PENGUJIAN PROTEIN
SECARA KUANTITATIF DAN KUALITATIF
LAPORAN PRAKTIKUMDiajukan Sebagai Syarat Untuk Memenuhi Tugas Praktikum Biokimia pada
Program Studi Teknik Produksi Tanaman Pangan Hortikultura Jurusan Produksi Pertanian
Politeknik Negeri Jember
Oleh:
HIKMATULLAH ADICAHYO NIM: A42140400
PROGRAM STUDI TEKNIK PRODUKSI TANAMAN
PANGAN HORTIKULTURA
JURUSAN PRODUKSI PERTANIAN
POLITEKNIK NEGERI JEMBER
2014
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
protein, istilah yang berasal dari bahasa Yunani proteios yang berarti “peringkat satu” atau “yang utama”.
Ditinjau dari komposisi kimianya, protein merupakan polimer dari sekitar 20 jenis α-amino. Massa molekul relatifnya berkisar dari sekitar 6.000 hingga beberapa juta. Unsur utama penyusun protein adalah C, H, O dan N. Banyak juga protein yang mengandung belerang (S) dan dalam jumlah yang lebih sedikit fosforus (P). Beberapa protein mengandung besi, mangan, tembaga dan iodin. Rangkaian yang terdiri dari 10 atau lebih asam amino disebut polipeptida. Ia disebut protein jika massa molekul relatifnya mencapai atau lebih dari 10.000
Asam amino adalah suatu golongan senyawa karbin yang setidak-tidaknya mengandung satu gugus karboksil (-COOH) dan satu gugus amino (-NH2). Asam
amino bersifat amfoter (dapat bereaksi baik dengan asam maupun dengan basa). Jika direaksikan dengan asam, maka asam amino akan menentukan struktur, kelarutan, serta fungsi biologis dari protein. Kecuali glisin, semua asam amino bersifat optis aktif, karena adanya atom C-α yang bersifat asimetris. Asam amino tersebut dapat disintesis dalam tubuh, kecuali asam amino essensial. Asam amino yang dapat disintesis dalam tubuh disebut asam amino nonessensial.
Suatu polipeptida atau protein dapat mengalami hidrolisis jika dipanaskan dengan asam klorida pekat, sekitar 6 M. Memanaskan larutan protein dapat menyebabkan denaturasi protein. Denaturasi juga dapat disebabkan oleh perubahan pH yang ekstrim, oleh beberapa pelarut seperti alkohol atau aseton, oleh zat terlarut seperti urea, oleh detergen, atau oleh pengguncangan yang intensif. Protein dalam bentuk alamiahnya disebut protein asli (natif), dan setelah denaturasi disebut protein terdenaturasi. Protein terdenaturasi hampir selalu kehilangan fungsi biologisnya.
1.2 Tujuan
Untuk mengetahui cara kerja pada setiap penentuan uji kualitatif dan kuantitatif pada protein
Mahasiswa dapat mengetahui cara kerja pada setiap penentuan uji kualitatif dan kuantitatif pada protein
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
Biasanya protein mengandung 100-1000 molekul asam amino dan mempunyai berat molekul 16000-1.0000.0000. Komposisi dasar dari protein sekitar 55 % karbon, 7 % hidrogen, 23 % oksigen, 16 % nitrogen, 1 % sulfur dan kurang dari 1 % fosfor. Protein dapat digolongkan menurut struktur susunan molekulnya, larutannya, adanya senyawa lain dalam molekul, tingkat degradasinya dan fungsinya (Winarno, 1984 ; Tarigan, 1983).
Satu unit asam amino dalam rantai polipeptida disebut residu. Rantai polipeptida mempunyai arah sebab unit penyusun mempunyai ujung yang berbeda yaitu gugus amino-a dan gugus karboksil-a. Ujung amino diletakkan pada awal rantai polipeptida, berarti urutan asam amino dalam rantai polipeptida ditulis dengan diawali oleh residu amino- terminal (Styrer, 2000).
