PEMURNIAN PARSIAL LAKASE DARI ISOLAT KAPANG TANDAN KOSONG KELAPA SAWIT DAN UJI AKTIVITASNYA TERHADAP SUBSTRAT ALAM SKRIPSI RADITA YUNIAR ARIZANDY

(1)

PEMURNIAN PARSIAL LAKASE DARI ISOLAT KAPANG

TANDAN KOSONG KELAPA SAWIT

DAN UJI AKTIVITASNYA TERHADAP SUBSTRAT ALAM

SKRIPSI

RADITA YUNIAR ARIZANDY

PROGRAM STUDI S-1 KIMIA DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA 2012

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Skripsi _{Pemurnian Parsial Lakase dari Isolat}

Kapang Tandan Kosong Kelapa Sawit dan Uji Aktivitasnya Terhadap

(2)

PEMURNIAN PARSIAL LAKASE DARI ISOLAT KAPANG

TANDAN KOSONG KELAPA SAWIT

DAN UJI AKTIVITASNYA TERHADAP SUBSTRAT ALAM

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia pada Fakultas Sains dan Teknologi

OLEH

RADITA YUNIAR ARIZANDY NIM: 080810050

Tanggal lulus: 7 Agustus 2012

Disetujui Oleh

Pembimbing I,

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih NIP: 19630515 198701 2 001

Pembimbing II,

Dr. Ni’matuzahroh NIP: 19680105 199203 2 003 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(3)

LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI

Judul : Pemurnian Parsial Lakase Dari Isolat Kapang Tandan Kosong Kelapa Sawit Dan Uji Aktivitasnya Terhadap Substrat Alam

Penyusun : Radita Yuniar Arizandy

NIM : 080810050

Tanggal Ujian : 7 Agustus 2012

Disetujui oleh :

Pembimbing I,

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih NIP: 19630515 198701 2 001

Pembimbing II,

Dr. Ni’matuzahroh NIP: 19680105 199203 2 003

Mengetahui : Ketua Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Airlangga

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA NIP. 19671115 199102 2 001 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(4)

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam lingkungan Universitas Airlangga, diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi kepustakaan, tetapi pengutipan harus seizin penyusun dan harus menyebutkan sumbernya sesuai kebiasaan ilmiah.

Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(5)

i

KATA PENGANTAR

Segala puji syukur kepada Allah SWT atas segala limpahan berkat dan rahmat-Nya sehingga penyusun dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Pemurnian Parsial Lakase dengan Isolat Kapang Tandan Kosong Kelapa Sawit dan Uji Aktivitasnya Terhadap Substrat Alam”. Skripsi ini dibuat sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains dalam bidang kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga.

Dalam kesempatan ini penyusun mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada semua pihak yang memberikan bantuan dan dukungan terutama kepada :

1. Prof.Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I yang selalu memberikan masukan dan meluangkan waktu bagi penulis untuk berkonsultasi.

2. Dr. Ni’matuzahroh selaku dosen pembimbing II yang selalu memberikan masukan dan meluangkan waktu bagi penulis untuk berkonsultasi.

3. Dr. Afaf Baktir M.S selaku dosen wali yang selalu memberikan kelancaran dalam proses penyusunan skripsi.

4. Seluruh dosen Departemen Kimia Universitas Airlangga atas ilmu yang telah diberikan.

5. Orang tua, seluruh keluarga, dan orang terkasih yang telah memberikan dukungan dan motivasi serta kasih sayang selama ini.

6. Teman – teman biokimia, Nadya Aisya’ dan Siska Winda Aryani atas dukungan, motivasi, dan bantuan dalam penyusunan skripsi.

7. Teman-teman angkatan 2008 Departemen Kimia Universitas Airlangga dan semua pihak yang telah membantu penulis.

Dalam penyusunan skripsi ini, penyusun menyadari bahwa masih terdapat banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, oleh karena itu penyusun sangat mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun untuk kesempurnaan penulisan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Surabaya, 28 Juli 2012 Penyusun,

Radita Yuniar Arizandy ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(6)

ii Ucapan terima kasih diberikan kepada:

1. Allah SWT, atas rahmat dan hidayah yang diberikan selama proses

pembuatan skripsi hingga akhir.

2. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si, selaku dosen

pembimbing I yang senantiasa sabar dan meluangkan waktu untuk

berkonsultasi dan membimbing serta memberi masukan bagi penulis .

3. Dr. Ni’matuzahroh, selaku dosen pembimbing II yang senantiasa

sabar dan meluangkan waktu untuk berkonsultasi, membimbing, dan

memotivasi penulis hingga naskah skripsi terselesaikan.

4. Dr. Afaf Baktir M.S, selaku dosen wali yang selalu memberikan

kelancaran dalam proses penyusunan skripsi.

