Enterobacteriaceae adalah kelompok besar heterogen batang gram negatif yang alami habitatnya Enterobacteriaceae adalah kelompok besar heterogen batang gram negatif yang alami habitatnya adal
adalah saluah saluran uran usus mansus manusia dusia dan hewan hewan. Kean. Keluarluarga menga mencakucakup banyp banyak genak genera (coera (coli,Shili,Shigegelllla, a, SaSalmlmononelellala,, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, dan lain-lain).Beberapa organisme enterik, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, dan lain-lain).Beberapa organisme enterik, misalnya, Escherichia coli, adalah bagian dari flora normal dan menyebabkan penyakit sementara , misalnya, Escherichia coli, adalah bagian dari flora normal dan menyebabkan penyakit sementara , salmonella dan shigellae, secara teratur patogen bagi manusia.
salmonella dan shigellae, secara teratur patogen bagi manusia. E. coli merupakan anggota dari famili E. coli merupakan anggota dari famili bakteri
bakteri Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae , adalah , adalah bakteri bakteri yang paling umum yang paling umum sebagai penghuni traktussebagai penghuni traktus gastrointestinal manusia dan hewan berdarah panas, s
gastrointestinal manusia dan hewan berdarah panas, serta salah satunya patogen paling penting.erta salah satunya patogen paling penting. Sebagai commensal ia hidup dalam
Sebagai commensal ia hidup dalam hubungan yang saling menguntungkan dengan hostnya,hubungan yang saling menguntungkan dengan hostnya, dan jarang menyebabkan penyakit. Namun, ini juga merupakan salah satu patogen manusia dan jarang menyebabkan penyakit. Namun, ini juga merupakan salah satu patogen manusia dan hewan yang paling umum itu bertanggung jawab untuk spektrum penyakit yang dan hewan yang paling umum itu bertanggung jawab untuk spektrum penyakit yang luas. Karakteristik aneh dari
luas. Karakteristik aneh dari E. E. colicoli , s, seperti keeperti kemudahan penanganan, ketemudahan penanganan, ketersediaan urutanrsediaan urutan genom lengkap, dan
genom lengkap, dan kemampuannya untuk kemampuannya untuk tumbuh di bawah tumbuh di bawah kondisi aerobik dan anaerobik,kondisi aerobik dan anaerobik, menjadikannya organisme inang penting dalam bioteknologi.
menjadikannya organisme inang penting dalam bioteknologi. E. E. colicoli digunakan digunakan dalamdalam berbagai
berbagai aplikasi aplikasi baik baik di di bidang bidang industri industri dan dan medis medis dan dan itu itu yang yang paling paling sering sering digunakandigunakan mikroorganisme di bidang teknologi DNA rekombinan (Da Costa, 2013).Uji yang dapat mikroorganisme di bidang teknologi DNA rekombinan (Da Costa, 2013).Uji yang dapat dilakukan untuk meng
dilakukan untuk mengidentifikasi Enterobacteriaceae secara spidentifikasi Enterobacteriaceae secara spesifik adalah uji gulaesifik adalah uji gula – – gula dan gula dan uji biokimia.
