METODE UJI KUALITATIF DNA DENGAN
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Oleh:
GATI WINDIASTIKA, SP. MP (Calon Pengawas Benih Tanaman)
Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya
Pengujian DNA tanaman merupakan suatu teknik biologi molekular yang digunakan untuk kepentingan pengujian terhadap materi uji berdasarkan profil DNA-nya. Pengujian DNA memanfaatkan profil DNA, yaitu sekumpulan data yang menggambarkan susunan DNA yang dianggap khas untuk individu yang menjadi sampel. Dalam pengujian DNA, hanya sebagian kecil berkas DNA yang dipakai untuk pengujian. Sasaran utamanya adalah bagian DNA yang berisi pengulangan urutan basa. Pengujian DNA yang meliputi analisis secara kuantitatif dan kualitatif, merupakan tahap lanjutan pengujian yang harus dilakukan setelah diperoleh isolasi DNA tanaman. Hal ini dilakukan untuk menentukan kemurnian suatu galur atau kultivar serta untuk menguji masuknya materi genetik tertentu (misalnya dalam mendeteksi materi transgenik) ke dalam populasi.
Uji kualitatif DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis dari hasil isolasi DNA. Metode elektroforesis merupakan teknik yang dapat digunakan untuk menggambarkan pergerakan molekul-molekul bermuatan dalam medan listrik ke arah elektroda dengan muatan berlawanan atau teknik yang didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan dalam elektroforesis adalah gel agarosa, suatu polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan separasi DNA dengan kisaran ukuran yang luas. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 basepairs dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 basepairs dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan
DNA (sekuensing). Berikut ini perbedaan antara elektroforesis gel agarosa dengan poliakrilamid:
Tabel 1. Perbedaan Elektroforesis Gel Agarosa dan Poliakrilamid
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA ELEKTROFORESIS GEL POLIAKRILAMID
1. Dapat memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb tergantung dari konsentrasi gel agarose yang digunakan 2. Power lebih rendah
3. Medan gerak biasanya horisontal 4. Mempunyai laju pemisahan lebih
cepat
1. Lebih effektif untuk pemisahan fragmen DNA antara 5-500bp 2. Power ekstrim tinggi
3. Medan gerak secara vertikal dan listriknya konstan
4. Ukuran perbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp
5. Pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarose, karena biasanya digunakan poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi.
A. CARA KERJA ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel agarosa dan diletakkan pada kutub negatif. Apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutub positif. Gel agarosa dengan tebal 0,5 cm akan memaksa DNA dengan ukuran 5 sampai 60 kb bergerak melewati celah kerangka agarosa yang membentuk pori-pori dengan ukuran tertentu sesuai dengan konsentrasi agarosa. Laju migrasi atau kecepatan pergerakan DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA.
Sebelum dilakukan elektroforesis, sampel perlu ditambahkan larutan pemberat (loading buffer) yang terdiri dari polietilenglikol atau gliserin, bromfenol biru dan aquades. Penambahan gliserin ini akan menaikkan densitas sampel sehingga akan masuk ke dalam sumuran gel agarosa dengan baik. Sedangkan bromfenol biru merupakan pewarna yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi jalannya sampel pada gel agarosa.
Setelah proses elektroforesis selesai, selanjutnya dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Penambahan Etidhium Bromida (EtBr) pada proses visualisasi akan mengikat DNA sehingga migrasi DNA dapat terdeteksi jika dikenai sinar ultraviolet.
Larutan EtBr akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan terlihat di bawah lampu ultraviolet. Larutan EtBr ini digunakan sebagai alat untuk mengidentifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. Selain itu larutan EtBr akan terikat diantara dua untai ganda DNA dan berinteraksi diantara basa molekul DNA, sehingga menyebabkan pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar kuning jingga bila disinari ultraviolet pada panjang gelombang yang pendek karena pewarna ini mengandung zat fluoresence.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel agarosa akan tampak setelah proses pewarnaan. Satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan panjang amplikon atau ukuran molekul dalam pita sampel dengan mengelektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya.
B. FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KECEPATAN MIGRASI DNA
Kecepatan migrasi selama DNA bergerak menembus gel agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor utama, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya, misal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah berbanding terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa-basa.
2. Konsentrasi Gel Agarosa
Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan.
Tabel 2. Konsentrasi Gel Agarosa dan Ukuran Molekul DNA
No Konsentrasi Gel Agarose (%) Effisiensi Range Pemisahan Pada DNA Linier (kb)
1 0,3 60 – 5 2 0,6 20 – 1 3 0,7 10 – 0,8 4 0,9 7 – 0,5 5 1,2 6 – 0,4 6 1,5 4 – 0,2 7 2,0 3 – 0,1 3. Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk atau konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular, circular-opened dan linier. Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:
a. konsentrasi gel agarosa
b. kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan
c. densitas kembaran superheliks pada bentuk super-helix circular
d. pada beberapa kondisi bentuk super-helix circular lebih cepat dibanding bentuk linier
e. tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, maka pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk super-helix circular
f. konsentrasi EtBr kritis antara 0,1mg/ml-0,5ml/mg 4. Penggunaan Voltage dan Arah Dari Bidang Elektris
Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarosa bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.
