Kuliah ke-4 STERILISASI DALAM FERMENTASI

Kuliah ke-4

STERILISASI DALAM FERMENTASI

Tujuan Instruksional Khusus :

• Mahasiswa mampu menjelaskan

sterilisasi dalam proses fermentasi

• Produk fermentasi diperoleh bila mikroorganisme tumbuh pada media yang sesuai



Bila terkontaminasi, maka :

 Produktivitasnya menurun akibat kompetisi mikrobia

 Kontaminan mendominasi kultur dan mengganti mikrobia yang diinginkan.

 Mempengaruhi kualitas produk, misalnya pada produksi protein sel tunggal.

 Kesulitan dalam ekstraksi produk

 Kontaminan akan mendegradasi produk, misalnya pada produksi antibiotik.

 Kontaminan berupa bakteriofag dapat menyebabkan sel mikrobia menjadi lisis.

•

• Usaha-usaha untuk menghindari kontaminasi :

 Penggunaan kultur murni

 Sterilisasi medium

 Sterilisasi tangki fermentasi

 Sterilisasi bahan tambahan

 Pemeliharaan kondisi aseptik.

Tergantung proses

fermentasi dan derajat konsekwensi

Cara-Cara Sterilisasi

• Metode kimia

 Untuk peralatan yang sensitif terhadap panas

 → ethylene oxide (gas untuk alat

 → 70% ethanol-air (pH=2)  untuk alat/permukaan

 → 3% sodium hypochlorite  untuk alat

• Proses pemanasan

• Radiasi

UV  untuk permukaan

Sinar X  untuk cairan

 Metode umum : pemanasan basah atau kering

Cara-Cara Sterilisasi ...

• Sonikasi (sonik /getaran ultrasonik)

• Sentrifugasi kecepatan tinggi

• Filtrasi  untuk bahan yang sensitif panas dan udara

Proses Sterilisasi

• Dilakukan pada reaktor baik dalam kondisi kosong maupun yang sudah diisi dengan media

• Reaktor dipanaskan engan uap jenuh (suhu 121 -141

^o

C) menggunakan sistem pindah

panas (double jacket atau alat penukar panas lainnya) dengan waktu sesuai dengan yang

diinginkan  reaktor didinginkan

Waktu dan Suhu Sterlisasi dari beberapa mikroorganisme

STERILISASI MEDIUM

• Caranya : - dengan filtrasi presipitasi

- dengan pemanasan  yang utama 

pemanasan basah  mudah, ekonomis

KINETIKA KEMATIAN TERMAL MIKROBA 1. Laju Kematian

• Terdiri atas : - laju kematian logaritmik - laju kematian non logaritmik a. Laju Kematian Logaritmik

• Terdapat pada kultur murni

• Laju kematian logaritmik secara matematik :

dt kN dN 

N= konsentrasi mikrobia (jumlah/ml) k = konstanta laju kematian spesifik (menit^-1)

t = waktu (menit)

……….Pers.1

• Integrasi dari persamaan (1) dengan batasan N = N_o dan t = t_o menghasilkan :

...Pers 2) atau

N_o = jumlah mikrobia pada awal sterilisasi N_t = jumlah mikrobia pada akhir sterilisasi

kt o

t e

N

N _



N kt N

o

t  

ln ……..Pers 3)

o t

N N

o t

N ln N

Waktu (t) Waktu (t)

Gambar 1. Proporsi sel hidup pada mikrobia yang mengalami sterilisasi berdasarkan

persamaan 2 dan 3.

Slope = k

• Slope kurva = k  Nilai absolut k =

pengukuran resistensi termal organisme,

semakin kecil nilai k maka resistensi mikroba

terhadap aktivitas termal semakin tinggi.

