Mira Ariyani 1548201102 Siti Aniasih 1548201114
KROMATOGRAFI KERTAS
Kromatografi Kertas adalah Cara pemisahan suatu komponen zat didalam campuran dengan jalan penyarian menggunakan fase gerak zat cair dan fase diam yang berupa air / zat cair lainnya yang berada dalam serat – serat selulosa pada kertas.
Hal – hal yang perlu diperhatikan : 1. Jenis Kertas
a. Kertas selulosa murni / kertas ini khusus dibuat untuk kromatografii dapat dipergunakan kertas whatman no. 1 dan no. 3 yang terdiri dari x-selulosa 98-99% dan B-selulosa 0i3-1i0%.
b. Kertas selulosa yang telah dimodifikasi
1). Dengan zat kimiai contoh : kertas diasetilasi dengan zat kimia untuk pemisahan steroid.
2). Kertas yang di Impregnasei contoh : kertas di impregnasi dengan minyak untuk pemisahan amina.
3). Kertas yang diberi zat tambahan 2. Pemurnian Fase Gerak
Sebagai fase gerak biasanya berupa campuran yang bersifat netrali asami basa.
3. Penotolan Contoh
Untuk penotolan contoh pada kertas biasanya digunakan pipet mikro. Karena umumnya kadar larutan contoh 0i1% - 1% dan jumlah yang ditotolkan antara 1 – 10 ml.
Agar bercak berukuran kecil digunakan pengeringan. Titik awal penotolan diberi tanda dengan pensili jarak awal penotolan dari ujung kertas 2-3 cmi sedangkan jarak penotolan satu dengan lainnya lebih kurang 2 cm. Agar dijaga supaya titik penotolan tidak tercelup dalam fase gerak.
4. Phase Pengembangan
c. Pengembangan mendatar dengan sumbu. Senyawa yang dipisahkan akan membentuk noda yang melingkar.
e. Pengembangan dua dimensi
Seringkali campuran senyawa tidak bisa dipisahkan sempurna dengan hanya menggunakan system pelarut tunggal. Setelah pengembangan dengan pelarut pertama dikembangkan sekali lagi dengan system pelerut kedua.
Senyawa yang akan dipisahkan ditotolkan pada ujung kertas kemudian dilakukan proses pengembangan dengan cairan pertama. Setelah itu kertas diputar 90° i dengan dilakukan proses pengembangan dengan cairan pengembangan yang kedua.
f. Pengembangan bertingkat
Pengembangan dengan cara ini digunakan dengan dua cairan pengembangan yang komposisinya berbedai misalnya pengembangan pertama dengan menggunakan cairan yang polar sampai jarak tertentu. Kemudian untuk senyawa yang tertinggal pada tempat penotolan digunakan cairan pengembangan lain yang dapat membawa senyawa yang semula tetap terdapat pada titik penotolan.
g. Overrun dan pengembangan ganda ( Overrun and multiple development )
Dilakukan proses pengembangan sampai mencapai batas pengembangani kertas diambil kemudian dikeringkan di udara. Kemudian dilakukan proses pengembangan kembali sampai cairan mencapai batas pengembangan. Demikian dilakukan berkali – kali sehingga dapat diperoleh hasil kertas tersebut harus dipanaskan pada suhu tertera untuk menghasilkan bercak yang dapat dilihat.
b. Cara Fisika
Untuk bercak dari senyawa-senyawa yang mempunyai sifat radioaktif dapat dideteksi dengan otoradiografi dengan suatu scanner yang akan mencatat dalam bentuk grafik puncak radioaktivitas yang menunjukan letak dari senyawa yang diperiksa.
d. Cara Biologis
Untuk mendeteksi senyawa yang mempunyai aktifitas biologis tertentu misalnya antibiotika. Cara ini lebih spesifik jika diperbandingkan terhadap cara fisika dan kimia. Bercak dari kromatofram diambil dan diletakkan dalam agar yang telah ditumbuhi dengan mikroorganisme tertentui sesudah diinkubasi dan diameter dari hambatan dapat menunjukan kadar/ potensi dari antibiotika.
