15
3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian
Sampel spons Petrosia (petrosia) nigricans yang digunakan untuk penelitian di laboratorium di peroleh di bagian barat daya Pulau Pramuka Gugusan Kepulauan Seribu DKI Jakarta pada kedalaman 7 meter. Perawatan spons yang telah difragmentasi dilakukan selama 3 bulan (September – November 2010) di Laboratorium Pusat Studi Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Jakarta Utara. Waktu pengambilan sampel sesuai dengan penanggalan Bulan Qomariyah selama satu bulan. Pengawetan dan pengamatan sampel spons dilakukan di Laboratorium Histologis Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan dan alat yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Tabel 1 dan Tabel 2 di bawah.
Tabel 1. Bahan yang digunakan dalam penelitian
Bahan Kegunaan Spons jenis Petrosia (petrosia) nigricans Jenis yang diteliti
Formalin (4% dan 10%) Bahan pengawet, desilifikasi
Air destilasi Desilifikasi, bahan pencuci dalam pewarnaan
Air keran Desilifikasi, bahan pencuci dalam
pewarnaan
HCl (Asam Klorida) Bahan desilifikasi
Parafin bahan embedding dan blocking
Xylol bahan clearing
Etanol (70%, 80%, 90%, 95%, dan 100%) bahan dehidrasi dan rehidrasi
Enthellan perekat mounting
Tabel 2. Alat yang digunakan dalam penelitian
Alat Kegunaan Underwater camera (Canon A640) Dokumentasi
Alat selam (satu set) Mengambil sampel
Cutter dan pisau stainless steel Memotong jaringan spons
Plastik sample Menyimpan sampel spons
Kolam Pemeliharaan Wadah pemeliharaan
Kapal motor Transportasi pengambilan sample di alam
Cool box Wadah pengangkutan sampel
Jaring sample Wadah saat pengambilan sampel
Botol sample Tempat sampel air
Tali Polyetilen (benang kenur) Alat bantu aklimatisasi sampel Termometer lapangan, Refraktometer Mengukur suhu, salinitas
Kertas label Memberi nama sampel
Basket jaringan Tempat jaringan saat dehidrasi
Pinset dan jarum Alat bantu sectioning
Gelas objek dan cover glass Meletakan preparat awetan
Blok kayu Menempelkan hasil blocking
Korek Api Alat bakar
Mangkok Tempat air
Mikrotom Spencer 820 Alat bantu sectioning
Tutup pagoda Alat bantu blocking
Lemari pendingin Tempat penyimpanan sampel
Lemari asam Membantu pergantian larutan
Alat pemanas air Eyela Water Bath SB-650 Alat bantu sectioning
Embedding Console Tissue-Tek TEC Alat blocking
Inkubator Memmert Menyimpan hasil sectioning
EyelaSoft Inkubator SLI-450 Menyimpan parafin cair
Mikrometer objektif dan okuler Alat ukur
Mikroskop cahaya dan Stereo Olympus CH20 Mengamati jaringan
pensil dan spidol permanen Alat tulis
Optilab viewer Mikrofotografi
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Pengambilan sampel di alam
Spons Petrosia (petrosia) nigricans diperoleh dari alam yaitu di bagian barat daya Pulau Pramuka, Gugusan Kepulauan Seribu DKI Jakarta. Spons di masukkan ke dalam cool box berukuran besar yang telah diisi air laut untuk dipotong menjadi ukuran ± 5 cm x 5cm. Sampel yang telah dipotong kemudian
ditusuk dengan jarum yang telah diikatkan benang kenur, setiap potongan diberi jarak ± 2 cm.
Gambar 3 menunjukkan rangkaian spons yang disusun pada benang lalu letakan kembali ke habitat awalnya dengan posisi tergantung pada karang mati atau artificial reef yang ada disekitarnya. Hal tersebut dilakukan dengan tujuan untuk membantu proses aklimatisasi spons sehingga dapat mengurangi tingkat stress pada spons. Proses aklimatisasi dilakukan selama satu bulan sebelum dibawa ke habitat buatan (kolam pemeliharaan).
Setelah aklimatisasi selama satu bulan spons dipindahkan ke kolam pemeliharaan. Pengemasan sampel spons menggunakan plastik transparan berukuran sedang, kemudian diberi oksigen dan dimasukkan ke dalam cool box yang berisi batu es.