uji biokimia. Uji biokimia Uji biokimia
Uji TSIA (
Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar Triple Sugar Iron Agar ) bertujuan untuk membedakan genus yang berbeda-) bertujuan untuk membedakan genus yang berbeda- beda
beda daridari Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae yang semua termasuk bakteri batang gram negatif yang bisa yang semua termasuk bakteri batang gram negatif yang bisa memfermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa dengan memproduksi asam dan membedakan memfermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa dengan memproduksi asam dan membedakan Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae dari bakteri batang gram usus lainnya. Perbedaan terletak pada pola dari bakteri batang gram usus lainnya. Perbedaan terletak pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi hidrogen sulfida. Untuk melihat pola penggunaan fermentasi karbohidrat dan produksi hidrogen sulfida. Untuk melihat pola penggunaan karbohidrat, pada bagian lereng TSIA mengandung sukrosa dan laktosa dengan konsentrasi 1% karbohidrat, pada bagian lereng TSIA mengandung sukrosa dan laktosa dengan konsentrasi 1% dan glukosa dengan konsentrasi 0,1%. Pada media TSIA juga ditambahkan indikator asam basa dan glukosa dengan konsentrasi 0,1%. Pada media TSIA juga ditambahkan indikator asam basa berupa
berupa fenol fenol merah merah yang yang berfungsi berfungsi untuk untuk mengetahui mengetahui fermentasi fermentasi karbohidrat karbohidrat yangyang diindiaksikan dengan perubahan warna media dari merah jingga menjadi warna kuning yang diindiaksikan dengan perubahan warna media dari merah jingga menjadi warna kuning yang menandakan adanya produksi asam. TSIA juga me
menandakan adanya produksi asam. TSIA juga mengandung natrium thiosulfat, substrat untukngandung natrium thiosulfat, substrat untuk pembentukan gas H
pembentukan gas H22S (hidrogen sulfida) dan fero sulfat untuk mendeteksi hasil akhir. HanyaS (hidrogen sulfida) dan fero sulfat untuk mendeteksi hasil akhir. Hanya
bakteri
bakteri yang menghasilkan yang menghasilkan gas gas HH22S yang menunjukkan penghitaman yang pekat pada dasarS yang menunjukkan penghitaman yang pekat pada dasar
edia karena terjadinya pengendapan fero sulfat yang tidak larut. (Nuria, Rosyid, & Sumantri, edia karena terjadinya pengendapan fero sulfat yang tidak larut. (Nuria, Rosyid, & Sumantri, 2014)
Pada inokulasi koloni dari biakan kuman ke media TSIA dilakukan dengan teknik stab and streak yaitu melakukan penusukan dengan ose jarum yang steril secara lurus mulai dari pangkal kemiringan hingga ke dasar media kemudian tarik ose kembali dan pada permukaan
miring media digoreskan. Setelah dilakukan kultur koloni biakan, kultur diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.
Ada beberapa interpretasi hasil pada media TSIA, diantaranya:
1. Lereng alkali (merah) dan dasar asam (kuning) tanpa adanya gas H2S (pecahnya
dasar agar). Hal ini menandakan hanya terjadi fermentasi glukosa dengan pembentukan asam pada lereng yang dioksidasi dengan cepat. Produksi alkali muncul karena penggunaan pepton pada media. Pada dasar media TSIA reaksi asam dipertahankan karena hasil dari penurunan oksigen dan pertumbuhan yang lambat dari bakteri.
2. Lereng asam (kuning) dan dasar asam (kuning) dengan atau tanpa produksi gas H2S.
Hal ini menandakan bahwa telah terjadi fermentasi laktosa dan atau sukrosa. Karena 2 substansi ini ada dengan konsentrasi yang tinggi maka akan digunakan juga sebagai substrat untuk melanjutkan aktivitas fermentasi dengan mempertahankan reaksi asam baik pada lereng maupun dasar media.
3. Lereng alkali (merah) dan dasar alkali (merah-jingga). Hal ini menandakan bahwa tidak terjadinya fermentasi ketiga gula yang terdapat pada media TSIA. Pepton mengalami katabolisme secara aerobik dan atau aerobik yang menyebabkan pH alkali karena hasil dari produksi amonia. Jika hanya terjadi degrasi aerobik pada pepton maka reaksi alkali hanya terjadi pada bagian lereng. Sedangkan jika terjadi penggunaan pepton secara aerobik dan anaerobik maka reaksi alkali ada pada bagian dasar dan lereng media.
Untuk mendapatkan hasil yang akurat apda uji TSIA, perlu dilakukan inkubasi selama 18-24 jam. Media TSIA juga mengandung sodium tiosulfat yang merupakan substrat untuk memproduksi hidrogen sulfida dan ferosulfat untuk mendeteksi hasil akhir tanpa warna. Pada mikroorganisme yang bisa memproduksi gas H2S akan menunjukkan warna hitam pada bagian
dasar karena hasil endapan fero sulfida yang tidak larut. Berikut hasil reaksi TSIA pada beberapa mikroorganisme:
1. Lereng asam (kuning) dasar asam (kuning) tidak menghasilkan gas H2S yaitu
2. Lereng asam (kuning) dasar asam (kuning) menghasilkan gas H2S yaitu bakteri
Citrobacter, Arizona, dan Proteus sp.
3. Lereng alkali (merah) dasar asam (kuning) tidak menghasilkan gas H2S yaitu
bakteri Sigella, Proteus sp.
4. Lereng alkali (merah) dasar asam (kuning) menghasilkan gas H2S yaitu bakteri
Salmonella, Arizona, dan Citrobacter .
