1 1.1 Latar Belakang
Kanker merupakan penyakit yang belum dapat dikendalikan dengan sempurna sehingga masih banyak menimbulkan kesengsaraan, kecacatan, biaya pengobatan tinggi, serta kematian pada manusia. World Health Organization (WHO) memperkirakan terdapat kurang lebih dua juta kasus baru kanker kulit non-melanoma di seluruh dunia dan sekitar 132.000 kasus baru melanoma setiap tahunnya (Raflizer, 2010). Jumlah penderita kanker kulit lebih banyak dari penderita kanker lainnya, di Amerika Serikat, satu dari lima penduduk mengalami kanker kulit dalam perjalanan hidupnya dalam tiga dekade terakhir. Pada orang Asia diperkirakan insiden kanker kulit mencapai 2-4% dari jumlah penderita kanker (Gloster, 2006). Data resmi mengenai prevalensi tumor kulit belum ada di Indonesia. Pada tahun 2004 dijumpai sekitar 5,9-7% kanker kulit dari keseluruhan jenis penyakit kanker. Pada tahun 2007, di Indonesia kanker kulit menduduki peringkat ketiga setelah kanker payudara dan kanker serviks (Raflizer, 2010).
Tingginya insiden kanker kulit dimungkinkan karena kulit merupakan organ terbesar dan terluar dari tubuh, sehingga disamping paparan sinar ultraviolet, kulit sangat mudah terpapar bahan kimiawi yang bersifat karsinogenik yang ada di lingkungan kita. Kasus kanker kulit yang berhubungan dengan pekerjaan sangat meningkat akibat paparan dengan bahan polisiclic aromatic
hydrocarbon (PAH) dan arsenic bagi pekerja industri, petani dan supir dalam beberapa tahun terakhir. Berbagai sumber senyawa kimiawi tersebut didapatkan pada ter, aspal, hasil pembakaran mesin diesel, parafin cair, industri besi dan baja, serta paparan pestisida pada petani (Singh, 2014). Salah satu senyawa kimiawi
yang diketahui dapat menimbulkan kanker kulit adalah
7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA). Secara alami DMBA banyak ditemukan di tengah masyarakat sebagai hasil dari proses pembakaran yang tidak sempurna, seperti dalam asap tembakau, asap pembakaran kayu, asap pembakaran gas, bensin, minyak, batubara atau daging (Arora, 2004). Berdasarkan kenyataan, faktor resiko tersebut selalu ada di tengah masyarakat dalam kehidupan sehari-hari dan sangat sulit dihindari sehingga sangat mungkin terjadi kanker kulit akibat paparan agen tersebut. Insiden terjadinya kanker kulit akibat paparan bahan tersebut tidak diketahui.
Terjadinya kanker, termasuk kanker kulit, merupakan proses yang berlangsung dalam beberapa tahap. Penelitian in-vitro dan epidemiologi menunjukkan proses karsinogenesis terjadi melalui tahapan: inisiasi, promosi dan progresi. Selama proses inisiasi dan promosi, apoptosis dan proliferasi sel terjadi dengan tingkat kecepatan yang berbeda dan tetap dalam keseimbangan, sedang dalam tahap progresi keseimbangan ini berubah yang memungkinkan terjadinya kanker. Tahapan inisiasi ditandai dengan terjadinya perubahan genetik permanen, yakni sel normal menjadi lebih peka, berubah menjadi sel maligna. Pembelahan sel tetap simetris menghasilkan dua sel inisiasi baru. Sel inisiasi mirip dengan sel normal tetapi telah mengalami mutasi yang menginduksi proliferasi tetapi tidak
terjadi diferensiasi sel. Pada tahapan ini sel inisiasi tetap dalam tahap laten selama beberapa minggu, bulan, atau tahun. Proliferasi sel sangat penting pada tahapan ini, yakni perkembangan menjadi neoplastik tergantung pada dosis karsinogenik. Peningkatan dosis meningkatkan insiden dan multiplikasi neoplasia dan mengurangi manifestasi periode laten. Perubahan genetik diawali dari akumulasi mutasi pada satu sel somatik yang menghasilkan perubahan fenotipik dari sel normal menjadi hiperplasia, displasia dan akhirnya menjadi sel maligna (Teich, 1997).
