kertas karena dapat mensubstitusi klor.
Kajian proses produksi xilanase dari isolat bakteri alkalofilik menggunakan media xilan tongkol jagung telah dilakukan melalui isolasi dan seleksi bakteri, proses produksi dan karakterisasi xilanase yang dihasilkan oleh isolat bakteri menggunakan xilan tongkol jagung.
Isolat Bacillus pumilus RXAIII-5 adalah isolat yang berasal dari tanah kapur dinyatakan sebagai isolat bakteri potensial d ibanding 24 isolat lainnya. Ekstraksi xilan dari tongkol jagung menggunakan NaOCl 0,5% dan etanol 95% dengan perbandingan 1:3 (v/v) menghasilkan rendemen tertinggi (12,95%). Xilan yang dihasilkan memiliki kemurnian (pola kromatogram) hampir sama dengan oat spelt xylan, dan bersifat sangat larut dalam alkali (NaOH 1%) dan larut dalam air panas.
Kondisi proses optimum pada suhu 35oC, pH = 7 dan agitasi = 140 rpm pada skala 50 ml dengan hasil aktivitas spesifik 655,321 U/mg protein. Optimasi proses pada Bioreaktor-2l pada aerasi 1 vvm dan agitasi 200 rpm dengan hasil efisiensi penggunaan substrat untuk pembentukan produk YP/S sebesar 50,744 U/g substrat. Sifat reologi cairan
kultivasi mengikuti perilaku cairan Non-Newtonian, termasuk pseudoplastik (k =0,179 g cm-1 det -1, n =0,3212), dan aliran bersifat turbulen. Tenaga untuk menggerakkan impeller sebesar 0,228 HP, tenaga untuk sistem beraerasi/unit volume 0,2665 HP/m3. Hasil perhitungan penggandaan skala 10 000 liter dengan volume kerja 6500 diperoleh tinggi bioreaktor 4,83 m, diameter tanki 1,623 m, diameter pengaduk jenis turbin pipih 0,686 m. Laju aerasi yang diperlukan 0,27 vvm dan kecepatan agitasi 37,18 rpm.
Pengendapan xilanase dengan amonium sulfat yang dilanjutkan dengan dialisis menghasilkan aktivitas spesifik tertinggi (267,1 U/mg) dibanding pengendapan dengan aseton (131,1 U/mg) dan etanol (186,65 U/mg). Purifikasi menghasilkan 3 fraksi xilanase.
Xilanase yang dihasilkan memiliki Karakteristik sebagai berikut : pH dan suhu optimum 9 dan 50oC, nilai Km dan Vmaks berturut-turut adalah 6 mg/ml dan 0,2 mol/menit. Ion Fe3+ merupakan aktivator terkuat, dan Mg2+ merupakan inhibitor. Produk hidrolisis xilan oleh xilanase terbanyak adalah xilosa (35,24 mg/100ml), dan glukoxilan (14,65 mg/100 ml), dan tidak terdeteksi selulase. Xilanase ini prospektif untuk proses pemutih kertas.
Harga pokok xilanase pada media xilan dari tongkol jagung Rp32,327 /Unit/mg protein, sedangkan pada media oat spelt xylane Rp 43,104/Unit/mg protein.
ABSTRACT
NUR RICHANA, Study of Production Process of Xylanase from Alkalophillyc Bacterium Isolate Grown on Corn Cob Xylane. Under the Direction TUN TEDJA IRAWADI, M. ANWAR NUR, ILLAH SAILAH, KHASWAR SYAMSU, YANDRA ARKEMAN.
Xylanase is an extracelulair enzyme which is produced by microorganism. This enzyme is able to hydrolise xylane (hemicelulose) to produce xylooligosaccharide and xylose. Thermo-alkalophillyc xylanase is an agent of pulp whitening process instead of or substitute of chlorine.
Study of Production Process of xylanase from alkalophillyc bacterium isolate in corn cob xylane medium was started with isolation and selection of xylanase producing bacteria, production process technology and characterization of xylanase produced by bacterium isolate in corn cob xylan medium.
Isolate Bacillus pumilus RXAIII-5 originated from lime or alkaline soil is more potential isolate in xylanase production than other 24 isolates. The xylan was extracted from corn cob using 0.5% NaOCl and 95% ethanol : supernatant = 1 : 3 (v/v), yielding 12.95%. The highest solubility of xylane was in alkaline solvent (NaOH 1%) and hot water.
