Lampiran 1 Lateks alergen yang terdaftar dalam WHO-IUIS (International Union of Immunological Societies)
Nama Nama trivial Fungsi PIa&b molekul Bobot
(KDa) a&b
No. Protein
No. DNA
a allergen Sifat Tempat
Hev b 1 Rubber elongation factor Rubber biosynthesis 4.9-5.3, 5.0, 8.5 14.6, 58 P15252 X56535 Major particle Rubber Hev b 2 β-1,3-glucanases Defense related protein 9.5, 9.8, 10 34-36 P52407 U22147 Major B serum Hev b 3 Small rubber particle protein Rubber biosynthesis 4.3-5.7 22-23 O82803 - particle Rubber
Hev b 4 Microhelix component Defense related protein 4.5 50-57 P82544 - B serum
Hev b 5 Acidic latex protein - 3.5-3.9 16 Q39967 U51361 U42460 Major C-serum
Hev b6.01 Hev b6.02 Hev b6.03 Prohavein hevein Prohevein C Terminal fragment
Defense related protein (latex coagulation) 5.3,5.6 4.7, 4.9 6.0-7.4 19, 20 4.7 13.3, 14.0 P02877, P80359 M36986 M36986 M36986 Major Major Major B serum B serum B serum Hev b7.01=Hev b13 (renamed) Hev b7.02
Patatin homologue from B serum & C serum
Defense related protein Inhibitor of rubber synthesis 4.4, 4.8, 6.0 ? 43, 44 ? O04008, O81948, O65811, Q9SEM0 U80598
AJ223038 Minor C serum
Hev b 8 Latex profilin Structural protein 4.9 14.2, 15.7 10.2,
O65812, Q9STB6 Q9M7N0, Q9M7M9
C serum
Hev b 9 Latex enolase Glycolitic enzyme 5.6, 5.9, 6.0 48, 51 Q9LEJ0 Q9LEI9 C serum
Hev b 10 Mn’superoxide dismutase Destructions of radicals 4.3, 5.7, 6.1, 6.3 23, 25, 45 Q9STB5 P35017 B serum Hev b 11 Class I endochitinase Defense related protein Basic 26.0, 27.5 AJ431363 Q949H3
(gene) Hev b 12 Lipid transfer protein Defense related protein 9.3 Q8RYA8
Hev b13 = Hev b7.01 Latex esterase Defense related protein 42 P83269 major
Lampiran 2 Pembuatan larutan 1 Pereaksi Lowry
Pereaksi A
Sebanyak 15 gram Na2CO3 ditambahkan dengan 2 gram NaOH lalu dilarutkan dengan
akuades dan ditera dalam labu takar 250 mL. Pereaksi B
Sebanyak 0.2345 gram CuSO4 ditambah dengan 0.3 gram Natrium Sitrat lalu dilarutkan
dalam 10 mL akuades. Pereaksi C Pereaksi A:Pereaksi B = 50:1 Pereaksi D Folin Ceocalteus:akuades = 3:1 2. Pereaksi SDS-PAGE Akrilamida/bis (30% r, 2.67% C) 50 mL
Larutan 1 : Sebanyak 14.6 gram akrilamida dilarutkan dalam 15 mL akuades Larutan 2 : Sebanyak 0.4 gram N, N’- metilena-bis- akrilamidaa dilarutkan dalam 15
mL akuades.
Larutan 2 perlahan-lahan ditambahkan ke dalam larutan 1 lalu ditera sampai 50 mL dengan menggunakan akuades. Setelah ditera, larutan tersebut disaring
Bufer tris HCl 0.5 M pH 6.8
Disiapkan HCl 1 N. Sebanyak 3 gram Tris dilarutkan dalam 20 mL akuades. pH larutan tersebut diukur lalu ditentukan sampai menjadi 6.8 dengan menambahkan larutan HCl 1 N sedikit demi sedikit. Setelah pH menjadi 6.8, larutan ditera sampai 50 mL.
Bufer tris HCl 1.5 M pH 8.8
Sebanyak 9.08 gram tris dilarutkan dalam 25 mL akuades kemudian pH diatur menjadi 8.8 dengan menambahkan larutan HCl 1 N. Lalu larutan ditera sampai 50 mL
SDS 10%
Sebanyak 10 gram SDS dilarutkan dalam akuades lalu ditera sampai 100 mL. Bufer elektroda pH 8.3
Sebanyak 6 gram tris, 28.8 gram glisin dan 2 gram SDS dilarutkan dan dihomogenkan dengan 400 mL akuades. Lalu pH larutan diukur tanpa harus menambahkan asam atau basa ke dalam larutan.
Sampel buffer
Sebanyak 1 mL 0.5 tris HCl pH 6.8, 0.8 mL gliserol 87%, 1.6 mL SDS 10%, 0.4 mL β-Markaptoetanol, 1.5 mL 0.05% Bromphenol blue dan 2.7 mL akuades dihomogenkan dan disimpan dalam botol gelap.
