ABSTRAK
Keberhasilan analisis RAPD-PCR sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor, di antaranya karakteristik templat DNA genom yang meliputi kemurnian, konsentrasi, dan ukuran templat. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi dan ukuran templat DNA genom udang galah yang optimal untuk analisis RAPD. Optimalisasi konsentrasi dilakukan dengan menguji sampel-sampel dengan konsentrasi tamplat yang berbeda yaitu 5 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng, 1.000 ng, dan 2.000 ng per reaksi PCR. Optimalisasi ukuran templat DNA dilakukan dengan menguji sampel-sampel DNA genom yang komposisi ukurannya bervariasi, yaitu templat dengan berat molekul tinggi (1), templat dengan berat molekul rendah (2) dan templat yang memiliki kombinasi berat molekul tinggi dan rendah (3). Hasil analisis menunjukkan adanya tingkat konsentrasi dan komposisi templat DNA genom yang optimal untuk menghasilkan profil RAPD udang galah yang konsisten. Konsentrasi DNA 500 ng/reaksi mampu menghasilkan amplifikasi DNA yang optimal, sedangkan pada konsentrasi rendah (5 ng) dan tinggi (2.000 ng) tidak menghasilkan band DNA. Selain itu, pita-pita RAPD yang konsisten diperoleh apabila templat yang digunakan merupakan templat yang memiliki berat molekul tinggi. Templat dengan berat molekul rendah tidak dapat diamplifikasi sedangkan templat DNA dengan komposisi campuran dapat diamplifikasi tetapi tidak konsisten.
KATA KUNCI: Macrobrachium rosenbergii, PCR, RAPD PENDAHULUAN
Reaksi PCR merupakan salah satu bagian dari kegiatan dalam analisis molekuler DNA. Random Amplified Polymorhpic DNA (RAPD) merupakan salah satu metode analisis DNA molekuler. Metode ini banyak dilakukan karena relatif lebih sederhana, mudah, cepat, serta biaya yang murah jika dibandingkan dengan metode yang lain. Hal ini dikarenakan teknik RAPD tidak memerlukan informasi awal mengenai urutan DNA genom organisme yang diuji (Williams et al., 1990). Selain itu juga, primer yang digunakan pada analisis dengan metode RAPD adalah primer universal sehingga lebih mudah untuk menempel pada genom DNA templat. Di samping keunggulan tersebut dalam metode RAPD memiliki kelemahan yang selama ini menjadi masalah yaitu konsistensi atau reproducibilty lebih rendah dibandingkan dengan metode yang lain. Devos & Gale, 1992 menyatakan masalah dalam analisis RAPD adalah rendahnya konsistensi hasil analisis (reproducibility). Rendahnya konsistensi hasil PCR-RAPD ini disebabkan oleh beberapa faktor di antaranya penempelan primer pada cetakan genom DNA tidak sempurna yang diakibatkan karena tidak tepatnya konsentrasi komponen-komponen PCR-RAPD dan pengaruh dari kualitas DNA templat (Pharmawati, 2009).
Keberhasilan amplifikasi dalam reaksi PCR-RAPD ditentukan ada tidaknya site DNA atau situs penempelan DNA. Primer akan menempel pada genom DNA yang memiliki susunan basa nukleotida yang komplemen dengan susunan basa pada primer. Di samping ditentukan ada tidaknya situs penempelan primer, keberhasilan teknik PCR RAPD ditentukan pula oleh kemurnian dan keutuhan DNA templat. Kualitas dan kuantitas DNA sangat berpengaruh terhadap keberhasilan dari proses PCR. Salah satu parameter kulitas DNA dapat dilihat dari kemurnian dan ukuran genom DNA. Kemurnian yang rendah, misalnya karena adanya metabolit sekunder, akan menghambat penempelan primer pada susunan basa pada rantai DNA (Padmalatha & Prasad, 2006). Ukuran DNA templat yang kecil dapat mengurangi peluang penempelan primer kepada templat. Demikian pula, jumlah DNA dalam komponen reaksi PCR perlu dioptimalkan untuk mendapatkan hasil amplifikasi yang konsisten. Jumlah DNA templat yang terlalu sedikit atau terlalu tinggi akan mempengaruhi hasil amplifikasi.