The optimum processing condition was obtained at temperature 35oC, pH 7, and agitation rate 140 rpm in 50 ml scale. The optimum condition for fermentation in Biostat 2l-bioreactor was reached at 1 vvm and 200 rpm aeration and agitation, respectively. In this condition the efficiency of substrate consumption to produce xylanase (Yp/s) was
50.744 U.g-1 substrate. The properties of liquid cultivation medium followed non-Newtonian and was categorized as pseudoplastic (k=0.179 g.cm-1.second-1 and n=0.3212) and showed turbulence flow. Energy consumption to run impeller in aeration system per unit volume was 0.2665 HP.m-3. Demension of scaling up to 10 000 liter of bioreactor with 6 500 liter fermentation vessel was 4.83 m height and 1.623 m diameter tank of bioreactor and 0.686 m of impeller. Aeration rate and agitation speed requirement were 0.27 vvm and 37.18 ppm, respectively.
Precipitation of xylanase using ammonium sulphate followed by dialyzes produced a higher specific activity (267.1 U.mg-1) than using acetone (131.1 U.mg-1) and ethanol (186.65 U.mg-1). Purification produced three fractions of xylanase.
Xylanase characteristics consist of pH and temperature (9 and 50o C), Km and Vmax value 6 mg.ml-1 and 0.2 mol.minute-1, respectively. The Fe2+ is the strongest activator and Mg2+ is the strongest inhibitor. Hydrolysis of xylane by xylanase produced the proportion of xylose (35.24 mg.100ml-1) and glucoxylane (14.65 mg.100ml-1). This enzyme was detected as cellulose- free xylanase. Xylanase is a prospective agent for biobleaching of paper.
The price of xylanase from xylan of corn cob medium (Rp32,327 /Unit/mg protein) is less than the price of xylanase from oat spelt xylan medium (Rp 43,104/Unit/mg protein).
KAJIAN PROSES PRODUKSI XILANASE DARI ISOLAT
BAKTERI ALKALOFILIK MENGGUNAKAN MEDIA
XILAN TONGKOL JAGUNG
NUR RICHANA
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Teknologi Industri Pertanian
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Disertasi : Kajian Proses Produksi Xilanase dari Isolat Bakteri Alkalofilik Menggnakan Media Xilan Tongkol Jagung Nama : Nur Richana
No Pokok Mahasiswa : P25600006
Menyetujui Komisis Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi
Ketua
Prof. Dr. Ir. Anwar Nur, MSc Dr. Ir. Illah Sailah, MS Anggota Anggota
Dr. Ir. Khaswar Syamsu, MSc Dr. Ir. Yandra Arkeman, M. Eng Anggota Anggota
Ketua Program Studi
Teknologi Industri Pertanian Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Irawadi Jamaran Dr. Ir. Khairil A Notodiputro MS Tanggal Ujian:17 Oktober 2006 Tanggal Lul us:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Temanggung pada tanggal 25 Juli 1954 sebagai anak bungsu dari sebelas bersaudara pasangan Bapak Achmad Qodli (almarhum) dan Ibu Djuwairiah (almarhumah). Pendidikan sarjana ditempuh di jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gajah Mada. Lulus sarjana Teknologi Pertanian pada tahun 1982. Pada tahun 1994 penulis melanjutkan studi program magister pada program studi Teknologi Industri Pertanian Sekolah Pascasarjana IPB Bogor dan lulus pada tahun 1997. Kemudian pada tahun 2000 melanjutkan ke program doktor pada jurusan yang sama.
Penulis bekerja sebagai peneliti di Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, pada tahun 1983 - 1993 di Balai Penelitian Tanaman Pangan Maros Sulawesi Selatan, kemudian tahun 1993 - 1996 di Balai Penelitian Tanaman Pangan Bogor dan tahun 1997 - 2003 di Balai Penelitian Bioteknologi Pertanian Bogor (Balitbio). Sejak tahun 2003 sampai sekarang di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pasapanen Pertanian Bogor, dengan jabatan fungsional Ahli Peneliti Muda.
Penulis menikah pada tahun 1978 dengan Singgih Andyantoro, dikaruniai tiga orang putra, Nurendrantoro (1979), Achmad Arie Wibowo (1981), dan Andika Setya Muhamad (1984), menantu Anindita Damayanti dan seorang cucu Muhamad Nikkei Nurenditia Yusuf (2004).
PRAKATA
Alhamdulillahi rabbil 'aalamin, segala puji syukur dipanjatkan ke hadirat Allah SWT, karena dengan kehendak Nya dan atas rahmat serta karunia Nya disertas i ini dapat diselesaikan. Penulis menyampaikan rasa hormat dan terima kasih yang tulus kepada Prof.Dr.Ir.Tun Tedja Irawadi selaku Ketua Komisi Pembimbing atas segala curahan waktu, bimbingan, arahan, serta dorongan moral dengan penuh dedikasi kepada penulis sejak awal sampai dengan selesainya disertasi ini.
