Kromatografi Lapis Tipis dan Kromatografi Kertas
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Ada banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan. Kromatografi sangat diperlukan dalam kefarmasian dalam memisahkan suatu campuran senyawa. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam.
Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari
penyusunan cuplikan antara dua fasa.
Satu fasa tetap tinggal pada system dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya dinamakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Prosedur kromatografi masih dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat dilakukan karena jumlah cuplikan rendah, kompleksitas campuranyang hendak dipisahkan atau sifat berkerabat zat yang dipisah
Kromatografi dibagi menjadi beberapa macam, tetapi pada praktikum Farmakognosi II yang digunakan hanya 2 jenis kromatografi yaitu kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis.
Oleh karena itu, pada makalah ini hanya akan dijelaskan kedua kromatografi tersebut.
1.2 Rumusan Masalah/Topik Bahasan
1. Apakah pengertian dari kromatografi ?
2. Apakah macam-macam dari kromatografi?
1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui pengertian dan cara kerja dari kromatografi.
2. Untuk mengetahui macam-macam dan cara kerja masing-masing kromatografi.
BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Pengertian Kromatografi
Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk pemisahan tertentu. Cara ini dikenalkan oleh TSWETT, ia telah menggunakan untuk pemisahan senyawa – senyawa yang berwarna, dan nama kromatografi diambillkan dari senyawa yang berwarna. Meskipun demikian pembatasan untuk senyawa- senyawa yang berwarna tak lama dan hampir kebanyakan pemisahan – pemisahan secara kromatografi sekarang diperuntukkan pada senyawa – senyawa yang tak berwarna (Sastrohamidjojo, 1985).
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit – analit dalam sampel terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan gerak. Fase diam dapat berupa bahan padat dalam bentuk molekul kecil atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fase gerak maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam
kromatografi cair dan juga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair (Rohman, 2009).
Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan perbedaan - perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar. Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase stationer) dan fase gerak (fase mobil).Fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fase diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004).
Pemisahan yang terjadi dalam kromatografi dilaksanakan dengan memanipulasi sifat- sifat dari senyawa, yaitu :
1) kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan)
2) kecenderungan suatu molekul untuk bertaut dengan suatu serbuk padat (absorbsi) 3) kecenderungan suatu molekul untuk menguap
Letak bercak yang diperoleh dari zat yang dikromatografi dapat ditetapkan dengan cara berikut (Dirjen POM, 1979) :
1. Pengamatan langsung, jika zat tampak dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet.
2. Pengamatan dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet setelah kertas disemprotkan
dengan pereaksi yang dapat membuat bercak tersebut tampak.
3. Menggunakan pencacah Geiger-Muller atau tekhnik otoradiografi, jika zat radioaktif.
4. Menempatkan pita atau potongan kertas pada medium pembiakan yang tealh ditanami, untuk
melihat hasil stimulasi atau hambatan dari pertumbuhan bakteri.
2.2 Macam-macam Kromatografi
Pembagian ini selanjutnya dapat dibagi lagi seperti telihat pada skema berikut:
KROMATOGRAFI : 1. Kromatografi Gas a. GLC
b. GSC
2. Kromatografi Cair a. HPLC
b. LLC-PC
c. LSC-TLC, Kolom d. Ion Excange e. Ekslusi : - GP - GF Keterangan
GLC = Gas Liquid Chromatography GSC = Gas Solid Chromatography LLC = Liquid Liquid Chromatography LSC = Liquid Solid Chromatography PC = Paper Chromatography
TLC = Thin Layer Chromatography GP = Gel Permeation
GF = Gel Filtration
HPLC = High Performance Liguid Chromatography
1. Liquid Liquid Chromatography (LLC)
LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak.
2. Liquid Solid Chromatography (LSC)
LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel, alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam sebuah kolom dimana komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini.
3. Ion-exchange chromatography
Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion.
Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan.
4. Exclusion chromatography
Dalam teknik ini, gel nonionik berpori banyak dengan ukuran yang sama digunakan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM).
5. HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
Dalam beberapa tahun ini teknologi HPLC dan pemakaiannya sangat berkembang dan walaupun nisbi mahal, HPLC telah menjadi metode analisis rutin dan bahkan preparative pada banyak laboratorium.
Metode dalam kromatografi cair dibagi atas dua macam :dua macam
a) Kromatografi Cair Retensif
Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat terlarut dengan fase diam. Tipe ini mencakup fase normal, fase terbalik, dan kromatografi ion.
b) Kromatografi Cair Non-retensif
Pemisahan yang dicapai tergantung kepada perbedaan besar molekul zat terlarut dimana terjadi interaksi antara zat terlarut dengan pori yang terdapat di permukaan fase diam. Tipe.ini dikenal sebagai kromatografi ekslusi.
6. Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi penukar ion, kromatografi penyaringan gel, dan elektroforesis.
a. Kromatografi Lapis Tipis.
Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca.
Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai “kolom kromatografi terbuka” dan pemisahan dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak tetap, jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas. Oleh karena itu pada lempeng yang sama di samping kromatogram zat
yang di uji perlu dibuat kromatogram zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda (Dirjen POM, 1979, hal. 782).
Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir – butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan , ditotolkan berupa berupa bercak atau pita (awal). Setelah plat atau lapisan ditaruh didalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok ( gambar 2).
Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) (gambar 2). Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen- komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
Gambar 1 . Bejana berisi KLT sebelum pengembangan
Gambar 2 : bejana berisi plat KLT sebelum pengembanga.
Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan sistem larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama untuk mencapai
pemisahan. Selain itu hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum yang meliputi sifat pengembangan, jarak pengembangan , atmosfer bejana dan lain- lain . Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf.
Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal Jarak garis depan dari titik awal
Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal.
hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0 – 100. Jika keadaan luar misalnya sifat penjerap yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang secara umum menunjukkan angka Rf lebih rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka hRf lebih tinggi dari hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hRf lebih rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan (Stahl 1985).
Sifat – sifat umum dari penyerap- penyerap untuk kromatografi lapis tipis adalah mirip dengan sifat – sifat penyerap untuk kromatografi kolom. Dua sifat penting dar penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada mereka. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25 mikron . Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus.
Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel. Silika gel yang digunakan kebanyakan diberi pengikat yang dimaksudkan untuk memberi kekuatan pada lapisan dan menambah adhesi pada gelas penyokong. Pengikat yang digunakan kebanyakan kalsium sulfat. Tetapi biasanya dalam perdagangan silika gel telah diberi pengikat. Jadi tidak perlu mencampur sendiri dan diberi nama dengan kode silika gel G (Sastrohamijojo 1985).
Analisis dengan KLT dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang kelompok kandungan kimianya telah diketahui.
Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain : 1. Alkaloid
2. Antraglikosida 3. Arbutin
4. Glikosida Jantung 5. Zat pahit
6. Flavonoid 7. Saponin 8. Minyak atsiri
9. Kumarin dan asam fenol karboksilat 10. Valepotriat
Penyediaan larutan zat yang diperiksa
1. Alkaloid
Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian dibasahi dengan 1 ml amonia encer P.
Bahan disari dengan 5 ml metanol P dilakukan dengan cara dikocok pada suhu 60°C selama 15 menit. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.
2. Antraglikosida, Arbutin, zat pahit dan flavonoid
Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 5 ml metanol P.
penyarian dilakukan dengan cara dipanaskan di atas tangas air selama 15 menit. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.
3. Saponin
Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 5 ml metanol P.
penyarian dilakukan dengan cara dipanaskan di atas tangas air selama 15 menit. Sari diuapkan sampai diperoleh 1 ml, kemudian ditambah dengan 0,5 ml air dan 3 ml butanol P, sambil dikocok. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.
4. Glikosida Jantung
Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 5 ml metanol P 50 % dan
10 ml larutan timbal (II) asetat LP. Campuran dipanaskan di atas tangas air selama 10 menit.
Filtrat setelah dingin disari 2 kali, masing-masing dengan 10 ml diklormetana P. Sari dikumpulkan, kemudian diuapkan. Sisa dilarutkan dalam campuran diklormetana P dan metanol P. (1:1). Filtrat sebanyak 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.
5. Minyak atsiri, Kumarin, asam fenol karboksilat dan valepotriat
Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 10 ml diklormetana P.
Penyarian dilakukan dengan cara direfluks 15 menit. Filtrat yang diperoleh kemudian diuapkan sampai kering. Sisa dilarutkan dalam 1 ml toluena P. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.
Lempeng KLT
Lempeng yang digunakan lempeng silikagel 254P dengan ukuran 10 cm x 10 cm.
Lempeng dapat berupa lempeng kaca atau lempeng lain yang cocok. Untuk menentukan kelompok kandungan kimia suatu simplisia sekurang-kurangnya diperlukan 10 lempeng.
Cairan elusi
1. Dietil eter- toluene (1:1)
Cairan elusi dijenuhkan dengan larutan asam setat P 10% digunakan untuk mengelusi pemeriksaan KLT yang mengandung Kumarin.
