Pembelajaran 5.2 : Kromatografi kertas dan lapis tipis
1. Capaian pembelajaran :
Setelah menyelesaikan proses pembelajaran pada modul ini, mahasiswa diharapkan memiliki kemampuan :
1. Memahami prinsip dasar kromatografi kertas dan lapis tipis 2. Memahami tentang Rf pada kromatografi kertas dan lapis tipis
Untuk membantu Anda dalam mencapai tujuan-tujuan tersebut, dalam modul ini akan disajikan uraian, latihan (pengayaan) dan rambu-rambu jawaban serta soal evaluasi. Agar anda dapat belajar dengan baik dalam mempelajari modul ini, lakukanlah hal-hal berikut : 1. Pelajarilah dengan cermat semua uraian yang tercantum dalam masing-masing proses
pembelajaran.
2. Kerjakanlah soal-soal latihan (pengayaan) yang terdapat dalam setiap proses pembelajaran dengan berusaha tanpa melihat dahulu rambu-rambu jawabannya. Setelah Anda selesai mengerjakan soal-soal tersebut, cocokkanlah pekerjaan anda dengan rambu-rambu jawaban yang tersedia. Bila pekerjaan Anda masih jauh menyimpang dari rambu-rambu jawaban, hendaknya Anda tidak berputus asa untuk mempelajarinya kembali.
3. Dalam setiap proses pembelajaran diakhiri dengan intisari (rangkuman) yang merupakan sari pati dari uraian yang telah disajikan. Bacalah dengan seksama isi rangkuman tersebut sehingga pengalaman belajar Anda benar-benar mantap.
4. Evaluasi (tes formatif) yang disusun setelah rangkuman merupakan tes yang diberikan untuk mengukur penguasaan Anda dalam pokok bahasan yang telah dipaparkan dalam proses pembelajaran. Hasil anda dalam tes formatif tersebut digunakan sebagai dasar penentuan apakah Anda sudah dapat melanjutkan ke proses pembelajaran berikutnya ataukah masih perlu mengulang. Seberapa jauh tingkat penguasaan Anda, dapat Anda hitung sendiri dengan rumus sederhana yang dicantumkan pada setiap akhir tes formatif.
2. Materi
a. Kromatografi Kertas
Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Pemisahan beberapa kation dan anion-anion dapat dilakukan dengan baik dan efektif menggunakan krematografi kertas dan lapisan tipis. Kromatografi kertas adalah teknik pemisahan yang menggunakan pita selebar 2-5cm dimana lembaran panjangnya dapat dengan mudah digunting sedangkan kromatografi lapisan tipis adalah (TLC) merupakan teknik pemisahan yang menggunakan lembaran tipis aluminium oksida, gel silika, selulosa atau suatu bahan lain yang didukung oleh suatu lembaran logam atau suatu polimer.
Kromatografi kertas maupun lapisan tipis menggunakan sedikit bahan yang diletakkan pada daerah terbatas didekat ujung selembar kertas saring atau lapis tipis. Suatu pelarut dibiarkan berdifusi dari ujung kertas atau lapis tipis melalui kerja kapiler ; pada kondisi selang beberapa waktu (1-30 jam), campuran akan dijumpai telah berpindah kedaerah penotolan dan telah terpisah sebagian atau seluruhnya menjadi komponen-komponen dengan zona yang yang jelas. Zona –zona dalam bentuk noda-noda atau pita-pita dapat ditentukan letaknya dengan menggunakan reagensia kimia yang sesuai.atau menggunakan pendaran fluor ultra-violet
Posisi yang dicapai oleh suatu zat atau ion dirumuskan dengan RF dimana
merupakan angka banding jarak yang dijalani oleh suatu zat atau ion teerhadap jarak yang dijalani garis depan pelarut dan diukur dari titik penotolan campuran. Gambar VI.2 akan membantu menjelaskan definisi dari RF.