5. Seluruh dosen Departemen Kimia Universitas Airlangga, atas ilmu

yang telah diberikan.

6. Mbak Anita, atas bantuan, saran, dan semangat yang diberikan

kepada penulis ketika penulis dilanda galau skripsi

4. Mama, papa, dan adik, atas doa, dukungan, kasih sayang, motivasi,

dan cinta yang selalu mengalir di saat penulis merasa jenuh. Kalian

merupakan inspirasi dan motivasi utama dalam penyelesaian naskah

skripsi.

5. Keluarga besar H. M. Djamhari, terima kasih atas dukungan dan doa

serta semangat yang selalu diberikan kepada penulis.

6. M. Nasrul Aziz, atas dukungan, doa, saran, motivasi, dan bantuan

yang tidak pernah berhenti kepada penulis sampai naskah skripsi

terselesaikan.

7. Biokimblast, terutama Siska dan Nadya yang selalu kompak dan

saling menghibur saat penulis merasa jenuh dan galau.

8. Luki, Oox, Julie, Aci, Adel, Aya, Bela, yang selalu bisa menjadi

tempat curhat, gosip, dan galau ketika penulis berada di titik jenuh.

Kalian adalah keluarga terindah.

(7)

iii

9. Keluarga besar kimia 2008, atas berbagai bantuan dan informasi yang

dibagikan kepada penulis.

10. Keluarga besar philadevil, pipit, amel, sintia, yuni, mbak tria, mbak

retty, mbak indah, mbak ima, mbak tika atas dukungan dan doa bagi

penulis.

11. Pak damam dan mbak yuli, atas bantuan yang diberikan bagi penulis

dalam proses penyelesaian naskah skripsi.

12. Seluruh pihak yang membantu terselesainya naskah skripsi penulis

yang belum disebutkan satu per satu, terima kasih atas doa, bantuan,

dan dukungan yang telah diberikan.

Terima kasih atas dukungan, doa, motivasi, dan bantuan yang selalu

diberikan kepada penulis hingga naskah skripsi terselesaikan. Tak

henti – hentinya ucapan terima kasih diberikan kepada semua pihak

yang terkait.

Penulis,

Radita Yuniar Arizandy ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(8)

iv

Radita Yuniar Arizandy, 2012, Pemurnian Parsial Lakase dari Isolat Kapang Tandan Kosong Kelapa Sawit dan Uji Aktivitasnya Terhadap Substrat Alam. Skripsi dibawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si dan Dr. Ni’matuzahroh. Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga.

ABSTRAK

Enzim lakase merupakan enzim yang mengkatalis pendegradasi lignin. Degradasi lignin dapat dilakukan secara optimum apabila enzim lakase memiliki aktivitas tinggi. Penelitian terdahulu telah berhasil mengisolasi dan mengkarakterisasi enzim lakase dari kapang A, B, C, dan D. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan uji aktivitas enzim lakase dari kapang A, B, C, dan D, melakukan pemurnian parsial dengan garam ammonium sulfat untuk mengetahui tingkat kemurnian enzim lakase apabila dibandingkan dengan ekstrak kasar, dan mengamati profil permukaan substrat alam akibat perlakuan enzim dengan aktivitas tertinggi dengan menggunakan SEM (Scanning Microscope Electron). Penelitian ini diawali dengan menguji aktivitas enzim lakase dari kapang A, B, C, dan D didapatkan aktivitas sebesar 1,4 U/mL, 1,54 U/mL, 1,33 U/mL, dan 1,26 U/mL. Hasil pemurnian parsial enzim lakase dari masing – masing isolat dengan garam ammonium sulfat melalui proses dialisis untuk penghilangan garam yang terendapkan. Tingkat kemurnian enzim lakase dari kapang A, B, C, dan D masing – masing adalah sebesar 1,547 kali, 1,769 kali, 1,996 kali, dan 3,044 kali dari aktivitas ekstrak kasar. Profil permukaan substrat alam setelah diberi perlakuan enzim menjadi rusak, berongga, dan pecah akibat enzim lakase yang mengkatalis degradasi lignin.

Kata kunci: enzim lakase, lignin, pemurnian parsial, dialisis, Scanning Microscope Elektron

(9)

v

Radita Yuniar Arizandy, 2012, Partial Purification of Laccase from Empty Palm Fruit Bunches Isolate and Determination of Natural Substrates Activity. The Script is Under Guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri P, M.Si and Dr. Ni’matuzahroh, Department Of Chemistry, Faculty of Sciences and Technology. Airlangga University, Surabaya.

