farmakologi Penentuan LC 50 Ekstrak Peka

(1)

LAPORAN AKHIR

PRAKTIKUM PENGANTAR FARMAKOLOGI LAUT

Mata Acara Praktikum : Penentuan LC 50 Ekstrak Pekat ( Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test )

Disusun oleh:

Ruth Bestria H

Kelompok 1

Shift 1

UNIVERSITAS PADJADJARAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN

JATINANGOR

(2)

LEMBAR PENGESAHAN

LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOLOGI LAUT Semester Genap, TA 2012/2013

Disusun Oleh,

Nama : Ruth Bestria H NPM : 230210120010 Kelas : Ilmu Kelautan

Menyetujui, Jatinangor, 5 Juni 2013

Pembimbing

Yeni Mulyani, S.Pi., M.si. 19790819 200801 2016

(3)

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan Laporan kami ini mengenai Penentuan LC 50 Ekstrak Pekat ( Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test ). Tujuan disusunnya laporan ini adalah sebagai pemenuhan tugas mata kuliah Farmakologi Laut. Kami berterima kasih kepada dosen dan Asisten Laboratorium yang telah memberikan tugas ini karena dengan adanya tugas ini, kami menjadi tahu tentang ilmu yang terkait farmakologi laut.

Harapan penyusun, laporan ini dapat bermanfaat dan menambah pengetahuan kita semua tentang Penentuan LC 50 Ekstrak Pekat ( Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test ). Akhir kata, penyusun mengucapkan mohon maaf jika laporan ini kurang sempurna, karena itulah penyusun sangat berterima kasih apabila ada pembaca yang memberikan saran dan kritik demi kesempurnaan laporan ini.

Jatinangor, 5 Juni 2013

(4)

DAFTAR ISI 1.1 Latar belakang ... 1

1.2 Tujuan Praktikum ... 2

1.3 Prinsip Praktikum... 2

II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan Umum Hewan Uji Daphnia sp... 3

2.2 Tinjauan Umum Barringtonia asiatica... 4

2.3 LC50... 5

2.4 EPA Probit... 6

III. METODOLOGI PRAKTIKUM 3.1 Waktu dan Tempat Praktikum ... 7

3.2 Alat dan Bahan ... 7

3.3 Prosedur Praktikum ... 8

3.4 Analisa Data ... 8

DAFTAR PUSTAKA ... 17

LAMPIRAN ...18

(5)

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

1. Pengamatan Mortalitas Daphnia sp (jenis ekstrak : Barringtonia

Asiatica,konsentrasi : kontrol)………. 9

2. Data Pengamatan Mortalitas Daphnia sp ( jenis ekstrak : Barringtonia

Asiatica, konsentrasi : 10 ppm )………. 9

Asiatica, konsentrasi : 100 ppm )……… 9

Asiatica, konsentrasi : 1000 ppm )………. 10

Asiatica, konsentrasi : 10000 ppm )……….. 10

6. Data Pengamatan Mortalitas Daphnia sp (jenis ekstrak : Barringtonia

Asiatica, konsentrasi : 100000 ppm ) ... 10

7. Data Persentase Mortalitas Daphnia sp setelah 24 jam………. 11

8. Data Analis Probit Daphnia sp………... 11

DAFTAR GAMBAR

(6)

1. Daphnia sp ……… 3 2. Barringtonia asiatica... 4

(7)

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Senyawa yang diduga memiliki aktivitas antikanker, harus diujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan. Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) dengan menggunakan larva udang Daphnia sp sebagai hewan uji merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa antikanker baru yang berasal dari tanaman. Hasil uji toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksis senyawa anti kanker. Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat dan cukup akurat (Meyer, 1982). Lebih dari itu uji larva udang ini juga digunakan untuk praskrining terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor. Dengan kata lain, uji ini mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai antikanker (Anderson, 1991).

Pengujian Lethalitas telah digunakan dengan sukses untuk isolasi biomonitor dari cytotoxic (Siqueira, M. J et. al., 1998), antimalaria (Perez, H, et.al., 1997), insektisida (Oberlies, N. H.,et.al., 1998), dan antifeedent (Labbe, C., et.al., 1993) campuran dari ektrak tumbuhan. Hasil dari skrening dari air, hydroalcoholic dan ekstrak alkohol dari beberapa tumbuhan obat penting yang digunakan dalam pengobatan tradisional untuk lethalitas merujuk pada larva Daphnia sp yang diperkenalkan.