Pewarna perak nitrat
Larutan 2 : Sebanyak 21 mL NaOH 0.36% ditambah dengan 1.54 mL NH4OH
25% lalu dihomogenkan.
Larutan 1 ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam larutan 2 sambil terus diaduk. Jika larutan menjadi keruh, pembuatan larutan harus diulangi dari awal. Setelah semua larutan 1 dimasukkan ke dalam larutan 2, lalu larutan ditera sampai 50 mL dengan akuades. Larutan penampak
Sebanyak 2.5 mL asam sitrat 1% ditambah dengan 0.27 mL formaldehida dan 500 mL akuades lalu dihomogenkan.
3. Pereaksi Immunoblotting Transfer buffer
Sebanyak 3.03 gram tris ditambah 14.4 gram glisin dan 200 mL metanol lalu ditera sampai 1 L dengan akuades.
PBS 5×
Sebanyak 10 gram NaCl ditambah 0.25 gram KH2PO4, 4.275 gram Na2HPO4.12H2O dan
0.25 gram KCl lalu dilarutkan dan ditera sampai 250 mL dengan akuades. Dari larutan tersebut diambil 100 mL lalu ditera sampai 500 mL dengan akuades.
PBS 0.05%
Sebanyak 100 mL larutan PBS 5× ditambah 0.25 mL Tween 20, lalu ditera hingga 500 mL. Larutan ini harus selalu baru.
bufer Western
Sebanyak 1.5125 gram Trisma base ditambah 0.073 gram EDTA, 2.1915 gram NaCl, 0.5 gram susu nonfat dry milk dan 125 µL Tween TC lalu ditera dengan akuades sampai 250 mL.
Pembuatan substrat DAB : 1 tablet DAB dilarutkan dalam 15 mL PBS 1× ditambah 12 µL H2O2 30%
4. Pereaksi elektroeluter Bufer elusi
Sebanyak 3 gram trisma base ditambah 14.4 gram glisin dan 1.0 gram SDS lalu ditera sampai 1 L dengan akuades.
Kurva standar protein Lowry y = 0.0055x + 0.0244 R2 = 0.9973 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0 50 100 150 200 250 Konsentrasi Ab so rb an s
Lampiran 3 Bagan alat elektroeluter
Lampiran 4 Standar protein Lowry No. Konsentrasi (µg/mL) OD 1. 0.00 0.000 2. 12.50 0.100 3. 25.00 0.199 4. 50.00 0.282 5. 100.00 0.575 6. 200.00 1.127
Lampiran 5 Standar protein SDS-PAGE dengan pewarna AgNO3
No. BM log BM Panjang gel
(cm) Jarak pita (cm) Rf 1. 200 2.30 5.95 0.05 0.01 2. 116 2.06 5.95 0.60 0.10 3. 97.4 1.99 5.95 0.85 0.14 4. 66 1.82 5.95 1.70 0.29 5. 45 1.65 5.95 2.55 0.43 6. 31 1.49 5.95 2.80 0.47 7. 21.5 1.33 5.95 3.85 0.65 8. 14.5 1.16 5.95 5.30 0.89
Gromet
Tabung kaca
Adaptor silikon
Membran
Banana plags
Kurva standar protein gel
y = -1.2793x + 2.2022 R2 = 0.9653 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00Rf
Lo
g B
M
Lampiran 6 Pita protein SDS-PAGE dengan pewarna AgNO3
No. Sampel Pita ke- gel (cm) Panjang Jarak pita (cm) Rf Log BM BM
1. Lutoid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 1.00 1.20 1.50 1.60 2.00 2.10 2.40 2.55 2.65 2.85 3.02 3.20 3.30 3.40 3.60 3.90 4.35 4.50 4.80 5.10 5.20 5.60 0.17 0.20 0.25 0.27 0.33 0.35 0.40 0.43 0.44 0.48 0.50 0.53 0.55 0.57 0.60 0.65 0.73 0.75 0.80 0.85 0.87 0.93 1.989 1.946 1.882 1.861 1.776 1.754 1.690 1.658 1.637 1.595 1.558 1.520 1.499 1.477 1.435 1.371 1.275 1.243 1.179 1.115 1.093 1.008 97 88 76 73 60 57 49 46 43 39 36 33 32 30 27 23 19 17 15 13 12 10 2. Serum C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 1.00 1.10 1.25 1.50 1.65 1.85 2.00 2.15 2.30 2.45 2.65 3.00 3.20 0.17 0.18 0.21 0.25 0.28 0.31 0.33 0.36 0.38 0.41 0.44 0.50 0.53 1.989 1.968 1.936 1.882 1.850 1.808 1.776 1.744 1.712 1.680 1.637 1.563 1.520 97 93 86 76 71 64 60 55 51 48 43 37 33
Lanjutan lampiran 6 Pita protein SDS-PAGE dengan pewarna AgNO3