Gambar 2. Laju kematian tipikal bagi sel-sel vegetatif E.coli

T=54^oC

T=56^oC

T=58^oC

T=60^oC

N/N_o

10 1 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5

0 2 4 6 8 10

Waktu (Menit)

b. Laju Kematian Non Logaritmik

• Sering terdapat pada spora bakteri

• Penyebab penyimpangan : germinasi spora, teknik eksperimen yang belum baik.

o t

N ln N

o t

N ln N ln N

Waktu Waktu Waktu

... = Kultur murni

________ = Organisme Sensitif - - - - = Organisme Resisten

Gambar 3. Penyimpangan kurva pada proses sterilisasi akibat kultur campuran dan aktivasi spora

• Urutan kejadian untuk model kematian non logaritmik diusulkan oleh Prokop and

Humprey (1970)  inaktivasi spora terjadi dengan cara :

_kR

_kR

NR  Ns  ND

Spora intermediet mati resisten sensitif

• Persamaan diferensial untuk model ini :

R R

R k N

dt

dN   ……….4)

s s R

s kRN k N

dt

dN   ………...5)

N_R = konsentrasi spora resisten (jumlah/ml) N_s = konsentrasi spora sensitif (jumlah/ml) N_D = spora yang mati (jumlah/ml)

k_R = laju inaktivasi spesifik spora resisten (menit^-1) k_s = laju inaktivasi spesifik spora sensitif (menit^-1) t = waktu (menit)

• Penyelesaian persamaan (5) :

N = kosentrasi sel hidup yang dapat diperoleh kembali setiap saat = N_s+ N_R (jumlah/ml) N_o = konsentrasi sel hidup awal (jumlah/ml)

)]

exp(

)

[exp(

_R^t

R s s

s R

R o

k k t k

k k k

k N

N  

 

_{Pers 6)}

• Pada sterilisasi medium fermentasi, kosentrasi dan tipe mikrobia seringkali tidak diketahui, sehingga digunakan resistensi termal relatif mikrobia untuk merancang siklus sterilisasi

Mikrobia Resistensi Relatif Bakteri vegetatif dan khamir 1.0

Spora bakterial 3 x 10⁶

Spora Kapang 2 – 10

Virus dan Bakteriofag 1 - 5

Tabel 1. Resistensi relatif dari berbagai mikrobia terhadap panas uap air.

spora bakteri lebih resisten terhadap panas uap air  siklus sterilisasi dirancang berdasarkan destruksi spora bakteri

2. Pengaruh Suhu Terhadap Kinetika Kematian

• Teori yang sering digunakan : Teori Arrhenius

RT

Ae

E

k 

^{ /} ………..Pers (7)

RT A E

k  ln 

ln ………..Pers (8)

E = energi aktivasi kematian (kal/mol) R = konstanta gas (kal/mol^o K)

T = suhu (^oK)

A = konstanta Arrhenius (menit^-1)

• Kombinasi persamaan (3) dan persamaan (7) menghasilkan :

RT E t

o A e

N

N _/

..

ln  ^ ………..Pers 9)

N N_o

ln = kriteria sterilisasi atau Del factor = V

= suatu destruksi sel mikrobia terhitung akibat kenaikan suhu pada waktu tertentu.

) /

.

(

. t e

^{E RT}

A

V 

^ …………Pers 10) atau

) ln(

ln A

V RT

t  E  …………Pers 11)

3. Sterilisasi Media Secara Batch

• Informasi yang diperlukan :

a) Profil peningkatan dan penurunan suhu dalam media

b) Jumlah mikrobia awal

c) Karakteristik kurva destruksi mikrobia oleh

panas. Pada umumnya dipilih spora bakeri yang tahan panas yaitu Bacillus stearothermophillus.

d) Resiko/derajat kontaminasi yang ditoleransi, misalnya 1 sel dalam 1000 atau N_t = 10^-3 sel hidup.

• Bila jumlah mikrobia awal pada media = 10¹¹ sel

hidup, dan derajat kontaminasi yang ditoleransi 10^-3, maka harga del factor :

3 11

10 ln 10

ln  _



t o

N

V N = ln 10¹⁴ = 32.2

diperoleh sejak pemanasan, sterilisasi sampai pendinginan, sehingga :

V_total = V_pemanasan + Vsuhu sterilisasi + Vpendinginan

• Perhitungan del factor selama pemanasan dan pendinginan :

 Dari persamaan 10 :

 Pada periode ini suhu dianggap konstan

sehingga perubahan hanya terjadi pada suhu sterilisasi.