Kalau susunan asam amino jumlah dan jenisnya di dalam protein makanan sama dengan susunan yang diperlukan tubuh untuk sintesa protein tubuh, maka semua asam amino protein makanan tersebut akan dipergunakan, sehingga efisisensi penggunaannya menjadi 100 %. Bila ada satu atau lebih asam amino essensial mempunyai kwantum yang lebih rendah dari yang diperlukan untuk sintesa protein tubuh, maka hanya sebagian saja dari seluruh asam amino essensial makanan tersebut dapat dipergunakan, sehingga efisiensi penggunaan protein makanan tersebut lebih rendah dari 100 %. Jadi persentase penggunaan protein makanan (kualitas protein makanan) ditentukan oleh ada atau tidaknya semua jenis asam amino essensial di dalam makanan tersebut mencukupi kebutuhan untuk sintesa protein tubuh .(Djaeni, 2008).
kelarutan protein dalam air berkurang. Pada protein ujung C asam amino yang terbuka dapat bereaksi dengan alkohol dalam suasana asam membentuk senyawa protein ester. Pembentukan ester ini ditunjukan oleh adanya endapan yang terbentuk (Rismaka, 2009).
BAB 3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
3.3 Cara Kerja Uji Millon
1. Menyiapkan 3 tabung reaksi
2. Mengisi tabung reaksi pertama dengan 2 mL albumin, mengisi tabung kedua dengan 2 mL gelatin dan mengisi tabung ketiga dengan 2 mL kasein.
3. Menambahkan reagent millon sebanyak 4 tetes pada masing-masing tabung, maka akan terjadi endapan.
4. Kemudian memanaskan dalam pemanas air yang mendidih.
5. Mengamati perubahan yang terjadi, reaksi positif ditunjukkan dengan perubahan menjadi warna merah.
Uji Biuret
1. Menyiapkan 3 tabung reaksi
2. Mengisi tabung reaksi pertama dengan 2% albumin, mengisi tabung kedua dengan 2% gelatin dan mengisi tabung ketiga dengan 2% kasein.
3. Menambahkan 1 mL NaOH 0,1 N dan CuSO4 0,1 N sebanyak 2 tetes pada
masing-masing tabung.
4. Mengamati perubahan yang terjadi, reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya cincin warna ungu.
Uji Pengendapan oleh Alkohol
1. Menyiapkan 3 tabung reaksi dan mengisi masing-masing dengan 5 mL albumin 2%
2. Menambahkan ke dalam tabung pertama 1 mL HCL 0,1M dan 6 mL etanol 95%, tabung kedua 1 mL HCL 0,1M dan 6 mL etanol 95% serta tabung ketiga 1 mL Buffer Asetat dan 6 mL etanol 95%.
3. Mengamati perubahan yang terjadi, reaksi positif ditunjukkan dengan banyaknya pengendapan
Uji Bradford Preparasi Sampel
2. Mengambil cairan yang homogen dan memasukkan dalam eppendorf tube. 3. Memvortex selama 10 menit.
4. Mensentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10.000
5. Mengambil supernatant dan memindahkan pada eppendorf tube yang baru, untuk dihitung protein terlarut totalnya.
Penyiapan Kurva Standart
1. Menyiapkan 6 eppendorf dan mengisi dengan larutan dibawah ini :
µg BSA µl H20
2. Menghomogenkan keenam eppendorf tube tersebut dengan vortex.
3. Mengukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
4. Setelah itu membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi protein dalam tabung beserta persamaan garisnya.
Pengukuran Sampel
1. Memipet sebanyak 100 µl larutan sampel protein dalam eppendorf tube dan menambahkan sebanyak 960 µl reagent Bradford, membuat sebanyak tiga kali ulangan.
2. Menghomogenkan menggunakan vortex
3. Setelah homogen memasukkan ke dalam kuvet dan mengukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
4. Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel.