(8)

2

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan praktikum Penentuan LC 50 Ekstrak Pekat ( Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test ) yaitu :

- Memahami dan melakukan uji toksisitas dengan menggunakan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test )

- Mengetahui senyawa aktif yang terdapat dalam larva udang berdasarkan nilai LC50 ( Lethal Concentration) dari ekstrak pekat Barringtonia asiatica

1.3 Prinsip Praktikum

Prinsip dari praktikum Penentuan LC 50 Ekstrak Pekat ( Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test ) adalah uji toksisitas dari ekstrak Barringtonia asiatica yang memiliki komponen bioaktif dan menghitung jumlah spesies Daphnia sp yang mati dari setiap botol vial dengan perbedaan konsentrasi, dimulai dari kontrol sebagai pembanding, konsentrasi 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm, 10000 ppm dan 100000 ppm saat 50% dari populasi awal dengan EPA Probit.

(9)

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Umum Biota Uji

Gambar 1. Daphnia sp.

(Sumber :

benihikangunungkidul.blogspot.com)

Daphnia sp. dapat hidup dalam air yang kandungan oksigen terlarutnya sangat bervariasi yaitu dari hampir nol sampai lewat jenuh. Ketahanan Daphnia sp. pada perairan yang miskin oksigen mungkin disebabkan oleh kemampuannya dalam mensintesis haemoglobin (Mokoginta, 2003).

(10)

4

parthenogenesis menjadi berkurang bahkan beberapa menetas dan telur berkembang menjadi individu jantan (Hickman, 1967 dalam Casmuji, 2002). Dengan munculnya Daphnia jantan, maka populasi mulai bereproduksi secara seksual.

Daphnia sp. dikenal sebagai kutu air. Klasifikasi Daphnia sp. menurut Pennak (1953) dan Ivleva (1973) dalam Casmuji (2002) adalah sebagai

2.2 Tinjauan Umum Barringtonia asiatica

Senyawa aktif dalam biji buah ini, yang diduga kuat memiliki efek penyembuhan dalam pengobatan adalah dari golongan saponin. Beberapa jenis saponin telah berhasil diidentifikasi. saponin yang berasal dari buah keben merupakan saponin jenis baru. Dengan kandungan senyawa tersebut buah keben telah dilaporkan memiliki banyak aktivitas farmakologis seperti anti bakteri, anti jamur, analgesik, dan anti tumor.

Gambar 2. Barringtonia asiatica

(11)

5

Dari penelitian-penelitian lain diketahui bahwa selain saponin, buah dan biji keben juga mengandung asam galat hidrosianat yang terdiri dari monosakarida serta triterpenoid yang terdiri dari asam bartogenat, asam 19-epibartogenat, dan asam anhidro-bartogenat. Asam Keben mengandung senyawa saponin, terpen, alkaloid, triterpenoid, fenolik dan tanin (Duryatmo, 2006 dalam Khairun, Ahmad. 2011).

2.3 LC 50

Suatu konsentrasi mematikan (Lethal Concentration) adalah analisa secara statistik yang menggunakan uji Whole Effluent Toxicity (WET) untuk menaksir lethalitas sampel effluen. Test akut digunakan di Wisconsin untuk menaksir kondisi "akhir dari pipa" (yaitu, effluent yang tidak dilemahkan, sebagai adanya dibebaskan pada lingkungan).

Konsentrasi effluen dimana 50% dari organisme mati selama test (LC50) digunakan sebagai pemenuhan titik akhir (endpoint) untuk Test Whole Effluent Toxicity (WET) akut. Dalam rangka mengkalkulasi LC50, salah satu dari konsentrasi test harus menyebabkan > 50% kematian. LC50, yang lebih rendah berarti semakin beracun effluent tersebut. Sebagai contoh, LC50 > 100% berarti kekuatan penuh effluent tersebut tidak membunuh lebih dari separuh organisme. LC50 sama dengan 50% berarti separuh effluent mempunyai kekuatan membunuh 50% dari organisme tersebut.

Menurut Meyer dkk. (1982) tingkat toksisitas dari ekstrak tanaman dapat ditentukan dengan melihat harga LC50-nya. Apabila harga LC50 lebih kecil dari 1000 μg/ml dikatakan toksik, sebaliknya apabila harga LC50 lebih besar dari 1000 μg/ml dikatakan tidak toksik. Tingkat toksisitas tersebut akan memberi makna terhadap potensi aktivitasnya sebagai antitumor. Semakin kecil harga LC50 semakin toksik suatu senyawa.