5. Lereng alkali (merah) dasar alkali (merah) tidak menghasilkan gas H2S yaitu bakteri
Alcaligenes, Pseudomonas, dan Acitenobacter .
Setelah diinkubasi selama 24 jam, didapatkan hasil bahwa media TSIA mengalami perubahan warna dari warna semula merah jingga menjadi warna kuning tanpa adanya gas pada
media TSIA. Dari hasil yang didapat, dengan interpretasi yang ada kemungkinan bakteri yang diinokulasi adalah Escherichia coli, Klebsiella, dan Enterobacter . Untuk memastikan jenis bakteri yang tumbuh pada media ini, perlu dilakukan uji yang lainnya seperti uji biokomia yang
terdiri dari uji IMViC, uji gula-gula, motilitas, dan urease.
Sulfida indole motility (SIM) adalah media agar semi solid digunakan untuk menentukan hidrogen sulfida (H 2 S) produksi, pembentukan indol, dan motilitas. SIM media
digunakan untuk membedakan anggota keluarga Enterobacteriaceae. Kekaburan yang menyebar dari garis menusuk menunjukkan tes positif untuk motilitas. Tabung harus dibandingkan dengan tabung tanpa inokulasi untuk membedakan antara kekaburan samar dan motilitas. Sebuah pengembangan warna merah setelah penambahan reagen Kovacs menunjukkan produksi indole. Sebuah endapan hitam menunjukkan produksi H 2 S. (Rachel
Watson, 2015)
Media SIM (Sulfide Indole Motility) adalah media differensial. Media ini digunakan untuk tes kemampuan organisme untuk melakukan beberapa hal yaitu mengurangi sulfur, menghasilkan indole dan berjalan melalui agar-agar. SIM umumnya digunakan untuk membedakan anggota Enterobacteriaceae. Sulfur dapat direduksi menjadi H2S (Hidrogen Sulfida) baik oleh
katabolisme asam amino sistem oleh desulfurase sistem enzim atau dengan pengurangan thiosulphate dalam respirasi anaerobik. Jika hidrogen sulfida diproduksi maka warna hitam akan terbentuk dimedia.(Rachel Watson, 2015)
Media SIM (Sulfide Indole Motility) adalah media yang berbentuk semi solid. Media SIM adalah media differensial untuk uji biokimia. Media ini bukan media pertumbuhan melainkkan
media uji biokimia yang merupakan fermentasi yang dilakukan oleh bakteri. Bakteri yang hidup pada media ini akan memfermentasi Indole (semacam senyawa) yang terdapat dalam media. Media SIM hampir sama dengan media TSI yaitu sama-sama merupakan media dalam tabung yang berfungsi untuk pengujian biokimia. Hanya saja media SIM tidak dimiringkan pada penyimpanannya. Hal ini disebabkan agar dapat melihat berapa panjang pergerakkan bakteri dari atas sampai ke bawah. Pergerakan bakteri ke bawah berbentuk seperti pohon
cemara terbalik, dan pergerakkannya ke bawah selalu meruncing.
Komposisi media SIM yaitu Trypton 20 gram, Peptone6,1 gram. Ferrous Ammonium Sulfat 0,2 gram , Sodium thiosulphate 0,2 gram , Agar 3,5 gram, pH dari media ini adalah 7,3 ± 0,2 pada suhu 25o C.
Peptone pada media SIM merupakan sumber energi atau nutrisi begi mikroorganisme berupa protein dan karbohidrat, sodium thiosulphate sebagai sumber mineral dan energi bagi
mikroorganisme , kandungan Agar sebagai bahan pemadat media dan tempat tumbuhnya mikroorganisme. Casein pepton berfungsi untuk menghasilkan tripton yang nantinya akan membentuk indole dan sebagai sumber karbon.