OPTIMALISASI TEMPLAT DNA GENOM UDANG GALAH,
Macrobrachium rosenbergii
DALAM PROSES PCR-RAPD
Dadan Sunandar dan ImronLoka Riset Pemuliaan dan Teknologi Budidaya Perikanan Air Tawar Jl. Raya Sukamandi No. 2, Subang 41256
Penelitian ini bertujuan mendapatkan jumlah (konsentrasi) dan ukuran templat DNA yang opti-mal untuk analisis PCR-RAPD udang galah (Macrobrachium rosenbergii).
BAHAN DAN METODE Preparasi DNA Templat
Sesuai dengan tujuan percobaan, yaitu untuk mendapatkan konsentrasi dan ukuran DNA templat yang optimal untuk PCR-RAPD, maka preparasi templat dilakukan dengan dua cara, yaitu ekstraksi langsung dari sampel dan ekstraksi dari hasil running gel agarose. Ekstraksi langsung dari sampel digunakan untuk mendapatkan templat dengan konsentrasi berbeda-beda. Ekstraksi dari gel agar-ose dilakukan untuk mendapatkan templat dengan ukuran tertentu yang dikehendaki. Hasil ekstraksi langsung dari sampel yang di-running dalam agarose akan memberikan gambaran tentang komposisi ukuran; apakah terdiri atas bobot molekul tinggi, bobot molekul rendah atau kombinasi dari keduanya. Penyediaan tempat dengan ukuran bobot molekul tertentu dilakukan dengan mengekstrak dari gel.
Preparasi DNA Templat dengan Konsentrasi Berbeda
Spesimen yang digunakan adalah daging udang galah koleksi yang ada di Loka Riset Pemuliaan dan Teknologi Budidaya Perikanan Air Tawar Sukamandi Subang. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode protokol promega Wizard® Genomic DNA Purification. Sebanyak 10 mg sampel dihancurkan terlebih dahulu lalu dimasukan ke dalam tabung eppendorf yang telah diisi Nuclei Lysis Solution 600 μL kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 15-30 menit. Kemudian ditambahkan 3 μL Rnase Solution dan diinkubasi pada suhu 37°C dalam water bath selama 15-30 menit. Setelah 30 menit, larutan tadi didinginkan pada suhu ruang lalu ditambahkan 200 μL Protein Precipitation Solu-tion. Kemudian larutan disentrifuse dengan kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit, supernatan dipindahkan pada tabung eppendorf baru lalu ditambahkan isopropanol aduk pada suhu ruang, kemudian disentrifuse selama 1 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan ethanol 70% aduk pada suhu ruang dan sentrifuse dengan kecepatan 13.000 rpm. Supernatan dibuang dan ditambahkan pada tabung yang berisi pelet dengan larutan Rehydration Solution sebanyak 100 μL. Eppendorf disimpan pada suhu -20°C untuk analisis lebih lanjut.
Penentuan konsentrasi hasil ekstraksi dilakukan menggunakan prosedur spektrofotometri (Genequant). Tergantung kepada konsentrasi awal hasil ekstraksi, penyediaan templat dengan konsentrasi tertentu (5 ng/uL; 10 ng/uL; 50 ng/uL; 100 ng/uL; 500 ng/uL; 1.000 ng/uL; 2.000 ng/uL) dilakukan melalui prosedur pengenceran atau pemekatan.
Preparasi DNA Templat dengan Ukuran Berbeda
Kriteria DNA templat sebagai templat dengan berat molekul tinggi dan rendah dilakukan secara kualitatif. Templat dengan berat molekul tinggi dicirikan dengan posisinya yang dekat dengan sumur pada gel karena migrasinya yang lambat. Sebaliknya, templat dengan berat molekul yang rendah dicirikan dengan posisinya yang jauh dari sumur gel agarose. Hal ini terjadi karena dengan ukuran yang lebih kecil, migrasinya dalam lebih cepat. Berdasarkan hasil running dalam gel, dilakukan pemotongan pada gel yang mengandung DNA sesuai dengan ukuran yang dikehendaki, dan selanjutnya dilakukan purifikasi. Ekstraksi gel dilakukan dengan menggunakan protokol GeneJET™ Gel Exstraction Kit (Fermentas). Sebanyak 15 μL genom hasil ekstraksi dimasukan ke dalam gel agarose kemudian di-running elektroforesis. Kemudian potong gel yang mengandung fragmen genom DNA lalu ditimbang. Masukan gel agarose yang telah dipotong ke dalam tabung eppendorf yang telah diisi Binding Buffer dengan perbandingan (1:1, masukan 100 μL Binding Buffer untuk setiap 100 mg potongan gel). Kemudian tabung eppendorf diinkubasi pada suhu 50°C-60°C selama 10 menit. Pindahkan larutan ke dalam tabung kolom GeneJET™ lalu disentrifuse selama 30-60 detik. Buang cairan yang ada di tabung lalu pindahkan kolom ke tabung eppendorf yang baru. Tambahkan ke dalam kolom 700 μL wash buffer kemudian sentrifuse selama 1 menit lalu buang cairan di dalam tabung eppendorf kemudian sentrifuse kembali selama 1 menit. Pindahkan kolom ke dalam tabung eppendorf baru dan tambahkan 50 μL elution buffer kemudian sentrifuse selama 1 menit. Buang kolom pada tabung eppendorf dan simpan tabung pada suhu -20°C untuk analisis lebih lanjut.