Point (a) adalah sepotong kertas saring terbenam dalam pelarut dan ditopang oleh sebatang kaca. Point (b) AB menyatakan dimana noda larutan ditotolkan pada awal eksperimen. Point (c) posisi kedua pita dibuat nampak misalnya dengan menyemprotkan reagensia yang sesuai pada daerah C dan D dan juga garis depan pelarut E. Harga RF dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain:
a. Kehadiran ion lain
b. Keasaman larutan aslinya
c. Waktu melakukan percobaan misalnya dengan sepotong kertas d. Adanya kation lain dan konsentrasi
Tehnik pemisahan kromatografi kertas
Proses pengeluaran asam mineral dari kertas saring disebut desalting, larutan ditempatkan pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2-3 cm dari salah satu ujung kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, diletakkan di dalam ruang yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang sesuai, penjenuhan dapat dilakukan 24 jam sebelum analisis, adapun tiga tehnik pelaksanaan analisis
a. Descending adalah salah satu tehnik dimana cairan dibiarkan bergerak menuruni kertas akibat gravitasi.
b. Ascending .Pada tehnik ini pelarut bergerak ke atas dengan gaya kapiler, nilai Rf
harus sama pada descending
c. Teknik yang ketiga dikenal sebagai cara radial atau kromatografi kertas sirkuler. Kondisi-kondisi yang diatas harus diperhatikan untuk memperoleh nilai Rf
yang reproducible, temperature harus dikendalikan dalam variasi tidak boleh lebih dari 0,5oC, kertas harus didiamkan dahulu paling tidak 24 jam dengan atmosfer pelarutnya, agar mencapai kesetimbangan sebelum pengaliran pelarutnya pada kertas, dilakukan beberapa pengerjaan yang parallel, Rf nya tidak boleh berbeda lebih dari ± 0.02.
Suatu atomiser umumnya digunakan sebagai reagent penyemprot bila batas permukaan pelarut dan zat terlarut dalam kertas ingin dibuat dapat dilihat, atomiser yang harus lebih disukai. Gas-gas juga dapat digunakan sebagai penanda bercak, untuk karbonhidrat notasi RG yang digunakan untuk menggantikan Rf. setelah penandaan
beracak atau batas permukaan, selanjutnya dapat digunakan anlisis kalorimetri atau spektroskopi reflektansi bila sampel berupa logam.materi yang di dalam kertas dapat ditentukan secara langsung dengan pelarutan kromatografi kertas, selain untuk
pemisahan dan analisis kuantitatif juga sangat bermamfaat untuk identifikasi. Hal ini dapat dilakukan misalnya membuat grafik antara RM α terhadap jumlah kation dalam
suatu deretan homolog, maka kemungkinan untuk mengidentifikasi suatu anggota deret homolog.
b. Kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapisan tipis adalah (TLC) merupakan teknik pemisahan yang menggunakan lembaran tipis aluminium oksida, gel silika, selulosa atau suatu bahan lain yang didukung oleh suatu lembaran logam atau suatu polimer. Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi, Rf :
Rf =
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 𝑡𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡
Jarak yang telah ditempuh pelarut dapat diukur dengan mudah dan jarak tempuh cuplikan diukur pada pusat bercak itu, atau pada titik kerapatan maksiumum. Definisi koefisien distribusi K adalah perbandingan dingin kadar senyawa terlarut dalam fasa gerak CM dan kadar senyawa terlarut dalam fasa diam Cs,
M
S C K= C
Ada hubungan sederhana antara harga K dan Rf. Jarak tempuh rata-rata
molekul terlarut berbanding langsung dengan kecepatan alir pelarut dikalikan dengan fraksi waktu senyawa terlarut terdapat dalam fasa gerak. Kemudian dapat dinyatakan sebagai jumlah molekul dalam setiap fasa, atau sebagai distribusi senyawa terlarut dalam dua fasa :
Rf = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑚𝑜𝑙 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 𝑡𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑓𝑎𝑠𝑎 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘 𝑀𝑜𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 𝑡𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑑𝑢𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑎 M M M M S S C A C A C A = +
Dimana AM dan AS, adalah luas penampang melihat dua fasa itu (tegak lurus lempeng).