PROSEDUR KERJA : Komponen :
1. Bejana Kromatografi (Chamber) 2. Fase Diam (kertas kromatografi) 3. Fase gerak/ Eluen
4. Pipa Kapiler
Cara Kerja :
1. Sampel ekstraksi dengan pelarut yang sesuai sehingga didapat zat – zat yang akan dianalisa.
2. Siapkan chamber
3. Siapkan kertas kromatografi dengan cara diberi garis 2 cm dari bagian bawah dan 10 – 12 cm dari bagian bawah
4. Masukkan eluen ditambah sedikit air dan juga kertas kromatografi
5. Tutup bejana dan biarkan selama 2 – 3 jam sampai terjadi kesetimbangan
6. Tambahkan lagi eluen sampai kira-kira kertas dapat tercelup
7. Dengan menggunakan pipa kapiler untuk kromatografii sampel ditotolkan pada kertas saring digaris bagian bawah
8. Kertas tersebut kemudian digantungkan pada chamber dengan posisi bagian bawahnya terendam pada elueni kemudian dielusi sampai dengan mencapai garis batas bagian atas
9. Setelah dielusii kertas dikeringkan dengan cara diangin-anginkan dan hindarkan dari panas yang berlebihan zat warna akan timbul berupa bercak.
10. Tentukan titik tengah bercak 11. Hitung harga Rf
Jarak titik awal eluen – garis akhir eluen Nilai Rf
(Retordation Factor/ Rate of Flow)
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang ditempuh pelarut; beberapa lainnya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap
sama,misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat.Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf=
jarak yang ditempuh oleh senyawa jarak yang ditempuh oleh pelarut
Misalnya, jika salah satu komponen dari campuran bergerak Bagaimana halnya jika substansi yang anda ingin
identifikasi tidak berwarna?
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan membuat bercak menjadi tampak dengan mereaksikannya dengan beberapa pereaksi yang menghasilkan produk yang berwarna. Contoh yang baik yaitu kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin memisahkan asam amino tertentu yang terdapat dalam campuran. Untuk menyederhanakan, mari berasumsi bahwaanda telah mengetahui kemungkinan campuran hanya mengandung lima asam amino yang
umum.Setetes larutan campuran ditempatkan pada garis dasar kertas, dan dengan cara yang sama ditempatkan asam amino yang telah diketahui diteteskan disampingnya. Kertas lalu ditempatkan dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M, dan asam amino yang telah diketahu ditandai 1 sampai 5.
Kromatografi kertas dua arah
Kromatografi kertas 2 arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa.dapat mengerjakannya secara sempurna hal ini dengan senyawa-senyawa yang tidak berwarna,tetapi anda harus menggunakan banyak imajinasi dalam menjelaskan apa yang terjadi !
Waktu ini kromatogram dibuat dari bercak tunggal dari campuran yang ditempatkan kedepan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan dalam sebuah pelarut sebelum dan sesudah sampai pelarut mendekati bagian atas kertas.Dalam gambar, posisi pelarut ditandai dengan pensil sebelum kertas kering. Posisi ini ditandaisebagai SF1 yaitu pelarut
depan untuk pelarut pertama. Kita akan menggunakan dua pelarut yang berbeda Jika anda melihatnya lebih dekat, anda dapat melihat bahwa bercak pusat besar dalam kromatogram sebagian biru dan sebagian hijau. Dua pewarna dalam campuran memiliki nilai Rf
yang hampir sama. Tentunya, nilai-nilai ini bisa saja sama, keduanya memiliki warna yang sama; dalam hal ini anda tidak dapat mengatakan bahwa ada satu atau lebih pewarna dalam dalam bercak itu.Apa yang anda kerjakan sekarang adalah menunggu kertas kering
seluruhnya, dan putar 90o dan perlakukan kromatogram kembali dengan pelarut yang berbeda.Hal yang sangat tidak dipercaya bahwa dua bercak yang membingungkan akan memiliki nilai Rf dalam pelarut kedua sama halnya dengan pelarut yang pertama, dengan demikian bercak-bercak akan bergerak dengan jumlah yang berbeda.
Gambar berikutnya menunjukkan apa yang mungkin terjadi pada berbagai bercak pada kromatogram awal. Posisi pelarut kedua juga ditandai.Tentunya anda tidak dapat melihat bercak-bercak dalam posisi awal dan akhir; Bercak-bercak telah bergerak!
Jika anda akan mengidentifikasi bercak-bercak dalam campuran, secara jelas anda tidak dapat melaksanakannya dengan perbandingan substansi pada kromatogram yang sama