Penghargaan dan ucapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan juga kepada Prof.Dr.M.Anwar Nur M.Sc., Dr.Illah Sailah MS., Dr. Ir.Khaswar Syamsu M.Sc. dan Dr. Ir. Yandra Arkeman M.Eng., masing-masing selaku Anggota Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, arahan, serta dorongan moral dengan penuh dedikasi kepada penulis.
Pada kesempatan ini penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr.Ir.Irawadi Jamaran selaku Ketua Program Studi Teknologi Industri Pertanian, Dekan Sekolah Pascasarjana IPB, Dekan Fateta IPB, Rektor IPB dan staf penga jar Program Studi Teknologi Industri Pertanian atas segala bantuannya. Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Prof. Dr. Ir. Djumali Mangunwidjaja DEA atas kesediaan menjadi penguji diluar komisi pembimbing.
Ucapan terima kasih yang tak ternilai kepada Bapak Achmad Qodli dan Ibunda Djuwairiyah yang telah tiada, yang sebelumnya selalu mendorong ananda untuk melanjutkan studi. Terimakasih kepada kakanda Affan Achmad sebagai pengganti orang tua, atas perhatian, dorongan dan semangat yang telah diberikan. Penghargaan dan terimakasih kepada suami kakanda Singgih Andyantoro dan anak-anak terkasih Rendra dan Anin, Arie, Aang juga cucu tersayang Nik kei yang dengan kesabaran dan keikhlasan telah memberikan dorongan moral, material, dan selalu berdoa memohon kepada Allah SWT untuk kesuksesan penulis.
Penghargaan dan terima kasih penulis sampaikan kepada Kepala Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika, Kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen, Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian yang telah memberikan ijin untuk mengikuti pendidikan program doktor (S3) di IPB.
Secara khusus terima kasih penulis ucapkan kepada rekan-rekan sejawat Lalu Sukarno, Pujo Yuwono, Pia Lestina, Hety Herawati, Yudi, Danu, Dini yang juga telah banyak membantu pelaksanaan penelitian ini.
Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada sahabat-sahabat mahasiswa Pascasarjana Program Studi Teknologi Industri Pertanian, khususnya angkatan 2000 atas segala jalinan kasih sayang, kerjasama dan kebersamaan dalam menempuh pendidikan.
Kepada semua pihak yang telah membantu dengan tulus selama mengikuti pendidikan sampai selesainya disertasi ini, d isampaikan terima kasih.
Seperti pepatah ’tak ada gading yang tak retak’ penulis menyadari bahwa disertasi ini tidak luput dari kekurangan dan kesalahan. Oleh sebab itu penulis harapkan masukan, kritikan atau saran agar hasil penelitian ini dapat dikembangkan lebih lanjut untuk perkembangan kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Juli 2006
DAFTAR ISI
Halaman
SURAT PERNYATAAN ii
ABSTRAK iii
ABSTRACT v
LEMBAR JUDUL vii LEMBAR PENGESAHAN viii
RIWAYAT HIDUP ix
PRAKATA x DAFTAR ISI xii
DAFTAR TABEL xv
DAFTAR GAMBAR xvii
DAFTAR LAMPIRAN xix PENDAHULUAN ... 1
Latar Belakang …... 1
Tujuan Penelitian ………... 3
Hipotesis ……….... 3
Ruang Lingkup Penelitian ……… ... 4
Kerangka Pemikiran ... 5
TINJAUAN PUSTAKA ... 6
Struktur Xilan ………... 6
Potensi Limbah Jagung Sebagai Sumber Xilan …...………... 8
Xila nase ………...……. 8
Mikroba Penghasil Xilanase ... 10
Media Pertumb uhan Mikroba Penghasil Xilanase…………... 12
Kultivasi Mikroba Penghasil Xilanase …...…...………. 15
Kinetika Produksi Enzim Xilanase ... 19
Sifat Reologi Cairan Kultivasi ... 21
Aplikasi Xilanase ... 23
BAHAN DAN METODE ... 27
Bahan dan Alat ... 27
Tahapan Penelitian ... 27
Metode Penelitian ... 27
- Isolasi, Seleksi dan Identifikasi Bakteri Penghasil Xilanase ……...……... 28