No. Sampel Pita ke- gel (cm) Panjang Jarak pita (cm) Rf Log BM BM 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 3.45 3.60 3.75 3.90 4.10 4.30 4.60 4.95 5.25 5.50 5.70 5.90 0.58 0.60 0.63 0.65 0.68 0.72 0.77 0.83 0.88 0.92 0.95 0.98 1.467 1.435 1.403 1.371 1.328 1.285 1.221 1.147 1.083 1.030 0.987 0.944 29 27 25 23 21 19 17 14 12 11 10 9 3. DPNR 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 0.45 0.65 0.85 0.95 1.05 1.25 1.60 1.80 2.00 2.10 2.20 2.40 2.55 2.65 3.00 3.35 3.70 4.50 5.00 5.65 0.08 0.11 0.14 0.16 0.18 0.21 0.27 0.30 0.33 0.35 0.37 0.40 0.43 0.44 0.50 0.56 0.62 0.75 0.83 0.94 2.106 2.064 2.021 2.000 1.978 1.936 1.861 1.818 1.776 1.754 1.733 1.690 1.658 1.637 1.563 1.488 1.413 1.243 1.136 0.998 128 116 105 100 95 86 73 66 60 57 54 49 46 43 37 31 26 17 14 10 4. Komersial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 0.45 0.65 0.8 1.00 1.20 1.45 1.60 2.20 2.40 2.55 2.65 2.75 3.00 3.25 3.50 3.70 3.80 3.95 5.10 5.70 0.08 0.11 0.13 0.17 0.20 0.24 0.27 0.37 0.40 0.43 0.44 0.46 0.50 0.54 0.58 0.62 0.63 0.66 0.85 0.95 2.106 2.064 2.032 1.989 1.946 1.893 1.861 1.733 1.690 1.658 1.637 1.616 1.563 1.509 1.456 1.413 1.392 1.360 1.115 0.987 128 116 108 97 88 78 73 54 49 46 43 41 37 32 29 26 25 23 13 10
Kurva Standar Protein Membran
y = -1.2467x + 2.3033 R2 = 0.9896 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200Rf
L
og B
M
Lampiran 7 Standar protein pada membran nitroselulosa
No. BM log BM Panjang gel (cm) Jarak pita (cm) Rf
1. 200 2.30 5.75 0.20 0.035
2. 116 2.06 5.75 1.00 0.174
3. 31 1.49 5.75 3.65 0.635
4. 21.5 1.33 5.75 4.20 0.730
5. 14.5 1.16 5.75 5.55 0.965
Lampiran 8 Pita protein membran nitroselulosa
No. Sampel Pita ke- gel (cm) Panjang Jarak pita (cm) Rf Log BM BM
1. Lutoid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 0.15 1.05 1.30 1.55 1.65 1.92 2.02 2.15 2.45 2.52 2.70 2.80 2.95 3.05 3.25 3.30 3.60 3.75 4.45 4.80 0.03 0.18 0.23 0.27 0.29 0.34 0.35 0.38 0.43 0.44 0.47 0.49 0.52 0.54 0.57 0.58 0.63 0.66 0.78 0.84 2.270 2.074 2.019 1.964 1.942 1.883 1.861 1.833 1.767 1.752 1.713 1.691 1.658 1.636 1.592 1.582 1.516 1.483 1.330 1.253 186 118 104 92 88 76 73 68 59 57 52 49 46 43 39 38 33 30 21 18 2. Serum C 1 2 3 4 5 6 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 0.40 0.60 0.75 0.85 1.00 1.05 0.07 0.11 0.13 0.15 0.18 0.18 2.216 2.172 2.139 2.117 2.085 2.074 164 149 138 131 122 118
Lanjutan lampiran 8 Pita protein membran nitroselusa
No. Sampel Pita ke- gel (cm) Panjang Jarak pita (cm) Rf Log BM BM 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 1.15 1.25 1.35 1.55 1.65 1.75 1.85 2.00 2.08 2.28 2.45 2.57 3.00 3.05 3.10 3.25 3.45 3.70 3.85 4.45 4.85 0.20 0.22 0.24 0.27 0.29 0.31 0.32 0.35 0.36 0.40 0.43 0.45 0.53 0.54 0.54 0.57 0.61 0.65 0.68 0.78 0.85 2.052 2.030 2.008 1.964 1.942 1.921 1.899 1.866 1.848 1.805 1.767 1.741 1.647 1.636 1.625 1.592 1.549 1.494 1.461 1.330 1.243 113 107 102 92 88 83 79 73 71 64 59 55 44 43 42 39 35 31 29 21 17 3. DPNR 1 2 3 4 5 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 1.65 1.75 2.80 2.95 3.05 0.29 0.31 0.49 0.52 0.54 1.942 1.921 1.691 1.658 1.636 88 83 49 46 43 4. Komersial 1 2 3 4 5 5.65 5.65 5.65 5.65 5.65 1.62 1.70 2.90 3.05 3.6 0.29 0.30 0.51 0.54 0.64 1.946 1.928 1.663 1.630 1.509 88 85 46 43 32 Lampiran 9 Kromatogram protein antigen
Ekstraksi sampel metode RRIM
Penentuan kadar protein metode Lowry
SDS-PAGE
Western Blotting
HPLC Elusi Protein Lampiran 11 Bagan alir penelitian