(12)

6

EPA Probit merupakan salah satu metode analisis statistik yang digunakan untuk

(13)

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan Praktikum

Praktikum Penentuan LC50 Ekstrak Pekat (Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test) dilaksanakan pada hari Jumat, 31 Mei 2013 pukul 10.00-12.00 WIB di

Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Kelautan, Gedung 4 Lantai 3 Universitas Padjajaran, Jatinangor.

3.2 Alat dan Bahan

 Alat

Alat yang digunakan adalah :

- Akuarium, sebagai tempat larva Daphnia sp - Botol vial, sebagai tempat pengamatan hewan uji

- Micropipet, untuk mengambil pelarut dalam jumlah kecil ± 1000µL

 Bahan

Bahan yang digunakan adalah :

- Air, sebagai medium Daphnia sp - Akuades, sebagai medium kontrol

- Barringtonia asiatica , sebagai ekstrak sampel - Daphnia sp, sebagai hewan uji

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Penentuan LC50 Ekstrak Pekat

Prosedur kerja penentuan LC50 ekstrak pekat (uji toksisitas Brine Shrimp Lethality Test) adalah :

1. Dibuat larutan uji awal dengan kadar 10, 100, 1000,10000, dan 100000 ppm.

(14)

3. Dimasukkan larva Daphnia ke dalam botol vial sebanyak 10 ekor.

(15)

9

4. Dimasukkan larutan sampel (bahan toksik) dengan variasi konsentrasi ke dalam botol vial sebanyak 1% (50 µL).

5. Untuk kontrol botol vial diisi 4 ml air medium (air tawar) dan larva Daphnia sebanyak 10 ekor tanpa penambahan bahan toksik.

6. Dilakukan pengamatan selama 24 jam dengan selang pengamatan 15 menit, 30 menit, 1 jam,2 jam, 4 jam, 16 jam dan 24 jam. Mortalitas diamati dengan cara menghitung jumlah larva yang diamati.

7. Dihitung nilai LC50 dengan menggunakan program EPA probit.

3.2.2 Pengenceran Bertingkat dan Pengenceran Stock

Prosedur pengenceran bertingkat dan pengenceran stock adalah : 1. Disiapkan sampel Barringtonia asiatica.

2. Disiapkan 4 tabung reaksi dalam rak tabung beri tanda 1 s/d 4.

3. Ditambahkan 1 ml aquades masing-masing pada tabung reaksi 2 s/d 4. 4. Pada tabung reaski 1 tambah 2 ml larutan stok.

5. Pada tabung reaksi 2 tambah 1 ml larutan yang diambil dari tabung reaksi 6. Dicampurkan dengan baik.

7. Pada tabung reaksi 3 tambah 1 ml larutan yang diambil dari tabung reaksi 8. Dicampurkan dengan baik.

3.3 Analisis Data

Analisa data berdasarkan perhitungan mortalitas larva yang mati pada pengamatan 24 jam dan perhitungan nilai lethal concentration 50% (LC50) oleh analisis probit dengan program EPA probit.

(16)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Tabel 1. Data Pengamatan Mortalitas Daphnia sp (jenis ekstrak : Barringtonia Asiatica, konsentrasi : kontrol)

Tabel 2. Data Pengamatan Mortalitas Daphnia sp ( jenis ekstrak : Barringtonia Asiatica, konsentrasi : 10 ppm )

Waktu

(17)

11

Waktu

Waktu

Tabel 6. Data Pengamatan Mortalitas Daphnia sp (jenis ekstrak : Barringtonia Asiatica, konsentrasi : 100000 ppm )

Waktu Dedah

Daphnia Keterangan

(18)

12

Tabel 7. Data Persentase Mortalitas Daphnia sp setelah 24 jam

Ulangan Konsentrasi

10 ppm 100 ppm 1000 ppm 10000 ppm 100000 ppm

1 100% 100% 100% 100% 100%

2 80% 100% 100% 100% 100%

3 100% 100% 100% 100% 100%

Rata rata 93% 100% 100% 100% 100%

Tabel 8. Data Analis Probit Daphnia sp

d

150 148 15 38.84 119.74 55

(19)

13

Maka, dapat dilakukan perhitungan terhadap nilai a dan nilai b sebagai berikut :

b=

(20)

14

kelompok menguji dengan ekstrak yang berbeda dan pengulangan uji penentuan LC50 terhadap Daphnia sp sampai tiga kali (shift 1 hingga shift 3).