 Perubahan suhu secara grafis digambarkan sebagai berikut :

) /

. (

.t e ^{E RT} A

V  ^

t₁ t₂ t₃ t₄ t₅ t₆

Suhu

Waktu

Gambar 4. Metode grafis yang digunakan untuk menggambarkan hubungan waktu dan suhu serta perhitungan harga V.

• Harga V untuk setiap bagian : V₁ = k₁t, V₂ = k₂t, V₃

= k₃t dst.

• Nilai k₁, k₂ dst dicari dengan persamaan Arrhenius

sedangkan harga t dapat dilihat dari kurva seperti pada Gambar 4.

• Dengan menggunakan persamaan Arrhenius, maka

nilai k untuk spora B.stearothermophillus dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Korelasi antara kecepatan kematian spesifik (k) spora B.stearothermophilus dengan suhu pemanasan

• Contoh : Diketahui suhu sterilisasi 121^oC dengan total del factor 32.2. Jika kenaikan suhu dari 100^oC ke 121^oC dicapai selama 30 menit dan penurunan suhu dari 121^oC ke 100^oC dicapai dalam waktu 17 menit, berapakah total waktu sterilisasi?

• Jawab : Dari Tabel 2 diperoleh nilai del factor pada suhu 121^oC = 12.549, maka :

V_{pemanasan 100-121}^o_C = Vpendinginan 121-100o

C = Vsuhu sterilisasi 121o

C =

21 30 549 .

12 x = 17.93

21 17 549 .

12 x = 10.16

32.2 – 17.93 – 10.16 = 4.11 V₁₂₁^o_C = k₁₂₁^o_C.t₁₂₁^o_C t₁₂₁^o_C =

54 . 2

11 .

4 = 1.62 menit

total waktu sterilisasi = 30 + 1.62 + 17 = 48.62 menit

• Perhitungan waktu pada suhu sterilisasi (121^oC) V_total = V_pemanasan + Vsuhu sterilisasi + Vpendinginan

Misal : V_total = 32.2

V_pemanasan = 9.8, Vpendinginan = 10.1, maka : V_suhu sterilisasi = 32.2 – 9.8 – 10.1 = 12.3

Diketahui nilai k untuk B.stearothermophillus pada suhu 121^oC adalah 2.54/menit, maka waktu untuk suhu sterilisasi adalah :

V = kt  t = V/k = 12.3/2.54 = 4.84 menit pada suhu 121^o C

• Bila kontribusi pemanasan dan pendinginan diabaikan selama proses sterilisasi, maka : = 12.68 menit pada 121^oC.

68 . 54 12

. 2

2 . 32 



 k t V^total

Gambar 7. Proses Sterilisasi Secara Batch

Perencanaan Dalam Proses Sterilisasi Media

• Asumsi :

Kerusakan bakteri terjadi di atas suhu 100^oC

Penetrasi panas atau pendinginan di atas suhu 100^oC adalah linier.

o Scale up proses sterilisasi secara Batch :

Dasar perhitungan del factor : total kontaminan yang ada dalam media dan bukan volume media

 Jika ukuran fermenter bertambah maka total sel awal juga naik, tapi probabilitas sel yang

digunakan untuk mencapai tingkat sterilisasi tertentu harus tetap sehingga nilai V akan naik.

• Contoh :

Proses sterilisasi skala pilot plant dengan 1000 l tangki media mengandung kontaminan

10

⁶

/ml, diinginkan proses sterilisasi dengan probabilitas kontaminan 1/1000 maka :

Bila digunakan tingkat sterilisasi yang sama tetapi pada skala produksi 10.000 l media, maka :

5 . 34 10

10 ln

) 10 10

10

ln ( ₃ ¹⁵

3 3

6  

 x _ x

V

8 . 36 10

10 ln

10 10

10

ln ( ₃ ¹⁶

4 3

6  

 x _ x

V

4. Sterilisasi Kontiniu

• Keuntungan :

1) Mudah dalam pengawasan proses 2) Reduksi kapasitas uap

3) Reduksi waktu siklus sterilisasi

4) Potensial dalam pengembangan hasil produk fermentasi

• Cara :