Gambar 3. Aklimatisasi spons Petrosia (petrosia) nigricans di alam
3.3.2. Pemeliharaan spons Petrosia (petrosia) nigricans
Spons Petrosia (petrosia) nigricans ditransplantasi di habitat buatan berupa kolam dengan ukuran 5 m x 1,5 m x 1,5 m, ketinggian air dari dasar kolam 1 meter, dan diberi substrat rubble (Gambar 4).
Gambar 4. Kolam pemeliharaan spons Petrosia (petrosia) nigricans
Kondisi perairan kolam dengan kualitas air yang mendukung sangat penting bagi kehidupan spons. Kolam pemeliharaan merupakan habitat baru bagi spons sehingga sedemikian rupa diatur agar sama dengan habitat alaminya dan spons dapat bertahan hidup dengan jangka waktu yang lama. Kolam
pemeliharaan ini dilengkapi dengan aerator yang berguna untuk memberi sirkulasi udara di kolam, dan protein skimmer yang berguna sebagai perangkap amonia serta racun yang terkandung dalam air kolam. Kolam dilengkapi dengan dua pompa air yang diletakkan dibagian protein skimmer dan bak penyaringan. Air mengalir dan bersirkulasi selama 24 jam (Gambar 5).
Keramik
Spons diletakan di atas keramik yang terdapat di dasar kolam. Air kolam berasal dari filter Seaworld yang dialirkan dengan pompa berkapasitas besar ke Pusat Studi Ilmu Kelautan Ancol, Jakarta. Spons diaklimatisasi selama satu bulan untuk beradaptasi dengan lingkungan yang baru (kolam pemeliharaan) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6, sehingga dapat mengurangi stres akibat perubahan kondisi dari lingkungan sebelumnya. Spons yang telah diaklimatisasi kemudian dipotong menjadi bagian yang lebih kecil sehingga berjumlah 12 fragmen.
(a) (b)
Gambar 6. (a) Aklimatisasi awal pemindahan spons Petrosia (petrosia) nigricans di kolam pemeliharaan, (b) Spons Petrosia (petrosia) nigricans di atas keramik di dasar kolam pemeliharaan
3.3.3. Pengukuran parameter lingkungan
Pengukuran parameter lingkungan dilakukan untuk mengetahui kondisi perairan pada lokasi penelitian berdasarkan standar baku mutu kualitas perairan (Lampiran 1). Parameter lingkungan yang diukur adalah parameter fisik dan kimia yang dilakukan secara in situ dan pengamatan melalui analisis laboratorium. Parameter fisik yang di ukur yaitu suhu dan salinitas, pengukuran dilakukan setiap minggu selama 5 minggu masa pemeliharaan spons di kolam. Pengukuran suhu
dilakukan dengan menggunakan termometer yang terpasang pada kolam pemeliharaan, sedangkan pengukuran salinitas menggunakan refraktometer dengan cara meneteskan contoh air kolam pada refraktometer kemudian bisa dilihat langsung besarnya nilai salinitas air kolam pemeliharaan. Parameter kimia yang di ukur yaitu nitrat, nitrit dan amonia. Pengukuran dilakukan sebanyak dua kali selama 5 minggu masa pemeliharaan spons di kolam, yakni pada awal
minggu pertama dan akhir minggu kelima. Contoh air untuk dianalisis kandungan kimia perairannya diambil dengan botol sampel kemudian disimpan ke dalam coolbox. Analisa kandungan nitrat, nitrit, dan amonia dilakukan di Laboratorium Produksi Lingkungan, MSP-IPB. Pengukuran parameter laut dilakukan juga sebagai kontrol pada setiap pengambilan sampel laut. Tabel 3 menunjukkan satuan, cara pengukuran, dan alat pengukuran parameter fisik dan kimia perairan yang di ukur.
Tabel 3. Parameter fisik dan kimia perairan yang di ukur
No Parameter Satuan Pengukuran Alat/Metode
Parameter Fisik
1 Suhu oC
in situ Termometer Hg
2 Salinitas PSU (Practical Salinity Unit) in situ Refraktometer
Parameter Kimia
1 Nitrat mg/l laboratorium Spektrofotometer
2 Nitrit mg/l laboratorium Spektrofotometer
3 Amonia mg/l laboratorium Spektrofotometer
3.3.4. Pengambilan sampel di kolam
Pengambilan sampel spons yang dipelihara di kolam dilakukan pada setiap fase bulan secara beraturan, yaitu fase bulan baru/mati, fase bulan ¼ , fase bulan ¾, dan fase bulan purnama. Sedangkan pengambilan sampel spons alam
pengambilan spons di kolam pada fase yang sama. Spons yang diambil harus dalam kondisi yang baik sebanyak tiga buah sampel dari fragmen yang berbeda pada setiap fase. Spons dipotong dengan ukuran 0,5 x 0,5 cm2. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam plastik sampel dan diawetkan dengan formalin 10% dan air laut dengan perbandingan 1:9 sebagai pengawet.