5. Komposisi Basa DNA atau Temperatur
Elektroforesis DNA pada gel agarosa tidak dipengarui oleh komposisi basa DNA maupun oleh suhu kamar saat gel dijalankan. Sehingga dalam gel agarosa mobilitas elektroforesis fragmen DNA dengan berbagai ukuran tidak berubah antara 4oC dan 30oC. Pada umumnya gel agarosa dijalankan pada temperatur kamar. Namun gel yang mengandung
agarosa kurang dari 1,5% adalah sangat lunak, sehingga paling baik bila dijalankan pada 4oC supaya gel cukup keras.
6. Keberadaan Pewarna DNA
Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence
untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, sehingga pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja dan lindungi mata dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator. 7. Komposisi Buffer Elektroforesis
Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarosa, misal:
a. Tris-acetate: umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.
b. Tris-borat: resolusi cukup baik, tetapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarosa kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarosa.
C. PROSEDUR ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Elektroforesis dengan gel agarosa merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan pemisahan fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya dengan menggunakan arus listrik. Prosedur elektroforesis dengan gel agarosa ialah sebagai berikut: 1. Siapkan gel agarosa 0,8 – 1 %. Misal untuk gel agarosa 1 % pada
cetakan ukuran besar, maka bubuk agarosa ditimbang sebanyak 0,7 gram kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer (Gambar 1).
Gambar 1. Bubuk Agarosa Dimasukkan Dalam Erlenmeyer
Gambar 2. Penambahan Larutan Buffer TAE
Gambar 3. Erlenmeyer Ditutup dengan Plastik Wrapping
Gambar 4. Erlenmeyer Dipanaskan Dalam Microwave
3. Erlenmeyer ditutup dengan plastik wrapping dan diberi lubang kemudian dipanaskan dalam microwave hingga agarosa larut (Gambar 3 dan 4). 4. Setelah agarosa larut yang ditandai dengan larutan berubah menjadi
bening, dinginkan selama 1-2 menit hingga temperatur hangat-hangat kuku atau sekitar 80oC.
5. Kemudian larutan agarosa dituangkan dalam cetakan yang telah diatur keseimbangan posisinya dan telah dipasang sisirnya. Tuangkan dari sebelah pojok kanan bawah dan dibiarkan memadat selama 30-45 menit pada suhu ruang (250C) (Gambar 5).
6. Apabila gel telah mengeras, sisir diambil kemudian gel dan cetakannya dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis dan dituang TAE buffer sampai gel terendam, sekitar 1 mm di atas gel (Gambar 6).
7. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur loading buffer dengan komposisi 2 μl DNA dan 1 μl loading buffer. Semuanya dicampur dengan pipet mikro kemudian diinjeksikan ke dalam sumur pada gel agarosa (Gambar 7).
Gambar 5. Larutan Agarosa Dituangkan Dalam Cetakan
Gambar 6. Gel dan Cetakan Dimasukkan Ke Dalam Chamber
Gambar 7. Sampel Dimasukkan Pada Masing-Masing Sumuran
Gambar 8. Proses Running Gel Agarosa
Gambar 9. Perendaman Gel Agarosa Pada Larutan TAE yang Telah Ditambahkan EtBr
Gambar 10. Proses Dokumentasi Pada Chemidoc Gel Imaging
8. Hubungkan elektroda dengan power supply yang dialiri arus listrik 50 Volt hingga proses running selesai (sekitar 60 menit) atau mencapai sekitar 1,5 cm dari batas bawah gel agarosa (Gambar 8).
9. Setelah selesai, matikan dan ambil gel. Kemudian rendam gel agarosa sekitar 15-20 menit pada larutan TAE yang telah ditambahkan 5 µl EtBr 1 mg/ml (Gambar 9).
10. Pindahkan gel agarosa ke UV-translluminator dan amati hasilnya. Selanjutnya hasil didokumentasikan dengan menggunakan Chemidoc Gel Imaging (Gambar 10).
Elektroforesis gel agarosa juga dapat digunakan untuk mengamati hasil PCR DNA. Perbandingan komposisi yang digunakan antara loading buffer dan sampel adalah 1 : 5. Marker yang digunakan memiliki ukuran 1 kb sebanyak 1 μl.
DAFTAR PUSTAKA
Brown, T. A. 2003. Pengantar Kloning Gen, diterjemahkan oleh Prasena. Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. p.11-15.
Haryana. 1989. Petunjuk Laboratorium Rekayasa Genetika. UGM Press. Yogyakarta.
Natow. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miraclebiology.blogspot. com. Diakses tanggal 27 Maret 2012.
Mahmuddin. 2010. Elektroforesis Gel Agarosa. Available on http:// mahmuddin.wordpress.com/2010/08/31/elektroforesis-gel-agarosa. Diakses tanggal 27 Maret 2012.
Puspalarasti. 2011. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas. Available on http://puspalarasati.wordpress.com/author/puspalarasati.Diakses tanggal 27 Maret 2012.
Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA. 1 : 112-113.
Wongsosupantio. 1992. Elektroforesis Gel Protein. Pusat Antar Universitas. UGM. Yogyakarta. p.1-4, 12-13.