Awalnya, ekstrak pekat Barringtonia asiatica dibuat larutan uji dengan kadar 10, 100, 1000, 10000, dan 100000 ppm. Perbedaan konsentrasi dimaksudkan untuk mengetahui rata-rata Daphnia sp yang mati sejumlah setengahya dari populasi awal. Kemudian, botol vial diisi dengan 4 ml air medium (air tawar) dan dimasukkan 10 ekor Daphnia sp ke dalam botol vial. Selanjutnya, larutan sampel (bahan toksik) yang akan diuji kadar LC50 –nya dengan variasi konsentrasi tertentu diatas dimasukkan ke dalam botol vial sebanyak 1% (50µL). Botol vial yang akan dijadikan sebagai control diisi dengan 4ml air medium dan 10 ekor Daphnia sp tanpa penambahan ekstrak pekat Barringtonia asiatica. Pengamatan dilakukan selama 24 jam dengan kondisi botol vial terbuka agar Daphnia sp mendapatkan udara (O2). Pengamatan dilakukan secara periode waktu 15 menit, 30 menit, 1 jam, 2 jam, 4 jam, 8 jam, 16 jam, dan 24 jam. Mortalitas (kematian) diamati dengan cara menghitung jumlah larva yang mati. Selanjutnya, nilai LC50 dihitung dengan menggunakan EPA Probit.

Dari ekstrak sampel digunakan, ada 5 konsentrasi yang bertingkat dari setiap kelompok semua shift. Pengujian juga dilakukan dengan larutan aquadest di dalam botol kontrol sebagai pembanding atau acuan untuk data yang diperoleh. Botol kontrol ini adalah botol yang tidak diberikan ekstrak sampel Barringtonia asiatica. Untuk kelompok satu, menguji dengan botol kontrol dan konsentrasi 10 ppm, kelompok dua menguji dengan konsentrasi 100 ppm, kelompok tiga menguji dengan konsentrasi ekstrak sampel 1000 ppm, kelompok empat menguji dengan konsentrasi 10000 ppm dan yang terakhir kelompok lima mengujinya dengan menggunakan 100000 ppm ekstrak pekat sampel Barringtonia asiatica.

(21)

15

tidak berlangsung cepat, dibutuhkan 2 jam untuk toksik yang terdapat pada sampel untuk membunuh daphnia. Kematian ini bisa disebabkan karena oksigen yang terkandung dalam botol amat minim. Karena selama enam jam, botol dalam keadaan tertutup. Sehingga tidak ada suplai oksigen. Seharusnya daphnia dapat bertahan jika hanya dalam kurun waktu enam jam dengan oksigen yang terkendali.

Daphnia sp shift satu mengalami kematian pertama pada jam kedua sebanyak satu ekor, sedangkan untuk shift dua mengalami kematian pertama pada jam keempat dengan jumlah Daphnia sp dua, untuk shift tiga kematian Daphnia sp terjadi pada jam kesatu pengamatan dengan jumlah yang mati dua ekor. Kematian terakhir untuk botol control rata-rata terjadi pada jam keenambelas. Pada botol kontrol, kematian daphnia tidak berlangsung cepat namun berangsur-angsur, jika dilihat pada tabel dibutuhkan minimal enam puluh menit untuk dapat membunuh Daphnia sp. Kematian ini tidak disebabkan toksik karena larutan atau medium tumbuh Daphnia sp tidak ditambahi ekstrak pekat sampel, tapi bias jadia disebabkan karena tidak adanya makanan atau nutrisi bagi tumbuh kembangnya Daphnia sp, namun juga bisa disebabkan karena oksigen yang terkandung dalam botol amat minim. Karena selama kurang lebih enam jam untuk botol shift satu, botol dibiarkan dalam keadaan tertutup. Sehingga tidak ada suplai oksigen untuk proses respirasi Daphnia sp. Seharusnya daphnia dapat bertahan sekurang-kurangnya hidup dalam jangka waktu enam jam dengan oksigen yang terkendali.

Untuk medium tumbuh Daphnia sp dengan konsentrasi ekstrak sampel 10 ppm yang diamati oleh kelompok satu dari semua shift, Daphnia sp yang diamati oleh kelompok satu shift tiga mengalami kematian tercepat, yaitu pada menit kelima belas dari pengamatan.

(22)

16

ppm rata-ratanya adalah 100%; konsentrasi 10000ppm rata-ratanya adalah 100% dan terakhir untuk konsentrasi 100000 ppm rata-ratanya adalah 93%.

Selanjutnya, dilakukan analisis probit Daphnia sp dengan menggunakan Metode Hubert. Pertama, mencari nilai a dan b dan selanjutnya m (mortalitas) untuk kemudian mendapatkan nilai LC50-24h (nilai uji LC50 dalam ekstrak Barringtonia asiatica selama 24 jam terhadap hewan uji Daphnia sp) dengan membuat kalkulasi anti log terhadap m. Nilai m yang didapat adalah mortalitas, merupakan nilai yang mutlak sehingga perhitungan dilakukan dengan membuat antilog terhadap nilai m, sehingga didapat anti log m = anti log 1,8309adalah 67,74855.

Sehingga, nilai LC50 yang diperoleh dari ekstrak pekat Barringtonia asiatica yang diujikan kepada Daphnia sp pada praktikum kali ini yaitu 0,74789. Nilai tersebut merupakan konsentrasi yang dibutuhkan untuk mematikan setengah dari populasi (50%) Daphnia sp.

(23)

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

- Salah satu metoda yang digunakan untuk menguji senyawa yang memiliki bioaktivitas sebagai antikanker dari senyawa yang diisolasi adalah Brine shrimp lethality test (BSLT), dimana tujuan dari penggunaan metode ini adalah sebagai uji pendahuluan yang dapat mendukung penemuan senyawa-senyawa antikanker (Mudi & Salisu, 2009). Hewan uji yang digunakan pada praktikum ini adalah Daphnia sp.

- Menurut Meyer dkk. (1982) tingkat toksisitas dari ekstrak tanaman dapat ditentukan dengan melihat harga LC50-nya.

- Ekstrak buah keben Barringtonia asiatica mengandung senyawa saponin, terpenoid, alkaloid, triterpenoid, fenolik dan tanin (Duryatmo, 2006 dalam Khairun, Ahmad. 2011) yang bersifat toksik bila dalam konsentrasi tinggi, dan memiliki aktivitas farmakologis dalam konsentrasi tertentu.

5.2 Saran

(24)

DAFTAR PUSTAKA

Bimami, Elfahry. 2009. Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test).

elfahrybima.blogspot.com (Diakses pada 3 Juni 2013 pukul 22.56 WIB)

Damar. 2013. Barringtonia asiatica. http://damarweb.blogspot.com. Diakses pada tanggal 2 Juni 2013 pukul 15.00 WIB.

Dripa. 2006. Uji toksisitas akut. http://www.fk.unair.ac.id. Diakses pada tanggal 4 Juni 2013 pukul 22.21 WIB.

Eka. 2007. LC50 96 Jam Insektisida Baycarb 500 EC terhadap ikan mas

http://library.um.ac.id. Diakses pada tanggal 4 Juni 2013 pukul 22.27 WIB.

Fadhli. 2013. Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test)

http://haiyulfadhli.blogspot.com. Diakses pada tanggal 4 Juni 2013 pukul 21.00 WIB.

Nadjeeb. 2010. BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Fitokimiaumi.wordpress.com (Diakses pada pada 3 Juni 2013 pukul 23.26 WIB)

Poberson. 2011. Daphnia, klasifikasi, morfologi dan reproduksi.

http://pobersonaibaho.wordpress.com. Diakses pada tanggal 4 Juni 2013 pukul 21.30 WIB.

Rabis. 2010. Daphnia. http://rrabis.wordpress.com. Diakses pada tanggal 1 Juni 2013 pukul 13.00 WIB.

Yunithafafa. 2012. Toksisitas Akut dengan BLST. http://yunithafafa.blogspot.com. Diakses pada tanggal 4 Juni 2013 pukul 22.05 WIB.

(25)

LAMPIRAN 1. DOKUMENTASI. PRAKTIKUM PENENTUAN LC50 EKSTRAK PEKAT (UJI TOKSISITAS BRINE SHRIMP LETHALITY TEST)

GAMBAR KETERANGAN

Alat-alat yang digunakan untuk praktikum.

Proses pengenceran.

(26)

20

Cawan petri yang berisi Daphnia sp.

Proses pengambilan Daphnia sp dari cawan petri ke dalam botol vial.

Botol vial untuk kontrol yang sudah berisi Daphnia sp. dan botol vial untuk 10 ppm yang sudah berisi