3.3.5. Pembuatan preparat awetan
Pembuatan preparat awetan dengan menggunakan metode histologis standar yaitu metode parafin dengan pewarnaan HE (Haematoxylin Eosin)
(Gunarso, 1989) (Lampiran 2). Berikut ini prosedur dalam histologis (Gambar 7),
Sampel spons Petrosia (petrosia) nigricans Difiksasi dalam larutan formalin 10%
Desilifikasi Dehidrasi
Gambar 7. Diagram alir proses standar histologis spons
3.3.6. Pengamatan laboratorium
Pengamatan preparat histologis dilakukan di Laboratorium Histologis Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor untuk mendapatkan beberapa data, antara lain:
1). Pengukuran diameter terpanjang dan diameter terpendek oosit Embedding dan Blocking Clearing Staining (pewarnaan) Sectioning (± 5µm) Mounting Mikrofotografi
Oosit yang diukur adalah oosit yang memiliki inti. Diameter terpanjang oosit diukur pada bagian yang paling panjang, sedangkan diameter terpendek oosit diukur pada bagian yang paling panjang (Gambar 8).
Gambar 8. Pengukuran diameter terpanjang dan diameter terpendek oosit
2). Pengukuran jumlah oosit
Pengukuran jumlah oosit yang ditemukan pada setiap lapang pandang.
3.4. Analisis Data
Jumlah dan ukuran oosit spons Petrosia (petrosia) nigricans dianalisis dengan melakukan pengamatan preparat histologis secara visual dengan mikroskop (perbesaran lensa 100x dan 400x) dan gambar hasil mikrofotografi berdasarkan fase bulan pada kolam pemeliharaan dan habitat aslinya (laut), kemudian membandingkannya dengan pustaka terbaru atau jurnal. Jumlah oosit diukur dengan menghitung rata-rata jumlah oosit terbanyak yang ditemukan pada lima lapang pandang di tiga sayatan berseri koloni sampel. Pengukuran diameter terpanjang serta diameter terpendek dilakukan dengan menggunakan alat
mikrometer. Rata-rata geometrik diameter di dapat dari akar perkalian antara diameter terpanjang dan diameter terpendek. Rumus yang digunakan yaitu (Permata et al., 2000):
... (1) diameter terpanjang diameter terpendek
Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan menggunakan uji-t untuk dua sampel dengan nilai α = 0,05 menggunakan Software Minitab 14. Analisis ini dilakukan untuk melihat pengaruh penggunaan metode transplantasi di lokasi transplantasi dengan habitat buatan (kolam) terhadap fungsi reproduksi spons Petrosia (petrosia) nigricans. Apabila nilai P < 0,05 maka terima Ho yang
berarti ada perbedaan nyata pada reproduksi seksual spons dalam hal ini terhadap pengaruh lokasi hidupnya (kolam dan laut), dan sebaliknya. Prosedur penelitian ditampilkan dengan diagram alir pada Gambar 9.
Analisis deskriptif
Analisis data Pengolahan data
Jumlah dan ukuran gamet spons alami Pengamatan preparat
jumlah dan ukuran gamet spons hasil transplantasi di
habitat buatan (kolam)
Pengambilan sampel spons
Petrosia (petrosia) nigricans
dari alam
Pembuatan preparat Transplantasi spons di
habitat buatan (kolam)
Pengambilan sampel spons
Petrosia (petrosia) nigricans dari
transplantasi di habitat buatan (kolam)
Sampel Petrosia (petrosia) nigricans dari alam
jumlah dan ukuran gamet spons alami jumlah dan ukuran gamet spons hasil transplantasi di habitat buatan (kolam)
Uji-t untuk dua sampel (Minitab 14) (Jumlah dan ukuran oosit)
Pvalue > 0,05 tidak ada perbedaan nyata pada fungsi reproduksi spons terhadap lokasi hidupnya Tolak H0 Pvalue < 0,05 Terima H0 ada perbedaan nyata pada fungsi
reproduksi spons terhadap lokasi
hidupnya