Tahap promosi diawali bila terdapat substansi kimiawi yang memiliki aktivitas karsinogenik rendah. Senyawa kimia yang bersifat promotor tidak berinteraksi langsung dengan DNA, meningkatkan proliferasi, berkontribusi agar mutasi yang telah terjadi tidak diperbaiki, meningkatkan perubahan ekspresi gen dan menyebabkan perubahan pada kontrol pertumbuhan sel, sehingga dibutuhkan aplikasi promotor selama beberapa minggu, bulan, atau tahun agar dapat efektif memicu perkembangan menjadi kanker. Penghentian aplikasi promotor dapat menimbulkan regresi proliferasi sel dengan cara apoptosis (Frenkel, 2010).
Penelitian eksperimental menunjukkan bahwa senyawa kimia DMBA sebagai inisiator dan 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) sebagai promotor. Agen inisiator tersebut bersifat genotoksik yang berkontribusi terhadap peningkatan risiko kanker kulit pada manusia dan binatang coba (Nigam dan Shukla, 2007; Meeran, 2009), sehingga sering digunakan untuk mengamati proses karsinogenesis (Yusuf, 2009).
Aplikasi DMBA di kulit sebagai inisiator ditunjukkan oleh adanya mutasi spesifik pada onkogen (Mackie dan Quinn, 2004). Selanjutnya periode laten formasi tumor setelah aplikasi inisiator berkurang secara signifikan dengan adanya aplikasi promotor TPA, sehingga kedua agen tersebut akan membentuk suatu tumor jinak (papiloma). Namun, kemungkinan formasi papiloma pada strain tikus tergantung jenis karsinogen, dosis aplikasi dan jangka waktu pengamatan (Mackie dan Quinn, 2004). Martha, (2013) dan Wahab, (2014), melakukan penelitian karsinogenesis yang menunjukkan aplikasi DMBA 50µg 3 kali pada minggu pertama, dilanjutkan aplikasi TPA 4 µg 3 kali seminggu pada minggu kedua sampai minggu keduabelas pada mencit menginduksi terjadinya papilloma dan karsinoma sel basal. Penelitian sebelumnya menunjukkan aplikasi DMBA 100µg 3 kali seminggu selama 12 minggu sudah mulai timbul kanker kulit pada minggu ke enam, sehingga dosis tersebut dapat menjadi dasar penelitian selanjutnya untuk menilai efek protektif berbagai bahan alami terhadap terbentuknya kanker kulit (Diana, 2016).
Aplikasi karsinogenik kimiawi tersebut menginduksi pembentukan reactive oxygen species (ROS) yang akan merusak DNA, RNA dan protein melalui reaksi kimiawi seperti oksidasi, nitrasi dan halogenasi yang menyebabkan peningkatan mutasi, perubahan fungsi protein dan enzim penting. Beberapa penelitian membuktikan bahwa pembentukan ROS tersebut terjadi pada tahap inisiasi, promosi dan progresi melalui genotoksisitas (Oliveira, 2007). Membran sel sensitif terhadap ROS dan sering menjadi target kerusakan sel akibat induksi oleh ROS. Asam lemak tidak jenuh pada membran sel umumnya terdiri dari
kelompok methylene antara dua double bonds sehingga struktur tersebut membuat asam lemak lebih sensitif terhadap oksidasi. ROS bereaksi dengan asam lemak pada membran sel membentuk peroksidase lipid dan selanjutnya terbentuk malondialdehyde (MDA) yang spesifik dan bersifat karsinogenik (Grigorov, 2012). Produk ini merupakan genotoksik endogen melalui proses enzimatik dan radikal oksigen yang diinduksi oleh peroksidase lipid sehingga kerusakan oksidatif DNA setelah aplikasi DMBA kekulit dapat dinilai dengan melihat MDA. Aplikasi double-stranded DNA dengan MDA menimbulkan modifikasi dan peningkatan tingkat mutasi bila terjadi replikasi pada sel mamalia. Kerusakan DNA akibat aplikasi tersebut menunjukkan sifat mutagenik MDA dan berkaitan dengan stres oksidatif dan peroksidase lipid (Niedernhofer, 2003). Hasil penelitian menunjukkan bahwa kerusakan DNA yang spesifik akibat pembentukan stres oksidatif adalah terbentuknya 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OhdG). Aplikasi DMBA pada sistem sel epitel mammae manusia terbukti meningkatkan kerusakan oksidatif nuklear DNA (8-OHdG) (Cookel, 2003).