- Formulasi Media Kultivasi Produksi Xilanase Dengan Media Bersubstrat Oat Spelt Xylan... 30
- Ekstraksi Xilan Dari Tongkol Jagung ... 31
- Formulasi Media Kultivasi Produksi Xilanase dengan Media Bersubstrat Xilan Dari Tongkol Jagung ... 33
- Optimasi Kondisi Proses ... 33
- Kinetika Kultivasi Dalam Bioreaktor Biostat-B-2l... 34
- Sifat Reologi Cairan Kultivasi ... 35
- Karakterisasi Enzim Xilanase dari Isolat Bakteri Terpilih ... 35
HASIL DAN PEMBAHASAN ... 39
Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Xilanase ………... 39
Identifikasi Isolat Bakteri Unggul Penghasil Xilanase... 45
Formulasi Media Tahap I (Bersubstrat Oat Spelt Xylan) ... 47
Ekstraksi Xilan Dari Tongkol Jagung ... 52
Formulasi Media Tahap II (Bersubstrat Xilan dari Tongkol Jagung)... 57
Optimasi Kondisi Proses Kultivasi Bakteri Bacillus pumilus RXA III-5 ... 61
A. Optimasi Kondisi Proses Skala 50 ml ... 61
B. Optimasi Agitasi, Aerasi Kultivasi Bacillus Pumilus RXA III-5 Pada Bioreaktor ... 66
C. Kinetika Kultivasi Bacillus pumilus RXAIII-5 ... 69
Sifat Reologi Cairan Kultivasi ... 71
Karakterisasi Xilanase ... 74
A. Pengendapan dan Pemurnian ………..……... 74
B. Penentuan pH dan Suhu Optimum... 77
pH Optimum Xilanase ………... 77
Stabilitas Xilanase... 79
C. Penentuan Km dan Vmaks Xilanase dari Bacillus pumilus RXAIII-5 ... 81
D. Pengaruh Beberapa Ion Logam Terhadap Aktivitas Xilanase... 83
E. Analisis Produk Hasil Hidro lisis Xilan ... 85
F. Kemampuan Enzim Kasar Mendegradasi Substrat spesifik ... 86
Analisis Finansial ………...….... 87
SIMPULAN DAN SARAN... 91
DAFTAR PUSTAKA... 94
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Kadar (%) xilan dari beberapa limbah hasil pertanian ... 7 Tabel 2. Beberapa mikroba penghasil endoxilanase... 11 Tabel 3. Media pertumbuhan bakteri penghasil xilanase ... 15 Tabel 4. Kepekatan optik, kand ungan protein, aktivitas enzim dan
aktivitas spesifik dari beberapa isolat bakteri penghasil xilanase… 40 Tabel 5. Seleksi isolat bakteri alkalofil ik penghasil xilanase... 42 Tabel 6. Identifikasi isolat bakteri unggul penghasil xilanase ... 45 Tabel 7. Analisis agam protein terlarut, aktivitas xilanase dan
aktivitas spesifik dari formulasi media tahap I... 47 Tabel 8. Formulasi media berdasarkan hasil pengamatan
protein, aktivitas xilanase dan aktivitas spesifik... 51 Tabel 9. Neraca masa ekstraksi xilan dari tongkol jagung ... 54 Tabel 10. Kelarutan xilan dalam beberapa pelarut ... 54 Tabe l 11. Analisis ragam protein terlarut, aktivitas xilanase dan
aktivitas spesifik dari formulasi media tahap II... 57 Tabel 12. Formulasi media berdasarkan hasil pengamatan p rotein,
aktivitas xilanase dan aktivitas spesifik ... 59 Tabel 13. Analisis ragam protein terlarut, aktivitas xilanase, aktivitas
spesifik dari hasil optimasi kondisi proses kultivasi
Bacillus pumilus RXA III-5 pada skala 50 ml ... 61 Tabel 14. Penentuan Yp/s, Yp/x dan Yx/s kultivasi Bacillus pumilus
RXAIII-5 pada beberapa laju aerasi dan agitasi... 71 Tabel 15. Penggandaan skala produksi xilanase menggunakan
bioreaktor 10 000 liter... 75 Tabel 16. Pemurnian xilanase dari Baci llus pumilus RXAIII-5 ... 75 Tabel 17. Aktivitas xilanase dengan perlakuan beberapa senyawa
yang mengandung ion logam... 84 Tabel 18. Aktivitas enzim pada beberapa substrat ... 86
Tabel 19. Perhitungan harga pokok untuk produk xilan, xilanase
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur xilan (Sunna dan Antranikian, 1997)... 7