Amplifikasi DNA
Total komponen volume reaksi amplifikasi 25 μL yang terdiri atas 13,75 μL Nuclease free water; 5x Buffer 5 μl; MgCl 2,5 μL; dNTP 0,5 μL; primer OPA 2 1,25 μL; DNA 1 μL (menyesuaikan dengan konsentrasi DNA yang dibutuhkan) dan taq Polymerase (NEB) 0,2 μL. Program PCR dalam proses amplifikasi terdiri atas 1 siklus 3 menit (94°C), kemudian diikuti dengan 35 siklus yang terdiri atas 1 menit (94°C), 1 menit (37°C), 2 menit (72°C), dan diakhiri dengan siklus dengan suhu 72°C selama 10 menit menggunakan alat MyCycler TermalTM BioRad. Untuk mengetahui hasil amplifikasi oleh primer,
maka digunakan 1% agarose dalam 1/2 x TBE (tris Borid Acid EDTA) buffer dengan penambahan ethidium bromide untuk pewarnaan.
HASIL DAN BAHASAN
Keberhasilan reaksi analisis pada teknik RAPD dipengaruhi oleh konsistensi jumlah DNA (Henry, 1997). Dari tujuh ukuran konsentrasi DNA (5 ng; 10 ng; 50 ng; 100 ng; 500 ng; 1.000 ng; 2.000 ng) dalam reaksi PCR, hasil amplifikasi dihasilkan oleh sampel dengan konsentrasi 10 ng, 50 ng, 100 ng, dan 500 ng (Gambar 1) namun menghasilkan kualitas yang berbeda. Menurut Prana & Hartati (2003), menyatakan perbedaan kualitas hasil amplifikasi dapat dilihat dari jumlah pita (band) DNA yang dapat diidentifikasi dan tingkat resolusi pita fragmen DNA yang diamplifikasi. Dari kelima konsentrasi DNA yang dapat diamplifikasi amplifikasi optimum terdapat pada reaaksi PCR dengan konsentrasi DNA 500 ng menghasilkan 7 pita fragmen DNA. Sedangkan untuk konsentrasi 10 ng, 50 ng, dan 100 ng menghasilkan jumlah 4 pita fragmen DNA namun intensitas resolusinya rendah karena jumlah templat yang tidak mencukupi selama siklus reaksi PCR hal ini disebabkan karena semakin menurunnya jumlah DNA menyebabkan pengaruh terhadap hasil PCR, Weeden et al. (1992) menyatakan konsentrasi DNA cetakan yang terlalu kecil sering menghasilkan pita DNA amplifikasi yang redup atau tidak jelas. Hasil penelitian ini berbeda dengan penelitian RAPD lain, misalkan pada penelitian Crysanthemum konsentrasi templat DNA 1 hingga 500 ng menghasilkan hasil amplifikasi yang relatif konstan (Wolff
Gambar 1. Hasil amplifikasi PCR berbagai konsentrasi templat DNA
et al., 1993), pada penelitian Pinus mariana dan P. rubens konsentrasi DNA yang bervariasi (10 ng sampai 1000 ng) menghasilkan intensitas dan pola DNA yang sama (Nkongolo et al., 1998). Untuk konsentrasi 5 ng tidak menghasilkan amplifikasi pita fragmen DNA hal ini disebabkan konsentrasi yang rendah sehingga amplifikasi tidak terjadi. Konsentrasi DNA cetakan yang terlalu kecil sering menghasilkan pita DNA amplifikasi yang redup atau tidak jelas (Weeden et al., 1992). Konsentrasi templat DNA sangat berkaitan dengan konsentrasi primer sehingga perlu dicari optimalisasi rasio antara konsentrasi templat DNA dengan primer. Rasio yang rendah antara primer dan DNA cetakan dapat menyebabkan produk RAPD yang dihasilkan tidak konsisten (Ali et al., 2006).