Terbentuknya kanker kulit akibat aplikasi DMBA disebabkan oleh paparan MDA yang bersifat genotoksik pada DNA dan gen yang mengatur apoptosis, yaitu gen yang berperan pada kematian sel bila kerusakan DNA tidak dapat diperbaiki. Apoptosis terjadi melalui dua jalur utama yaitu jalur ekstrinsik atau sitoplasmik dan jalur intrinsik atau mitokondrial yang menyebabkan terjadinya pelepasan sitokrom C dari mitokondria dan aktivasi signal apoptosis bila jalur ini terstimulasi. Kedua jalur tersebut akan menginduksi kaspase yang akhirnya menginduksi apoptosis. Salah satu gen regulator yang paling penting pada jalur
intrinsik adalah Bcl-2. Gen ini pertama kali diidentifikasi pada translokasi kromosom 18 ke 14 pada limfoma non-hodgkin folikular dan merupakan kunci regulator apoptosis. Ekspresi berlebihan Bcl-2 banyak ditemukan pada berbagai kasus keganasan meskipun tanpa translokasi kromosom (Kr18, 14). Peningkatan ekspresi Bcl-2 menyebabkan resistensi obat kemoterapi dan radioterapi, sedangkan penurunan ekspresi menginduksi apoptosis dan berespon terhadap obat anti kanker. Terjadinya apoptosis dikendalikan oleh gen yang menginduksi apoptosis (seperti; Bax) dan gen anti apoptosis (Bcl-2). Ekspresi berlebihan Bcl-2 pada jalur intrinsik menyebabkan hambatan jalur ekstrinsik. Berbagai penelitian membuktikan peningkatan ekspresi Bcl-2 yang menghambat apoptosis berperan terhadap terjadinya tumor yang diinduksi dengan DMBA/TPA (Gloster, 2006).
Terjadinya kanker kulit akibat paparan DMBA sangat pontensial terjadi di tengah masyarakat. Hal tersebut dapat dicegah dengan menggunakan berbagai bahan alamiah yang tidak toksik. Berbagai penelitian menunjukkan penggunaan bahan alamiah dapat mencegah terjadinya kanker. Pemberian phenolic ekstrak garlic menunjukkan efek protektif terhadap tumor melalui induksi gen proapoptotik p53 dan Bax dan menghambat ekspresi gen antiapoptotik Bcl-2 (Arora, 2012). Ekstrak rosmarinic acid, green tea dan geraniol masing-masing dapat menghambat kanker kulit yang diberikan secara oral pada mencit albino yang diinduksi dengan DMBA. Sedang pemberian ekstrak kakao topikal 800 ppm dan 1600 ppm menghambat kanker kulit pada mencit yang dinduksi DMBA/ TPA (Wahab, 2012).
Bahan alamiah lain yang terbukti sebagai antikanker pada berbagai penelitian in-vitro dan in-vivo adalah ekstrak kulit Garcinia mangostana. Bahan alamiah ini ditemukan di daerah tropis di Asia Tenggara terutama di Indonesia. Dua senyawa kimia utama pada kulit Garcinia mangostana adalah xanthone dan phenolic. Efek anti oksidan berhubungan dengan kadar senyawa phenolic yang tinggi pada ekstrak methanol dan ekstrak ethanol. Senyawa phenolic dalam mangosteen; afzelechin, epiafzelechin, catechin, epicatechin, gallocatechin dan epigallocatechin yang memiliki kemampuan scavenger terhadap radikal oksigen lebih tinggi daripada anggur dan pine bark. Kuantitas senyawa phenolic dan aktifitas anti oksidan masing-masing 10 dan 20 kali lebih tinggi (Karim, 2012). Dari senyawa xanthone, terdapat empat prenyl xanthone utama yang secara struktur memiliki kemiripan α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin dan methoxy-β-mangostin. Dari keempat prenyl tersebut, ketiga prenyl xanthone yang pertama diketahui memiliki efek menghambat pertumbuhan pada sel karsinoma kolon manusia dimana α- dan γ-mangostin memiliki efek yang lebih besar. Staining dan analisa electrophoresis DNA menunjukkan bahwa efek antiproliferatif α-mangostin, merupakan kandungan utama ekstrak disebabkan oleh proses anti apoptosis (Akao, 2008).