Media SIM ini mengandung natrium thiosulfat, namun media ini boleh dan atau harus diautoclave karena media ini merupakan media diferensial. Kandungan Natrium thiosulphate tidak terlalu berpengaruh pada media ini. Tujuan uji ini untuk melihat pergerakan bakteri. Hasil positif jika ada pertumbuhan bakteri disekitar tusukan dengan ose dan menyebar pada media SIM tersebut. Pada uji ini kami menggunakan media SIM, media yang dipakai adalah media yang bersifat semi solid dengan kandungan agar-agar 0,2-0,4%. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui gerak kuman. Pada media SIM selain untuk melihat motilitas bisa juga untuk test indol dan pembentukan H2S. Interpretasi hasil yang kami dapatkan adalah positif (+) terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar pada bekas tusukan inokulasi dan seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagel (Burrows, 2016). Selanjutnya pada media SIM kami melakukan uji indol digunakan reagen Kovacs . Uji indol digunakan
untuk mengetahui apakah kuman mempunyai enzim triptophanase sehingga kuman tersebut mampu mengoksidasi asam amino triptophan membentuk indol. Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan reagen Ehrlich/Kovac’s yang berisi paradimetil amino bensaldehid. Pada hasil indol yang negatif (-) tidak terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon.
yang kami temukan pada media SIM dengan uji indol adalah positif terbentuk lapisan cincin berwarna merah muda yang artinya bakteri ini membentuk indol dari triptophan sebagai
sumber karbon(Cowan, 2016).
Uji MR VP ini digunakan untuk membedakan beberapa bakteri golongan Enterobacteriaceae, berdasarkan kemampuannya dalam memfermentasi glukosa dan laktosa. Uji MR VP menggunakan media MRVP kegunaan media MR/VP adalah Untuk mengetahui adanya fermentasi asam campuran atau fermentasi butanadiol dan digunakan dalam pemeriksaan laboratorium, khususnya tes biokimia. Komposisi media MR VP adalah Peptone dari alent 7 gr fungsinya sebagai sumber nitrogen, vitamin, dan mineral bagi mikroorganisme, D (+) Glucose 5 gr fungsinya sebagai bahan karbohidrat yang akan digunakan mikroorganisme dalam proses fermentasi, Phosphate buffer 5 gr fungsinya sebagai bahan buffer atau penyangga. Pada proses pembuatan media penimbangan bahan dilakukan sesuai dengan kebutuhan atau volume yang akan dibuat dan berpedoman kepada cara pembuatan yang tertera pada botol media.
Pada Botol media tertera 17 gram dalam 1 liter, sementara yang akan dibuat dalam praktikum ini hanya 60. Sehingga bahan yang akan ditimbang sebanyak :
X gram = gr I . V(ml) 1000
= 17 . 100 1000 = 1,7 gr
Jadi, bahan yang ditimbang adalah sebanyak 1,7 gram lalu dilarutkan ke dalam aquades sebanyak 100 ml. Pada proses pembuatan media MR VP Untuk menghindari kesalahan pembuatan media , salah satunya harus memperhatikan pH aquades yang digunakan. Untuk Media
MR VP yaitu 8,9±0,2 jika pH masih dibawah ketentuan atau cenderung asam. Maka harus ditambahkan dengan KOH tetes demi tetes, hingga mencapai pH yang diinginkan. Waktu pelarutan dalam pembuatan media tidak ditentukan, namun harusharus di periksa hingga tidak ada lagi butiran zat pada dinding tabung atau larutan, selanjutnya media disterilkan ke dalam autoklaf selama 15 menit setelah mencapai suhu 121⁰C. Setelah media selesai dibuat ,media MR VP dituangkan ke dalam tabung reaksi dan dilabeli setelah itu ambil koloni tunggal menggunakan ose bulat dan celupkan ose yang telah terisi bakteri kedalam media sambil diaduk perlahan, setelah itu inkubasi bakteri selama 1 x24 jam dalam suhu 37o C. Uji positf pada media MR VP akan
menghasilkan kekeruhan setelah diinkubasi selama 24 jam uji posotif diperoleh karena bakteri memfermentasi asam campuran atau fermentasi butanadiol (
Ruaa Sheltagh Nile ,2015).
Setelah diketahui uji MR VP tersebut positif , tabung uji dibagi menjadi dua bagian yaitu untuk uji MR dan VP dipipet 6 ml untuk tabung MR dan VP dipipet sebanyak 4 ml menggunakan mikropipet.