Gambar 2. Struktur xilan dan enzim yang terlibat dalam hidrolisisnya (Beg et al. 2001) ... 9
Gambar 3. Diagram alir tahapan kerja isolasi dan seleksi isolat bakteri unggul penghasil xilanase……… 29
Gambar 4. Diagram alir ekstraksi xilan dari tongkol jagung ... 32
Gambar 5. Diagram alir pengendapan enzim xilanase … ………... 36
Gambar 6. Penampakan koloni bakteri penghasil xilanase ... 39
Gambar 7. Pohon filogenetik isolat RXAIII-5 ... 46
Gambar 8. Protein terlarut pada formulasi media xilan, pepton dan ekstrak khamir... 48
Gambar 9. Aktivitas xilanase pada formulasi media xilan, pepton dan ekstrak khamir... 49
Gambar 10. Aktivitas spesifik xilanase pada formulasi media xilan, pepton dan ekstrak khamir ... 50
Gambar 11. Grafik hubungan antara konsentrasi NaOCl dan perbandingan etanol/supernatan pada ekstraksi xilan dari tongkol jagung ... 53
Gambar 12. Khromatogram hasil ekstrak xilan dari tongkol jagung dan oat spelt xylane sebagai standar ... 55
Gambar 13. Interaksi antar perlakuan terhadap protein terlarut pada optimasi kondisi proses... 62
Gambar 14. Interaksi antar perlakuan terhadap aktivitas xilanase pada optimasi kondisi proses... 64
Gambar 15. Interaksi antar perlakuan terhadap aktivitas spesifik pada optimasi kondisi proses ……… 65
Gambar 16. Kurva bobot sel kering pada laju aerasi 0,5 dan 1 vvm pada berbagai kecepatan agitasi. ... 67
Gambar 17. Kurva protein terlarut pada laju aerasi 0,5 dan 1 vvm pada berbagai kecepatan agitasi... 68
Gambar 18. Kurva hubungan aktivitas xilanase pada laju aerasi 0,5
dan 1 vvm dari berbagai kecepatan agitasi. ... 68
Gambar 19. Kurva linier penentuan nilai Yp/s (A), Yx/s (B), dan Yp/x (C) kultivasi bakteri Bacillus pumilus RXAIII-5... 70
Gambar 20. Sifat reologi cairan kultivasi Bacillus pumilus RXAIII-5... 72
Gambar 21. Hubungan antara log viskositas dan log laju geser ... 73
Gambar 22. Hasil uji kualitatif pemurnian xilanase ... 76
Gambar 23. Kurva aktivitas xilanase pada beberapa kondisis pH... 78
Gambar 24. Kurva aktivitas xilanase pada beberapa kondisi suhu ... 78
Gambar 25. Stabilitas pH xilanase dari isolat Bacillus pumilus RXA III-5... 79
Gambar 26. Stabilitas suhu xilanase dari isolat Bacillus pumilus RXA III-5... 80
Gambar 27. Kurva Lineweaver-Burk... 81 Gambar 28. Hasil hidrolisis xilan oleh xilanase dari Bacillus pumilus RXAIII-5. 85
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Prosedur pengukuran aktivitas enzim xilanase ……… 101
Lampiran 2. Penetapan protein terlarut menurut Bradford ... 102
Lampiran 3. Penyiapan bahan untuk pemurnian ... 103
Lampiran 4. Data hasil isolasi bakteri penghasil xilanase... 104
Lampiran 5. Hasil pengamatan biomasa, protein dan aktivitas xilanase pada tahap seleksi... 110
Lampiran 6. Data hasil sekuen identifikasi bakteri RXAIII-5... 111
Lampiran 7. Hasil pengamatan dan hasil analisis statistik kegiatan formulasi media tahap I. ………. 114
Lampiran 8. Perhitungan C/N ratio pada formulasi media... 130
Lampiran 9. Hasil dan analisis ragam ekstraksi xilan dari tongkol jagung ... 131
Lampiran 10. Hasil pengamatan dan analisis statistik kegiatan formulasi media tahap II ……….. 134
Lampiran 11. Hasil pengamatan dan analisis statistik kegiatan optimasi Kondisi proses kultivasi Bacillus pumilus RXAIII-5 ... ... 144
Lampiran 12. Hasil pengamatan dan perhitungan optimasi proses dan kinetika kultivasi ... 160
Lampiran 13. Data penentuan reologi cairan kultivasi ... 184
Lampiran 14. Perhitungan kebutuhan tenaga ... 185
Lampiran 15. Perhitungan rancang bangun alat ... 188