Penjabaran lebih lanjut persamaan di atas, diperoleh
M M f M S S M M S A A R A A C C A KA = = + +
Luas penampang melintang sukar diukur, oleh karena itu persamaan di atas kurang praktis, tetapi dapat menunjukan bahwa harga Rf adalah bentuk modifikasi dari tetapan
keseimbangan. Karnanya harga Rf dapat diharapkan tergantung pada parameter sama
beberapa pengaruh, seperti macam penyerapan, ketebalan, metode arah pengembangan, kadar dan jumlah cuplikan, dan juga jarak yang ditempuh bercak. Dengan seperti diatas, lebih mudah dan lebih tepat menggunakan harga Rf relatif atau Rstandar, dimana
suatu senyawa standar ditambahkan pada cuplikan. Harga Rstd adalah angka banding
jarak tempuh dua bercak itu dalam waktu pengembangan yang sama.
Fasa diam
Pada semua prosedur kromatografi, kondisi optimum untuk suatu pemisahan merupakan hasil kecocokan antara fasa diam dan fasa gerak. Pada umumnya sebagai fasa diam digunakan silika gel. Fasa diam dapat dikelompokkan berdasarkan beberapa hal, misalnya berdasarkan sifat kimianya, dapat dikelompokkan dalam senyawa organik dan anorganik. Jika dilihat mekanisme pemisahan, fasa diam dikelompokkan :
a. Kromatografi serapan (Silika gel, alumina, keiselguhr) b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika gel)
c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina penukar ion) d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel)
Ada bebrapa fasa diam yang sukar dikelompokkan, misalnya poliamida, plimer organik berpori seperti porapak.
• Silika gel merupakan fasa diam yang paling sering digunakan untuk KLT. Silika gel mempunyai ukuran 10–40 µ. Sedangkan proses serapan terutama bervariasi dari 20-150 Å. Silika gel berpori 80-20-150 dinamakan berpori besar. Luas permukaan silika gel bervariasi dari 300 – 1000 m2/g. Pada kelembapan 45 -75 % dapat mengikat air 7 –
20%.
• Alumina merupakan fasa diam yang paling banyak digunakan setelah silika gel. Alumina untuk KLT bersifat sedikit basa (pH 9), di samping itu juga ada alumina netral (pH 7) dan alumina asam (pH 4). Dalam banyak hal digunkaan CaSO4 sebagai
pengikat.
• Keiselguhr merupakan penyerap dengan aktivitas rendah. Tidak banyak digunakan dalam KLT. Penggunaan utama sebagai padatan pendukung untuk fasa diam dalam kromatografi partisi.
• Selulosa memiliki panjang serat bervariasi dari 2-20 µ. Serat pendek menyebabkan difusi rendah selama pengembangan dan menghasilkan noda lebih kecil. Pada KLT selulosa digunakan untuk pemisahan senyawa hidrofil
Jika sebagai fasa gerak digunakan sistem pelarut campuran, pada lapisan fasa diam susunan pelarut itu dapat mengalami perubahan sedikit demi sedikit. Hal ini akan menghasilkan kedpat-ulangan agak jelek. Oleh karenanya sistem dua pelarut lebih disenangi. Air Formamida Metanol Asam asetat Etanol Isopropanol Aseton n-Propanol tert-Butanol Fenol n-Butanol n-Amil alkohol Etil asetat Eter n-Butil asetat Kloroform Benzena Toluena Sikloheksana Eter protelium Proteleum Minyak parafin
Penyusunan sistem pelarut dapat dipilih sesuai dengan kemampuannya membentuk ikatan hidrogen dalam satu seri dari hidrofil sampai ke hidrofob. Kombinasi pelarut yang mempunyai sifat berbeda memungkinkan didapatkannya sistem pelarut yang cocok.
Pada sistem partisi air sebagai fasa diam, terikat oleh pendukung, dan fasa geraknya digunakan yang tidak bercampur dengan air. Sistem ini biasanya dibuat dengan mencampur air dengan pelarut organik dalam corong pisah. Setelah kedua fasa itu terpisah keduanya digunakan untuk penjenuhan bejana pengembangan dan fasa organik bertindak sebagai fasa gerak.
Metodologi
a. Pembuatan lempeng
Ukuran lempeng gelas yang biasa digunakan 20 x 20, 20 x 10 dan 20 x 5 cm. Sebelum dilapisi lempeng kaca ini dibersihkan dengan air dan deterjen, kemudian dikeringkan. Cuci lagi dengan aseton dan permukaan kaca yang bersih jangan samapi tersentuh.
30 gram silika gel atau penyerap lain dibuat bubur dengan sejumlah air atau pelarut lain, dan segera dipindahkan dalam alat perata. Ratakan bubur itu untuk 4-5
lempeng (20x20 cm) dalam waktu 4 menit jika digunakan bahwa pengikat dalam bubur penyerap itu dapat juga ditambahkan dapar untuk membuat keasaamn tertentu atau kandungan air pada lapisan fasa diam. Pindahkan lempeng itu dengan hati-hati pada rak dan setelah 30 menit keringkan pada 100-120o selama 1 jam untuk mengaktifkan fasa diam. Dinginkan dan simpan lempeng itu dalam desikator. Tebal lapisan fasa diam biasanya 0,25 mm, sedangkan untuk pemisahan preparatif digunakan tebal 0,5-2,0 mm.
Perbandingan bahan dan pelarut untuk pembuatan lempeng
Nama Perbandingan bahan dan air
Silika gel
Silika gel G atau GF Alumina Alumina oksida G Serbuk selulosa MN 300 Serbuk selulosa MN 300G Keiselguhr G Serbuk poliamida 1 : 1,5 1 : 2 1 : 1,1 1 : 2 1 : 5 1 : 6 1 : 2 1 : 9 b. Penotolan cuplikan
Pada lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20 cm, 10 x 20 cm, 5 x 20 cm, tebal 0,2 mm) cuplikan biasanya di totolkan sebagai bercak bulat atau garis, 1,5-2,0ncm dari tepi bawah. Bercak sebaiknya berukuran sama dan mempunyai diameter 3-6 mm.
Pentotolan dapat dilakukan dengan mikropipet atau dengan “microsyringe”, biasanya diperlukan 1-20 ul. Volume lebih besar dari itu dapat ditotolkan terhadap dalam bagian-bagian kecil dengan pengeringan di antara penotolan itu. Kelebihan beban menyebabkan bercak asimetri dan peruabahan harga Rf, yang dapat
dihindari jika cuplikan kurang dari 10-20 µg.
Pada lempeng kromatografi lapis tipis efesiensi tinggi (KLTET) (biasanya 10x10 cm atau 10x20 cm) hanya diperlukan dalam nano sampai samapai pikogram setiap bercak. Diameternya tidak harus lebih 1-1,5 mm dan volume cuplikan tidak lebih 0,2 ul. Diperlukan tehnik penotolan khusus, yaitu dengan
syringe 1 µl yang dihubungkan dengan sekrup mikrometer, atau dengan sebuah kapiler platina iridium dalam aplikator otomatis.
c. Pengembangan kromatogram
Kromatogram biasanya dikembangkan dengan tehnik naik linier dengan menggunakan bejana pengembang gelas atau logam. Pada bejana itu diberi kertas saring dan fasa gerak sampai kedalaman 0,5 cm. Supaya kedapat-ulangya baik, jarak antar permukaan fasa gerak dan garis batas harus sama (1-2 cm). Harga Rf
sering tidak sama karena perbedaan kejenuhan.
Pengembangan menurun atau horisontal dapat dapat digunakan dalam beberapa kasus, yaitu pada lapisan tebal atau dengan fasa gerak kental. Fasa gerak dialirkan pada lapisan melalui kertas saring. Pengembangan horisontal biasanya digunakan pada KLTET. Untuk memperbaiki pemisahan dapat dilakukan tehnik
Pengembangan berkelanjutan. Fasa gerak dialirkan pada bagian atas dari lempeng pengembangan horisontal dan dihisap oleh fasa diam. Tehnik ini terutama dilakukan untuk senyawa yang mempunyai harga Rf 0,05-0,2 setelah
pengembangan pertama.
Pengembangan dua dimesi. Cuplikan di totolkan pada lempeng 3-4 cm dari salah satu pojok dan dikembangkan seperti biasanya. Lempeng kemudian diputar 90o sehingga pita pemisahan dari hasil pengembangan pertama terletak pada bagian bawah lempeng, dan kemudian dilakukan pengembangan kedua. Fasa gerak harus diganti sehingga diperoleh pengaruh pemisahan berbeda pada arah kedua. Tehnik ini berguna untuk cuplikan yang mengandung banyak senyawa penyusun.
Pengembangan sirkuler. Pada kromatografi sirkuler fasa gerak dialirkan dengan sebuah sumbu atau pompa melalui pipa kapiler ditengah lapisan fasa diam.senyawa terlarut bergerak cepat dari tengah penotolan menghasilkan lingkaran-lingkaran sempit.
Pengembangan beberapa kali. Fasa gerak biasanya mudah menguap dapat diuapkan setelah pengembangan dan lempeng itu dapat dikembangkan lagi dengan fasa gerak sama atau fasa gerak lain. Tehnik ini dinamakan pengembangan beberapa kali. Bercak cuplikan berbentuk bulat telur dengan aksisi pendek kepada arah fasa gerak bergerak.
Untuk melihat senyawa tak berwarna pada lempeng, biasanya digunakan metode sebagai berikut:
1. Melihat kromatogram dibawah sinar ultraviolet (245 atau 366 nm)
a. Pada lapisan berfluoresensi, misalnya silica gel GF245, bercak muncul
sebagai noda hitam.
b. Untuk senyawa berfluoresensi digunakan lapisan biasa, bercak terlihat berfluoresensi.
2. Menyemprot dengan pereaksi yang menghasilkan warna dan atau berfluoresensi.
Metode yang sering digunakan adalah deteksi asam sulfat. Reaksi ini dapat terbentuk dalam keadaan dingin atau dengan pemanasan lempeng pada 100-200o. Cara ini tidak dapat digunakan pada fasa diam organik atau dimana sebagai pengikat digunakan pati. Pereaksi lain yang banyak digunakan adalah uap yodium.
Data batas deteksi yang tertera dalam buku sering sukar dicapai karena jumlah terkecil suatu senyawa yang masih dapat diamati tergantung pada harga Rf-nya.
e. KLT preparatif
Pemisahan preparatif sering dilakukan pada lapisan yang agak tebal (0,5-2,0 mm). Cuplikan ditotolkan sebagai garis sempit dengan alat yang sesuai. Ukuran maksimum cuplikan tergantung pada jumlah relatif senyawa penyusun, perbedaan Rf-nya dan lebar lempeng. Jika selisih harga Rf lebih besar dari 0,2
dapat ditotolkan 50-100 mg cuplikan pada lempeng 20 cm.
c. Analisis kuantitatif
Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan KLT biasanya dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT (insitu). Alat ini dapat bekerja secara serapan atau fluoresensi. Kebanyakan densitometer mempunyai sumber cahaya, monokromator untuk memilih panjang gelombang yang cocok, sistem untuk memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton dan rekorder.
Pada sistem serapan dapat dilakukan dengan model pantulan atau transmisi. Cairan transmisi dilakukan dengan menyinari bercak dari satu sisi dan mengukur sinar yang diteruskan pada sisi lain. Pada kenyataannya hanya sinar tampak yang dapat digunakan untuk metode ini. Pada cara pantulan, yang diukur sinar pantulan.
Gangguan utama pada sistem serapan adalah fluktuasi latar belakang yang dapat dikurangi dengan beberapa cara , misalkan dengan menggunakan alat berkas ganda, sitem transmisi dan pantulan secara bersamaan atau sistem dua panjang gelombang. Pada cara pantulan dapat digunakan sinar tampak maupun ultraviolet.
Kurva baku dibuat setiap lempeng dan kadar senyawa dihitung seperti pada metode spektofotometri. Ketelitian penetapan termaksud penolakan cuplikan, pengembangan kromatogram dan pengukuran, 2-5 %.
Sistem fluoresensi biasanya lebih disenangi jika senyawa itu dapat dibuat berfluoresensi. Batas deteksi sistem ini lebih rendah dan kelinieran respon dan selektifitasnya lebih tinggi. Gangguan fluktuasi latar belakang juga lebih rendah.
Bercak yang diukur dengan sistem fluoresensi, serapan ultraviolet atau sinar tampak dapat ditetapkan lebih teliti daripada bercak yang disemprot dengan pereaksi warna. Faktor keseragaman pada penyemprotan merupakan hal yang sangat menentukan.
Pengambilan senyawa dari fasa diam biasanya digunakan tabung Craig dengan cara penyarian. Hal ini snagat berguna terutama untuk KLT preparatif karena senyawa yang dipisahkan membentuk suatu pisah dan jumlah serbuk yang agak banyak ini diambil dengan penyedotan.
Cara lain, bercak dikerok dan disinari dengan pelarut polar misalnya etanol. Untuk menghindari kontaminasi minyak dan serabut pada penyaringan fasa diam digunakan penyaring kaca masir. Karena jumlah yang disarig kecil, semua alat harus benar-benar bersih. Kemudian dilanjutkan pengukuran secara spektofotometri. Cara ini memerlukan waktu cukup lama, lagi pula kepekaanya tidak setinggi densitometri.
d. Penggunaan
KLT biasaya merupakan metode pilihan pertama jika seseorang ingin memisahkan suatu campuran. Hal ini disebabkan metode ini sederhana dan cepat. Berikut ini contoh penggunaan KLT pada pemisahan alkaloida kinina, kinidina, sinkonina dan sinkonidina dalam kulit kina.
a. Larutan cuplikan
0,1 gram serbuk kulit kina dibahasi dengan 2 tetes amonia 25 % f dan dikocok dengan 5 ml kloroform selama 10 menit. Saring dan uapkan filtrat samapi kering. Larutan dalam 1,0 ml metanol, totolkan 5 -10 ul larutan ini 2 cm dari tepi bawah. b. fasa diam
Silika gel GF254 atau lempen jadi silika gel F254 20x20 cm.
c. fasa gerak
Ada beberapa sistem fasa gerak yang telah banyak digunakan untuk pemisahan alkalida utama kulit kina
No Sistem fasa gerak
S1 S3 S6 S9 S14 Kloroform-dietilamina (9:1) Kloroform-aseton-dietilamina (5:4:1) Kloroform-etilasetat-isopropanol-dietilamina (20:70:4:6) Minyak tanah-aseton-dietilmina (23:9:9) Toluena-dietil-eter-dietilamina (20:12:5)
Kromatogram dikembangkan dalam bejana kromatografi, pada dinding dalam ditaruh kertas saring. Bejana ini dijenuhi dengan fasa gerak selama 30 menit. Lempeng dielusi dengan jarak 10 cm.
d. Deteksi
Pertama panaskan lempeng KLT pada 100° selama 10 menit untuk menghilangkan amina.
Deteksi alkaloida utama kina
Pereaksi Kepekaan Warna bercak Warna latar belakang Penyinaran pada 254 nm Fluoresensi 366 nm (asam sulfat - metanol) Uap yod
Yod dalam metanol Iodoplatinat 0,1 0,01 0,1 0,1 0,01-0,1 Biru Biru Coklat Coklat Violet, biru - - Kuning Kuning violet e. Analisis kuantitatif
Bercak pada KLT dapat disari dengan kloroform, etanol mutlak, asam klorida 0,1 N, atau asam sulfat 0,1 N, kemudian dilanjutkan pengukuran secara fluorimetri atau spektofotometri. Pada fluorimetri digunakan juga gelombang
eksitasi 350 nm dan emisi diukur pada 450 nm untuk kinidina dan 455 nm untuk kinina dalam asam encer. Pada spektofotometri kinina diukur pada panjang gelombang 332 nm, 324 nm dan 366 nm sedangkan sinkonia pada 316 nm.
Pada fluorimetri dengan desitometer, lempeng KLT disemprot dengan asam sulfat dalam metanol lebih dulu. Untuk kinina panjang gelombang eksitasi 361 nm atau 345 nm dan emisi pada 438 nm dan 430 nm. Panjang gelombang eksitasi kinidina 335 nm atau 365 nm dengan emisi 455 nm atau 430 nm. Sinkinina dan sikkinidina dapat ditetapkan tanpa terganggu kinina dan kinidina jika dieksitasi pada 313 nm dan emisi diukur pada 390 nm. Batas deteksi cair ini 1 ng.
Penetapan densitometri secara serapan dapat juga dilakukan setelah lempeng KLT disemprotkan asam sulfat-etanol. Serapan maksimum kinina dan kinidina pada 330 nm sedangkan sinkonina dan sinkonidina pada 288 nm, dengan batas deteksi 100 ng.