Uji MR (Methyl Red ) menggunakan reagen metilen red sebanyak 12 tetes. Uji MR untuk mengetahui fermentasi asam campuran atau fermentasi butanadiol. Uji methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yangbersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi
5.0 atau lebih rendah. Penambahan reagen metil red dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl Red berwarnamerah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH 6.2. Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme dalam larutan yang mengandung glukosa, dan setelah masa inkubasi menambahkan reagens metil red .Bila terjadifermentasi, biakan akan tetap berwarna merah. Bila tidak terjadi fermentasi,biakan berubah menjadi kuning setelah penambahan reagen methyl red . Uji ini sangat berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan, seperti pada golongan coliform dan
enterobacteriaceae..Hasil pengamatan memperlihatkan tabung uji MR bernilai positif karena terbentuk cincin yang berwarna merah sedangkan jika hasil negatif akan membentuk cincin berwarna orange. Hasil positif mengindikasikan bahwa pada medium tersebut terdapat bakteri Escherichia coli yang berarti bakteri ini
Pada sampel setelah ditambahkan reagent tidak terjadi perubahan warrna berarti hasil akhir bakteri tidak memfermentasi asetil metil karbinol (asetoin).
Uji MR bereaksi positif karena terbentuknya cincin di permukaan tabung dan setelah ditambah reagen sampel berwarna merah berarti bakteri tersebut menghasilkan asam campuran ( metilen glikogen).
mengahasilkanasam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yangterkandung dalam medium MRVP.
Tes Voges-Proskauer (VP) digunakan untuk menentukan apakah suatu organisme menghasilkan acetyl methyl carbinol dari fermentasi glukosa. Uji VP menggunakan dua reagent yaitu barrit A dan barrit B. Reagent barrit A diteteskan sebanyak 10 tetes dan reagent barrit B diteteskan sebanyak 6 tetes. Jika ada, acetylmethyl carbinol diubah menjadi diacetyl dengan adanya Barrit A (∝-naphthol ), Barrit B (alkali kuat ( 40% KOH )), dan oksigen atmosfer. The ∝ -naphthol ( reagen barrit A)digunakan sebagai intensif warna dan harus ditambahkan pertama. Senyawa mengandung diacetyl dan quanidine yang ditemukan dalam pepton kaldu kemudian mengembun membentuk polimer merah muda. Dengan persamaan reaksi sebagai berikut :
2 piruvat = acetoin + 2CO 2
acetoin + NADH + H + = 2,3-butanediol + NAD +
Uji VP ini sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui adanya 2,3 butanadiol. Karena uji ini lebih dulu menentukan asetoin, dan seperti yang kita ketahui bahwa asetoin adalah senyawa pemula dalam sintesis 2,3 butanadiol, sehingga dapat dipastikan bahwa dengan adanya asetoin dalam media berarti menunjukkan adanya produk 2,3 butanadiol sebagai hasil fermentasi.
Pada sampel yang diuji dengan media MR VP pada uji MR terdapat reaksi positif karena terbrntuknya cincin dipermukaan tabung setelah ditambahkan reagen metilen red sedangkan pada uji VP terjadi reaksi negatif karena tidak ada perubahan warna setelah inkubasi 1 x 24 jam. Jadi dapat diketahui bakter yang terdapat pada sampel adalah bakteri E.coli, karena bskteri E.Coli positif pada uji MR dan negatif pada uji VP.
Daftar pustaka
Ruaa Sheltagh Nile (2015) / Int. J. Curr. Res. Biosci. Plant Biol. 2015, 2(6):
189-197
Watson , Rachel. 2015. Sulfur Indole Motility Media (SIM). Available. http://www.uwyo.edu/molb2210_lab/info/biochemical_tests.html
Burrows, W., J.M. Moulder, and R.M. Lewert. 2016. Texbook of Microbiology. W.B. Saunders Company. Philadelphia.
Cowan,ST. 2016. Manual for the Identification of Medical Fungi. Cambridge University Press. London.
Nuria, M. C., Rosyid, A., & Sumantri. (2014). Maulita Cut Nuria Uji Kandungan Bakteri Escherichia Coli ... Jurnal -Pertanian, 5(1), 27 – 35.
Leimbach A, Hacker J, Dobrindt U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2013; 358 :3 – 32. doi: 10.1007/82_2012_303. [ PubMed ] [ Cross Ref ]
Da Costa, P.M.; Loureiro, L.; Matos, A.J. Transfer of multidrug-resistant bacteria between intermingled ecological niches: The interface between humans, animals and the environment. Int. J. Environ. Res. Public Health 2013, 10, 278 – 294.
Iredell J, Brown J, Tagg K. Antibiotic resistance in Enterobacteriaceae: mechanisms and clinical implications. BMJ (Clinical research ed). 2016;352:h6420