Pada konsentrasi DNA tinggi yaitu 1.000 ng dan 2.000 ng tidak terjadi amplifikasi hal ini disebabkan karena tidak menempelnya primer pada situs penempelan primer. Salah satu penyebab tidak
menempelnya primer adalah karena kualitas DNA kurang baik yang mengandung kontaminan dan metabolit lain seperti fenol, protein yang masih ada pada templat DNA sehingga dengan meningkatnya konsentrasi DNA maka kontaminan juga bertambah. Kontaminan dalam jumlah yang signifikan dapat mempengaruhi penempelan primer pada DNA cetakan (Weeden et al., 1992).
Pada kegiatan penelitian yang dilakukan, rasio templat DNA mempengaruhi terhadap hasil PCR RAPD pada udang galah. Tiga jenis ukuran genom DNA memberikan hasil amplifikasi yang berbeda (Gambar 2). Templat DNA yang berat molekul tinggi menghasilkan amplifikasi yang optimal yang terlihat dengan jumlah band DNA lebih banyak dan lebih jelas. Berat molekul DNA yang tinggi mengindikasikan semakin banyak templat DNA yang membawa situs komplemen bagi primer. Semakin banyak situs komplemen menghasilkan band-band amplifikasi pada akhir proses PCR.
Situasi yang sebaliknya terjadi pada dengan genom dengan berat molekul rendah. Genom ini sedikit atau tidak memilki situs penempelan primer sehingga pada akhir proses amplifikasi tidak menghasilkan band DNA. Kernodle et al. (1993) menyatakan kuantitas templat DNA dan rendahnya situs penempelan mempengaruhi terhadap hasil amplifikasi oleh primer pada proses PCR.
Pada templat DNA yang memiliki dua ukuran DNA (berat molekul tinggi dan rendah) mampu menghasilkan band DNA hasil amplifikasi tetapi jika dibandingkan dengan produk hasil amplifikasi pada genom dengan yang hanya memiliki berat molekul tinggi ada band-band DNA yang tidak teramplifikasi pada genom ini. Adanya rasio antara berat molekul tinggi dan rendah ini menyebabkan pengharuh terhadap optimalisasi produk PCR, DNA dengan berat molekul rendah mempengaruhi primer untuk menempel pada situs komplemen yang ada pada genom DNA.
KESIMPULAN
Konsentrasi dan ukuran berat molekul DNA templat udang galah berpengaruh terhadap konsistensi hasil reaksi PCR RAPD. Templat dengan kisaran konsentrasi 200-500 ng dan berat molekul tinggi merupakan templat dengan konsistensi hasil RPAD yang tinggi.
DAFTAR ACUAN
Ali, B.A., Huang, T.H., Salem, H.H., & Xie, Q.D. 2006. Influence of thermal cycler day-to-day reproduc-ibility of random amplified polymorphic DNA fingerprints. Biotechnology, 5: 324-329.
Devos, K.M. & Gale, M.D. 1992. The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheat. Theor. Appl. Genet., 84: 567-572.
Henry, R.J. 1997. Practical and Aplications of Plant Molecular Biology. Chapman and Hall Pub1. Lon-don, 258 pp.
Kernodle, S.P., Cannon, R.E., & Scandalios, J.G. 1993. Concentration of primer and template qualita-tively affects product in RAPD-PCR. Biotechniques, 1: 362-364.
Padmalatha, K. & Prasad, M.N.V. 2006. Optimization of DNA isolation and PCR protocol for RAPD analysis of selected medicinal and aromatic plants of conservation concern from Peninsular India. African J. Biotech., 5: 230-234.
Prana, T.K. & Hartati, S.N. 2003. Identifikasi Sidik Jari DNA Talas (Colocasia esculenta L. Schott) Indone-sia dengan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): skrining Primer dan Optimalisasi Kondisi PCR. J. Natur Indonesia, 5(2): 107-112.
Weeden, N.F., Timmerman, G.M., Hemmat, M., Kneen, B.E., & Lodhi, M.A. 1992. Inheritance and reliability of RAPD markers. In Applications of RAPD technology to plant breeding, Symposium Proceed-ings, Crop Science Society of America, Madison, WI., p. 12-17.
Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A., & Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res., 18: 6531-6535 Wolff, K., Schoen, E.D. & Peters-Van Rijn, J. 1993. Optimizing the generation of random amplified