3. Inti Sari
Metode pemisahan suatu senyawa yang didasarkan atas migrasi differensial komponen zat diantara 2 fasa yaitu fasa diam (fasa stasioner) dan fasa gerak (fasa
mobile). Fasa diam dapat berupa cair atau padat, Fasa gerak dapat berupa gas atau cair Fraksi dalam fasa gerak = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑓𝑎𝑠𝑎 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
Kromatografi kertas adalah teknik pemisahan yang menggunakan pita selebar 2-5cm dimana lembaran panjangnya dapat dengan mudah digunting sedangkan kromatografi lapisan tipis adalah (TLC) merupakan teknik pemisahan yang menggunakan lembaran tipis aluminium oksida, gel silika, selulosa atau suatu bahan lain yang didukung oleh suatu lembaran logam atau suatu polimer.
Kromatografi kertas maupun lapisan tipis menggunakan sedikit bahan yang diletakkan pada daerah terbatas didekat ujung selembar kertas saring atau lapis tipis. Suatu pelarut dibiarkan berdifusi dari ujung kertas atau lapis tipis melalui kerja kapiler ; pada kondisi selang beberapa waktu (1-30 jam), campuran akan dijumpai telah berpindah kedaerah penotolan dan telah terpisah sebagian atau seluruhnya menjadi komponen-komponen dengan zona yang yang jelas. Zona –zona dalam bentuk noda-noda atau pita-pita dapat ditentukan letaknya dengan menggunakan reagensia kimia yang sesuai.atau menggunakan pendaran fluor ultra-violet
4. Latihan
1. Jelaskan prinsip dasar yang mendasari semua proses kromatografi 2. Klasifikasikan jenis kromatografi berdasar atas fasa gerak dan fasa diam
5. Evaluasi
1. Ciri khas dari pemisahan dengan kromatografi adalah : a. Fasa gerak bergerak diskontinyu
b. Perbedaan migrasi berbagai senyawa dalam cuplikan
c. Penyebaran sepanjang kolom dari molekul senyawa tertentu
d. Hasil distribusi keseimbangan dari senyawa-senyawa di antara fasa diam dan fasa gerak
e. b, c dan d benar
2. Resolusi dari 2 puncak senyawa dalam suatu kromatografi , a. Berbanding lurus dengan luas puncak
b. Berbanding lurus dengan waktu retensi senyawa pertama c. Berbanding terbalik dengan jumlah luas kedua puncak d. Berbanding terbalik dengan jumlah lempeng teori e. Berbanding lurus dengan panjang kolom
3. Berikut pernyataan yang benar pada kromatografi kertas, kecuali : a. Kertas saring berfungsi sebagai padatan pendukung
b. Yang berperan sebagai fasa diam adalah udara dalam pori-pori kertas c. Ruang kromatografi harus dijenuhkan dengan uap pelarut
d. Menggunakan lembaran tipis aluminium oksida sebagai fasa diam e. Nilai Rf pada teknik descending dan ascending harus sama
4. Berikut pengertian dari factor retensi (Rf).
a. Jarak yang ditempuh senyawa terlarut dibagi jarak yang ditempuh pelarut
b. Jumlah mol senyawa terlarut dalam fasa gerak dibagi mol total senyawa terlarut di dalam dua fasa.
c. Rf adalah bentuk modifikasi dari tetapan keseimbangan d. a , b dan c adalah pernyataan yang benar
5. Pada kromatografi lapis tipis, fasa diam yang paling sering digunakan adalah : a. Silika gel b. Alumina c. Selulosa d. Sephadex e. Keiselguhr
Cocokkanlah jawaban Anda dengan Kunci Jawaban Tes Formatif 2 yang terdapat di bagian akhir modul ini. Hitunglah jawaban yang benar. Kemudian, gunakan rumus berikut untuk mengetahui tingkat penguasaan Anda terhadap materi Kegiatan Belajar 2. Tingkat penguasaan: 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝐽𝑎𝑤𝑎𝑏𝑎𝑛 𝑌𝑛𝑎𝑔 𝐵𝑒𝑛𝑎𝑟
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑆𝑜𝑎𝑙 𝑥 100%
Arti tingkat penguasaan:
90 - 100% = baik sekali 80 - 89% = baik 70 - 79% = cukup < 70% = kurang