Ekstrak mangostin (10µg/ml) yang mengandung senyawa α-mangostin memiliki efek paling efektif menghambat terjadinya lesi preneoplastik (yang akan menjadi breast cancer) pada tikus percobaan (Karim, 2012). Penelitian menggunakan isolat panaxanthone yang diekstrak dari kulit Garcinia mangostana mengandung α-mangostin 75-85% dan γ-mangostin 5-15% pada mouse model
karsinoma mamma. Pemberian secara oral Isolat panaxanthone 2500 ppm dan 5000 ppm/hari menunjukkan efek supresi pertumbuhan tumor dan metastasis. Penelitian efek ekstrak kering kulit Garcinia mangostana terhadap MCF-7breast cancer cell line menunjukkan ekstrak yang mengandung α-mangostin 28,1% memiliki efek sitotoksik dan induksi apoptosis (Setiawati, 2014). α-mangostin (100mg/kg/oral) menginduksi penghentian siklus sel dan menekan pertumbuhan tumor pada penelitian pada mencit yang diinduksi sel 22Rv1 (sel kanker prostat) (Jonson, 2011). Senyawa tersebut juga menghambat metastase ke limfonodus pada model xenograft mencit BALB/c. Meskipun manfaat ekstrak kulit Garcinia mangostana sebagai anti oksidan dan anti kanker telah diketahui pada berbagai penyakit akibat kandungan xanthone yang cukup tinggi, namun pengaruh aplikasi topikal berbagai konsentrasi pada proses karsinogenesis dalam menghambat terjadinya kanker kulit melalui penghambatan ekspresi MDA dan Bcl-2 serta induksi Bax sejauh ini belum dibuktikan.
Sampai saat ini belum dijumpai penelitian yang menggunakan aplikasi topikal ekstrak kulit Garcinia mangostana untuk mencegah kanker kulit dalam penelusuran jurnal baik secara online maupun manual. Penelitian Preliminary study kami menggunakan ekstrak kulit Garcinia mangostana 800 ppm terbukti menghambat tumor kulit pada mencit yang diinduksi DMBA. Berdasarkan hal tersebut di atas maka perlu dilakukan penelitian ekstrak kulit Garcinia mangostana sebagai kemoprevensi alamiah terhadap terjadinya kanker kulit.
1.2 Rumusan Masalah
1. Apakah aplikasi topikal konsentrasi 400 ppm, 800 ppm dan 1600 ppm ekstrak kulit Garcinia mangostana pada mencit mengakibatkan ekspresi MDA lebih rendah dari pada kontrol?
2. Apakah aplikasi topikal konsentrasi 400 ppm, 800 ppm dan 1600 ppm ekstrak kulit Garcinia mangostana pada mencit mengakibatkan ekspresi Bcl-2 lebih rendah dari pada kontrol?
3. Apakah aplikasi topikal konsentrasi 400 ppm, 800 ppm dan 1600 ppm ekstrak kulit Garcinia mangostana pada mencit mengakibatkan ekspresi Bax lebih tinggi dari pada kontrol?
4. Apakah aplikasi topikal konsentrasi 400 ppm, 800 ppm dan 1600 ppm ekstrak kulit Garcinia mangostana pada mencit dapat membuat derajat histopatologis tumor kulit lebih ringan daripada kontrol?
1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum
Untuk membuktikan pemberian ekstrak kulit Garcinia mangostana topikal dapat mencegah terjadinya tumor kulit pada mencit yang mendapat paparan DMBA melalui stres oksidatif, Bax, Bcl-2 dan, histopatologi.
1.3.2 Tujuan Khusus
1. Untuk membuktikan aplikasi topikal konsentrasi 400 ppm, 800 ppm dan 1600 ppm ekstrak kulit Garcinia mangostana pada mencit mengakibatkan ekspresi MDA lebih rendah dari pada kontrol.
2. Untuk membuktikan aplikasi topikal konsentrasi 400 ppm, 800 ppm dan 1600 ppm ekstrak kulit Garcinia mangostana pada mencit mengakibatkan Bcl-2 lebih rendah dari pada kontrol.
3. Untuk membuktikan aplikasi topikal konsentrasi 400 ppm, 800 ppm dan 1600 ppm ekstrak kulit Garcinia mangostana pada mencit mengakibatkan ekspresi Bax lebih tinggi dari pada kontrol.
4. Untuk membuktikan aplikasi topikal konsentrasi 400 ppm, 800 ppm dan 1600 ppm ekstrak kulit Garcinia mangostana pada mencit dapat menghambat terjadinya tumor kulit dengan derajat histopatologis yang lebih ringan daripada kontrol.
1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Manfaat Akademik
Apabila hipotesis penelitian ini terbukti akan menjadi sumbangan teoritis pada keilmuan yaitu ekstrak kulit Garcinia mangostana dapat menghambat tumor kulit melalui ekspresi MDA, Bcl-2 yang lebih rendah, ekspresi Bax yang lebih tinggi, serta derajat histopatologi yang lebih ringan.
1.4.2 Manfaat praktis
Terbuktinya ekstrak kulit Garcinia mangostana mempunyai efek protektif terhadap DMBA, sehingga ekstrak kulit Garcinia mangostana dapat dipakai sebagai kemopreventif alamiah tumor kulit.