ABSTRACT

Laccase is enzyme which catalyze the degradation of lignin. Degradation of lignin can be done optimally when the laccase has high activity. Previous research has succeeded isolated and characterize the laccase of the fungus A, B, C, and D. This study aimed to determine the activity of laccase from fungus A, B, C, and D, also the partial purification with ammonium sulfate salts to determine the purity levels of the laccase when compared with the crude extract, and observe the natural substrate surface profile due the activity of highest enzyme treatment by using SEM (Scanning Electron Microscope). This study begins by examining the activity of the enzyme laccase from fungus A, B, C, and D obtained by the activity of 1.4 U/mL, 1.54 U/mL, 1.33 U/mL, and 1.26 U/mL. The results of partial purification of laccase from each of isolates with ammonium sulfate salt through the dialysis process for removal precipitated salt. The purity level of the laccase from fungus A, B, C, and D respectively are 1.547 times, 1.769 times, 1.996 times and 3.044 times compared to the activity of crude extract. Surface profile of natural substrate that has been treated by enzyme is damaged, hollow, and broken by laccase that catalyze the degradation of lignin.

Keyword: laccase enzyme, lignin, partial purrification, dialisys, Scanning Microscope Electron

(10)

vi

(11)

vii

3.3.2.1.2 Media PDA agar miring ... 27

3.3.2.1.3 Persiapan substrat alam ... 27

3.3.2.2 Media cair... 28

3.3.3 Persiapan tabung selofan ... 28

3.3.4 Peremajaan kapang... 28

3.3.5 Pembuatan larutan ... 29

3.3.5.1 Larutan buffer universal ... 29

3.3.5.2 Pembuatan larutan substrat ABTS ... 30

3.3.5.2.1 Pembuatan larutan asam asetat (CH3COOH) 0,2 M .... 30

3.3.5.2.2 Pembuatan larutan natrium asetat (CH3COONa) 0,2 M ... 30

3.3.5.2.3 Pembuatan buffer sodium asetat pH 4,5 ... 30

3.3.5.2.4 Pembuatan larutan substrat ABTS 0,4 mM... 30

3.6 Produksi Enzim Lakase ... 31

3.7 Uji Aktivitas Enzim Lakase ... 31

3.8 Penentuan Kadar Protein Lakase ... 32

3.9 Pemurnian Enzim Lakase ... 33

3.9.1 Pengendapan enzim lakase dengan amonium sulfat ... 34

3.9.2 Dialisis lakase ... 35

3.10 Hidrolisis Jerami Padi dan Tongkol Jagung dengan Enzim Lakase 35

3.11 Analisis Perubahan Struktur Lignin Jerami Padi dan Tongkol Jagung dengan Menggunakan SEM ... 36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 37

4.1 Peremajaan Isolat Kapang Tandan Kosong Kelapa Sawit ... 37

4.2 Hasil Produksi Enzim Lakase ... 38

4.3 Hasil Uji Aktivitas Enzim Lakase Terhadap Substrat ABTS ... 39

4.4 Hasil Uji Kadar Protein ... 42

4.5 Hasil Pemurnian Enzim Lakase dari Keempat Isolat Tandan Kosong Kelapa Sawit ... 42

4.5.1 Hasil pengendapan enzim lakase dengan amonium sulfat ... 42

4.5.2 Hasil dialisis enzim lakase ... 46

4.6 Analisis Profil Permukaan Jerami Padi dan Tongkol Jagung Dengan Menggunakan SEM ... 49

(12)

viii

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Tabel Halaman 3 Komposisi buffer universal ... 29 4 Pemurnian parsial enzim lakase ... 48

(13)

ix

2.5 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi ... 15

2.6 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi ... 15

2.7 Pengaruh temperatur terhadap laju reaksi ... 16

2.8 Pengaruh pH terhadap laju reaksi ... 17

2.9 Representasi pita sinar-X dari struktur kristal lakase III dari Trametes versicolor (PDB code 1KYA) ... 17

2.10 Lignin, selulase, dan hemiselulase pada jaringan tumbuhan ... 18

2.11 Prekursor penyusun lignin ... 18

2.12 Struktur 3D lignin ... 19

2.13 Struktur lignin ... 19

2.14 Tabel kemurnian protein ... 21

2.15 Proses dialisis ... 23

4.1 Keempat isolat kapang tandan kosong kelapa sawit hasil peremajaan 37 4.2 Reaksi Asam 2,2’-azinobis-di-(3-ethylbenzthiazolinesulphonat) (ABTS) ... 39