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan Uji Millon
LARUTAN REAKSI
Kasein Terdapat endapan (positif)
Albumin Terdapat endapan (positif)
Gelatin Tidak ada endapan (negatif)
Uji Biuret
LARUTAN REAKSI
Kasein Terjadi perubahan warna menjadi
ungu muda (positif), ikatan peptida lebih rendah dari gelatin (++)
Albumin Terjadi perubahan warna menjadi
paling rendah (+)
Gelatin Terjadi perubahan warna menjadi
ungu muda (positif), ikatan peptida paling tinggi (+++)
Uji Pengendapan oleh Alkohol
LARUTAN REAKSI
Albumin + HCL Setelah penambahan etanol, larutan tetap bening (negatif)
Albumin + NaOH Setelah penambahan etanol, larutan tetap bening (negatif)
Albumin + Buffer Setelah penambahan etanol, larutan menjadi keruh (positif)
Reaksi Millon digunakan khusus untuk protein yang mengandung asam amino dengan radikal hidroksi fenil sebagai penyusunnya akan membentuk gumpalan berwarna putih akan terbentuk dan segera berubah menjadi merah pada pendidihan. Karena pada praktikum kali ini kepekatan reagent Millon kurang tinggi maka tidak terjadi perubahan warna hanya terjadi pengendapan
Uji Biuret
Uji Biuret didasarkan pada reaksi antara ion Cu2+dan ikatan peptide dalam
suasanabasa. Warna kompleks ungu menunjukkan adanya protein. Intensitas warna yang dihasilkan merupakan ukuran jumlah ikatan peptida yang ada dalam protein. Ion Cu2+ dari pereaksi Biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan
polipeptida atau ikatan-ikatan peptide yang menyusun protein, dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan peptide atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau ikatan peptida. Protein melarutkan hidroksida tembaga untuk membentuk kompleks warna. Reaksi pembentukan warna ini dapat terjadi pada senyawa yang mengandung dua gugus karbonil yang berikatan dengan nitrogen atau atom karbon.
Uji Pengendapan oleh Alkohol
positif dan ion negatif sama sehingga penambahan senyawa organik seperti aseton dan alkohol yang bersifat nonpolar (muatan = 0) cenderung menurunkan kelarutan protein. Sedangkan dengan penambahan asam atau basa menyebabkan larutan albumin kelihatan agak bening, hal ini menandakan naiknya kelarutan albumin. Hal ini berdasarkan sifat protein yang amfoter (protein dalam suasana pelarut yang bersifat asam akan bertindak sebagai basa dan dalam suasana pelarut yang bersifat basa akan bertindak sebagai asam).
Uji Bradford
Dapat diketahui dari nilai absorbansi standar BSA, maka diperoleh kurva standar BSA dengan persamaan regresi y = 0,0407x + 0,081. Apabila absorbansi sampel adalah 1,460 dari ekstrak enzim kasar yang diperoleh dari Kedelai. lalu dimasukkan ke dalam persamaan regresi, maka diperoleh rata‐rata kadar proteinnya adalah 33,88 µg/µl Oleh karena itu, dari hasil percobaan tersebut dapat diketahui bahwa protein tersebut terlarut pada Tris Buffer.
Konsentrasi Absorbansi
0 0
5 0,199
10 0,401
15 0,902
20 1,072
40 1,572
BAB 5 PENUTUP
5.1 Kesimpulan Uji Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.
Uji Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.
Uji Pengendapan oleh Alkohol
Ada tidaknya kandungan protein dalam suatu bahan pangan dapat diketahui dengan uji kadar protein metode pengendapan alkohol. Jika setelah ditambahkan alkohol 95% terbentuk endapan, maka terdapat kandungan protein dalam bahan tersebut
5.2 Saran
Sebaiknya, alat dan bahan yang digunakan selama percobaan bisa dilengkapi, untuk memudahkan praktikan dalam melakukan percobaan sehingga praktikum dapat berjalan lancar, sesuai dengan penuntun, dan tidak ada yang tertunda.
DAFTAR PUSTAKA
Rismaka, 2009. http://www.rismaka.net/2009/06/uji-kualitatif-protein-dan-%20asam-ami no.html.
Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta
