Lampiran 3. Perhitungan Kadar Air Simplisia Kulit Batang Tanjung(Mimusopsi cortex)
No. Berat sampel (g) Volume awal (ml)
Lampiran 4. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Air Simplisia Kulit Batang Tanjung(Mimusopsi cortex)
Lampiran 5. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Etanol SimplisiaKulit Batang Tanjung(Mimusopsi cortex)
Lampiran 6. Perhitungan Kadar Abu Total Simplisia Kulit Batang Tanjung(Mimusopsi cortex)
Lampiran 7. Perhitungan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam Simplisia kulit batang Tanjung(Mimusopsi cortex)
No. Berat sampel (g) Berat abu (g)
% Rata-rata kadar abu tidak larut dalam asam =
Lampiran 8. Rendemen Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung
Berat simplisia kering = 200 g Berat ekstrak =22,683 g Rendemen = 𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩𝑩𝑩𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩
𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩𝑩𝑩𝑩𝑩𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩𝑩𝑩𝑽𝑽𝑩𝑩𝐱𝐱𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏 %
=
𝟐𝟐𝟐𝟐,𝟔𝟔𝟔𝟔𝟐𝟐Lampiran 9. Perhitungan Jumlah Sel pada hemositometer
Jumlah sel total (A + B + C + D) = 300 sel Jumlah sel/ml
∑𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬/𝐦𝐦𝐦𝐦= ∑𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐀𝐀+ ∑𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐁𝐁+∑𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐂𝐂 + ∑𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐃𝐃
𝟒𝟒 ×𝟏𝟏𝟏𝟏𝟒𝟒
:
= 75 x 104 sel/ml Volume Panenan Sel
𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽𝑽=𝐉𝐉𝐉𝐉𝐦𝐦𝐬𝐬𝐉𝐉𝐉𝐉𝐭𝐭𝐭𝐭𝐭𝐭𝐉𝐉𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐲𝐲𝐉𝐉𝐲𝐲𝐲𝐲𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐬𝐬𝐝𝐝𝐬𝐬𝐉𝐉𝐝𝐝𝐉𝐉𝐲𝐲 𝐉𝐉𝐉𝐉𝐦𝐦𝐬𝐬𝐉𝐉𝐉𝐉𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐭𝐭𝐬𝐬𝐝𝐝𝐉𝐉𝐝𝐝𝐭𝐭𝐉𝐉𝐲𝐲𝐲𝐲/𝐦𝐦𝐬𝐬 :
Lampiran 10. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan Uji Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung(Mimusopsi cortex)
No. Absorbansi Kontrol Sel (a)
Absorbansi kontrol Media (b)
1 0,730 0,159 2 0,695 0,159
3 0,786 0,166
Rata-Rata 0,737 0,161
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
Kadar Absorbansi (c) Rata-Rata
Lampiran 11. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung
(Mimusopsi cortex) menggunakan analisa Probit SPSS 17.0
Data Information
N of Cases
Valid 5
Rejected Missing 0
LOG Transform Cannot be
Done
0
Number of Responses >
Number of Subjects
0
Control Group 0
Warnings
Relative Median Potency Estimates are not displayed because there is no grouping
variable in the model.
Convergence Information
Number of
Iterations
Optimal Solution
Found
PROBITa 10 Yes
Parameter Estimates
Parameter Estimate Std. Error Z Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
PRO
BITa
konsentrasi ekstrak -1.344 .145 -9.246 .000 -1.629 -1.059
Intercept 2.758 .310 8.897 .000 2.448 3.068
a. PROBIT model: PROBIT(p) = Intercept + BX (Covariates X are transformed using the base 10.000 logarithm.)
Chi-Square Tests
Chi-Square dfa Sig.
PROBIT Pearson Goodness-of-Fit
Test
5.450 3 .142b
a. Statistics based on individual cases differ from statistics based on aggregated
cases.
b. Since the significance level is less than .150, a heterogeneity factor is used in
Cell Counts and Residuals
Responses Residual Probability
PR
95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak
95% Confidence Limits for log(konsentrasi
ekstrak)b
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound
.600 73.079 35.269 113.325 1.864 1.547 2.054
.650 58.290 24.377 92.142 1.766 1.387 1.964
.700 45.931 16.254 75.290 1.662 1.211 1.877
.750 35.516 10.369 61.280 1.550 1.016 1.787
.800 26.672 6.227 49.189 1.426 .794 1.692
.850 19.103 3.409 38.376 1.281 .533 1.584
.900 12.552 1.586 28.292 1.099 .200 1.452
.910 11.341 1.317 26.306 1.055 .120 1.420
.920 10.158 1.076 24.314 1.007 .032 1.386
.930 8.999 .861 22.304 .954 -.065 1.348
.940 7.860 .672 20.262 .895 -.173 1.307
.950 6.736 .505 18.167 .828 -.296 1.259
.960 5.619 .362 15.988 .750 -.442 1.204
.970 4.496 .240 13.671 .653 -.620 1.136
.980 3.343 .139 11.112 .524 -.858 1.046
.990 2.095 .058 8.026 .321 -1.234 .904
a. A heterogeneity factor is used.
Lampiran 12. Bagan Kerja Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung (Mimusopsi cortex)
Ditambahkan etanol 96%, biarkan selama 5 hari sambil sesekali diaduk
Disaring
Dicuci kembali dengan etanol 96% Dibiarkan 2 hari ditempat gelap dan Sejuk
Dienaptuangkan Disaring
Dipekatkan dengan rotary evaporator
200 g serbuk simplisia
Maserat Ampas
Maserat Ampas
Lampiran 13. Bagan Pembuatan Media RPMI
Dimasukkan kedalam erlenmeyer Ditambahkan 800 ml aquabidest steril
Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N) Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan Ditampung dalam botol steril
Diberi identitas pada botol media Disimpan pada suhu 2 – 80 C
RPMISachet 2 g Hepes 2 g NaHCO3
Lampiran 14. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK)
Dicampur
Diberi identitas pada botol MK Disimpan pada suhu 2 – 80C
Fetal Bovine Serum (FBS)
(10%)
Penisilin- Streptomisin
(1%)
Fungizone (amphotericin
B) (0,5%)
RPMI ad 100%
Lampiran 15. Bagan Penumbuhan Sel T47D
Diambil dari tangki nitrogen atau freezer Diambil beberapa tetes
Dimasukkan kedalam konikel yg berisi RPMI Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit
Dibuang supernatan
Ditambahkan 4 ml MK RPMI Di resuspensi hingga homogen Dimasukkan ke dalam flask
Ditambahkan 5 ml MK kedalam setiap flask Dihomogenkan
Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted Diberi identitas pada flask
Disimpan dalam inkubator CO2 Sel T47D
Lampiran 16. Bagan Panen Sel T47D
Dipersiapkan dan dikondisikan
Diamati apakah sel telah konfluen 80% Dibuang MK dari flask dengan mikropipet Dicuci sel 2x dengan PBS
Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25% Diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 5 menit Ditambahkan 4 ml MK
Di resuspensi dengan mikropipet
Diamati sel dibawah mikroskop inverted
Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol Ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel T47D, alat, dan bahan
Lampiran 17. Bagan Penghitungan SelT47D
Diambil 10µl panenan sel
Dipipetkan kedalam hemositometer Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop
Kultur Sel T47D
Lampiran 18. Bagan Pembuatan Larutan Uji
Ditimbang sebanyak 5 mg Dimasukkan kedalam polytube Dilarutkan dalam 50 µl DMSO Di vortex
Dibuat pengenceran sampai diperoleh konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml, dan 31,25 µg/ml Ekstrak
etanol
Lampiran 19. Bagan Pengujian Sitotoksik
Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan kepadatan 1 x 104
Diinkubasi selama 24 jam Dibuang medium
Ditambahkan medium baru Ditambahkan larutan uji Diinkubasi selama 24 jam
Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam Dicuci dengan PBS
Ditambahkan 100 µl MK dan 10 µl MTT (5 mg/ml) Diinkubasi selama 4-6 jam
Ditambahkan SDS (sebagai stopper) Dibungkus dengan aluminium foil Dibiarkan selama 1 malam
Dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm
Dihitung % sel hidup
Dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan SPSS 17
Sel T47D
Absorbansi
Lampiran 22. Gambar morfologi sel kanker (dilihat dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10) setelah pemberian ekstrak dari konsentrasi tertinggi hingga terendah
Konsentrasi ekstrak 500 µg/ml Konsentrasi ekstrak 250 µg/ml
Konsentrasi ekstrak 125 µg/ml Konsentrasi ekstrak 62,5 µg/ml
Lampiran 24. Gambar Mikroskop Inverted, Elisa Reader, dan Inkubator CO2
Keterangan : Elisa Reader
Keterangan : Mikroskop Inverted
Glosarium
Analisis Probit Jenisregresidigunakan untuk menganalisisvariabel responbinomial.