 Medium dipanaskan secara tidak langsung dalam pipa atau plat dan penyangga panas

 Dengan injeksi uap

Gambar 8. Proses sterilisasi secara kontiniu

Cooling heat exchanger

Pre- heat heat exchanger

Venturi valve

Flow diagram of a typical continuous injector flash cooler steriliser

Cooling Cooling Unsterile water in water out medium in

Expansion chamber Expansion

valve

Holding coil

Sterile

medium out

Steam in

6. Sterilisasi Fermenter

• Jika media disterilisasi terpisah, maka fermenter juga harus disterilisasi

• Cara :

Mengalirkan uap panas pada suhu 121^oC selama 20 menit

Semua bagian yang kontak langsung dengan media harus disterilisasi

7. Sterilisasi Udara

• Pada proses fermentasi aerob diperlukan aliran udara steril ke dalam media secara kontiniu.

• Cara : - dengan pemanasan

- dengan filtrasi  lebih umum di industri

• Ada 2 jenis filter : 1. Filter absolut :

 ukuran pori lebih kecil dari partikel/mikroba yang disaring. Contoh : 0.2 

Efisien, tapi cepat mengalami pressure drop sehingga harus sering diganti.

2. Filter fibrous :

 Ukuran pori lebih besar dari partikel/mikroba yang disaring. Misal : 0.5 – 1.5

 Banyak digunakan untuk sterilisasi udara pada industri fermentasi

 Terbuat dari kapas, kapas gelas atau kapas baja.

8. Perencanaan Sterilisasi Udara

• Contoh : dibutuhkan udara steril untuk fermenter

berukuran 10 m x 60 m x 100 m proses fermentasi. Dari percobaan sebelumnya diperoleh kecepatan aliran udara optimum 0.15 m/detik pada nilai k = 1.535/cm.

Dimensi filter =

Udara dalam pabrik mengandung 200 mikroba/m³, sehingga :

N_o = total mikroba = volume udara x 200 = 10 x 60 x 100 x 200 = 12 x 10⁶ mikroba

 kx

 N

O

ln N

• Derajat kontaminasi yang ditoleransi = N = 10^-3

10^-3

ln = - kx  ln 8.33 x 10^-11 = -1.535 x 12x10⁶

x = 15.12 cm  tebal filter = 15.12 cm Luas area filter yang digunakan =

Volume aliran udara kecepatan linier 10

 r² = m²  radius (r) filter = 0.59 m 0.15 x 60

SOAL

• Hitunglah waktu yang dibutuhkan untuk proses sterilisasi media fermentasi berikut :

 Jumlah awal bakteri pada media : 5 x 10¹² per m³, dan jumlah akhir yang diinginkan adalah 1 per 1000.

 Volume media 40 m³ dengan suhu awal 25^oC. Media disterilisasi dengan sistem pemanasan langsung menggunakan uap jenuh dalam sebuat fermentor. Uap dengan tekanan 345 kPa (tekanan absoult) diinjeksikan dengan kecepatan 5,000 kg/jam, dan injeksi uap dihentikan ketika suhu sudah mencapai 122^oC.

 Suhu media ditahan pada 122^oC. Panas yang hilang selama waktu pemanasan dapat diabaikan, kemudian media didinginkan dengan cara melewatkan air suhu 20^oC dengan kecepatan 100 m³/jam melalui koil pendingin hingga suhu akhir media mencapai 30^oC. Luas permukaan koil adalah 40 m³, and laju pindah panas overall (U) = 2500 kJ/jam.m².K.

 Resistensi panas spora bakteri adalah :

• k_do = 5.7 x 10³⁹ per jam

• E_d = 2.834 x 10⁵ kJ / kmol

 Nilai Panas spesifik media (c) = 4.187 kJ/kg.K dan densitasnya (ρ) = 1000 kg/m³

Studi Kasus 1

Carilah proses persiapan media fermentasi untuk pembuatan Bir (dari Wort)

Bandingkan dengan persiapan media

untuk produksi penisilin

Studi Kasus 2

• Cari perbedaan antara proses sterilisasi dengan sistem pemanasan langsung dan sistem pemanasan tidak langsung

(menggunakan alat penukar panas)

• Berikan contoh aplikasi masing-masing

pada industri pangan.