Apoptosis Mekanism
tidak diperlukan oleh tubuh.
Brine-Shrimp Lethality Bioassay
Salah satu metode untuk menguji bahan-bahan yang bersifat sitotoksik. Metode ini menggunakan larva
Artemia salina leach sebagai hewan coba.
Cell Line (Sel kultur) Sel yang digunakan dalam penelitian yang dikembangkan dan ditumbuhkan/berploriferasi pada media kutur secara in vitro. Sel kultur dapat diambil dari jaringan asal ataupun memperbanyak sel yang sudah ada.
Continous Cell Line Sekelompokselmorfologisseragam yangdapat diperbanyaksecara in vitrountukwaktu yang tidak tertentu.
FBS(Fetal Bovine Serum):
Serum yang umumnya digunakansebagai suplemen untukmedium pertumbuhanbasal dalamkultur sel Hemositometer Perangkat yang awalnya dirancang untuk
penghitungan sel darah. Sekarang juga digunakan untuk menghitung jenis sel serta partikel mikroskopis lainnya.
Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ) buffer, yang berisi kedua kelompok terionisasi positif dan negatif, dimana kelompok amina sekunder dan tersier memberikan muatan positif dan muatan negatif yang ditawarkan oleh sulfonat dan gugus asam karboksilat.
Kanker Istilah yang digunakanuntuk penyakitdi manasel-sel
abnormalmembelahtanpa kontroldan mampumenyerang jaringan lain. Sel-sel kankerdapat
Kemoterapi
(chemotherapy)
Penggunaan zat Dalam penggunaan modernnya, istilah ini hampir merujuk secara eksklusif kepada obat sitostatik yang digunakan untuk merawat
Mitokondria tempat berlangsungnya fungsi
seperti
PBS(Phospate Buffer Saline)
Larutan buffer yang biasa digunakan dalam penelitian biologi. Ini adalah berbasis air garam larutan yang mengandung natrium klorida, natrium fosfat, dan, dalam beberapa formulasi, klorida kalium dan fosfat kalium. Gugus fosfat buffer membantu mempertahankan pH yang konstan. Konsentrasi osmolaritas dan ion dari solusi biasanya cocok dengan tubuh manusia (isotonik).
Proliferasi Fase
tanpa hambatan Media Roswell Park
MemorialInstitute (RPMI)
Salah satu media yang banyak digunakan untuk menumbuhkan sel mamalia, terutama sel suspensi, contohnya sel limfosit manusia. Selain itu, media ini juga dapat digunakan untuk menumbuhkan sel hybrid. Media ini berwarna merah karena adanya phenol red sebagai indikator pH untuk mendeteksi terjadinya perubahan pH akibat metabolisme sel. Jika sisa metabolisme sudah terakumulasi di media, maka warna media akan berubah menjadi kuning. Hal ini menandakan bahwa sel harus dikultur di media baru agar sel tidak mati akibat sisa metabolisme tersebut. Selain itu, RPMI 1640 mengandungCaCl2,Ca(NO3)2.4H2O,
KCl,MgSOz7H2O, NaCl, NaHCO, Na2HPO4.7H2O , glukosa, Glutathione, phenol red, berbagai asam amino (L-aspargie, L-Cystine, tirosin, valin, dan sebagainya), serta vitamin (biotin, pantotenat, kolin) Sel T47D Continous cell line yang diisolasi dari jaringan
Sitotoksik Zat/obat yang merusak dan membunuh sel normal dan sel kanker, serta digunakan untuk menghambat pertumbuhan tumor malignan.
Subkultur Pemindahan sel, jaringan atau organ dari media lama ke media baru, baik media itu sama maupun berlainan dengan media semula, dengan tujuan memperoleh pertumbuhan baru ataupun perkembangan dari inokulum.
Uji Sitotoksik Salah satu pengembangan metode untuk memprediksi keberadaan senyawa yang bersifat toksik pada sel.