4.3 Kurva hubungan perubahan absorbansi radikal kation dengan waktu kapang A ... 40

4.4 Kurva hubungan perubahan absorbansi radikal kation dengan waktu kapang B ... 40

4.5 Kurva hubungan perubahan absorbansi radikal kation dengan waktu kapang C ... 41

4.6 Kurva hubungan perubahan absorbansi radikal kation dengan waktu kapang D ... 41

4.7 Kurva kejenuhan amonium sulfat terhadap aktivitas enzim lakase dari kapang A ... 44

(14)

x

4.8 Kurva kejenuhan amonium sulfat terhadap aktivitas enzim lakase

dari kapang B ... 44

4.9 Kurva kejenuhan amonium sulfat terhadap aktivitas enzim lakase dari kapang C ... 45

4.10 Kurva kejenuhan amonium sulfat terhadap aktivitas enzim lakase dari kapang D ... 45

4.11 Penampang atas jerami padi perbesaran 500x ... 50

4.12 Penampang atas jerami padi perbesaran 1000x ... 51

4.13 Penampang melintang jerami padi perbesaran 2000x ... 52

4.14 Penampang atas tongkol jagung perbesaran 1000x ... 52

4.15 Penampang atas tongkol jagung perbesaran 2000x ... 53

4.16 Penampang melintang tongkol jagung perbesaran 2000x ... 54 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(15)

xi

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Lampiran

1 Gambar hasil penelitian

2 Penentuan aktivitas enzim lakase dengan substrat ABTS 3 Pembuatan kurva standar BSA

4 Penentuan kadar protein enzim

5 Data optimasi kejenuhan pengendapan ammonium sulfat 6 Perhitungan tabel kemurnian

7 Gambar sampel SEM

(16)

1 BAB I PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang Masalah

Lakase merupakan enzim ekstraseluler yang menggunakan senyawa

oksigen untuk menjalankan reaksi oksidasi berbagai senyawa aromatik dan

non-aromatik (Thurston, C.F, 1994). Enzim lakase merupakan enzim yang dapat

mendegradasi lignin pada tumbuhan berserat. Enzim pendegradasi lignin sering

dihasilkan oleh jamur pelapuk putih (white rot fungi). Kemampuan jamur pelapuk

putih dalam mendegradasi lignin disebabkan oleh aktivitas ekstraselular

ligninolitik. Dalam bidang industri, enzim lakase sangat diperlukan peranannya,

seperti pada industri pemutihan pulp dan industri bioetanol. Industri bioetanol ini

memanfaatkan selulosa dan hemiselulosa dalam produksi etanol. Pemanfaatan ini

sering terhambat karena adanya kompleks lignin yang berasosiasi dengan selulosa

dan hemiselulosa, sehingga diperlukan proses delignifikasi agar selulosa dan

hemiselulosa terlepas dari komplek lignin, dan depolimerisasi untuk mendapatkan

gula bebas dan fermentasi gula heksosa dan pentosa untuk mendapatkan produksi

bioetanol (Trisanti, 2009).

Kelapa sawit (Elaeis quineensis Jaco) dari famili Arecaceae merupakan

salah satu sumber minyak nabati, dan merupakan primadona bagi komoditi

perkebunan. Pengembangan perkebunan kelapa sawit di Indonesia berjalan sangat

pesat. Pada tahun 1968, luas areal baru 120.000 ha dan menjadi 5,16 juta ha pada

tahun 2005 dan pada tahun 2006 diproyeksikan mencapai 6,046 juta ha. ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(17)

2

Pengelolaan produksi kelapa sawit yang sebelumnya hanya perkebunan

besar, saat ini telah mencakup perkebunan rakyat (PR) dan perkebunan besar

swasta (PBS). Pada tahun 2005, luas areal PR sekitar 2,202 juta ha (40,44%),

PBN 630.000 ha (11,58%) dan PBS 2,61 juta ha (47,98%). Sumatera

mendominasi ketiga jenis perkebunan, sedangkan Kalimantan dan Sulawesi

menjadi lokasi pengembangan perkebunan swasta dan perkebunan rakyat (Warta

Penelitian, 2007) . Di propinsi Bengkulu, sampai dengan tahun 2005 memiliki

luas tanaman perkebunan rakyat kelapa sawit sebesar 90,898 ha, dengan rincian

yaitu tanaman muda 40,475 ha, tanaman produktif 50,192 ha dan tanaman tua atau

rusak 231 ha (Anonim, 2006). Saat ini, peningkatan perkebunan besar maupun

rakyat semakin bertambah luas. Menurut Dinas Perkebunan Propinsi Bengkulu

(2007) di Propinsi Bengkulu terdapat 11 pabrik pengolahan kelapa sawit dengan

kapasitas produksi 30 – 60 ton/jam sehingga berpotensi menghasilkan limbah

yang dapat dipergunakan sebagai bahan baku pembuatan pulp dan kertas dari

tandan kosong .

Tandan kosong kelapa sawit merupakan limbah yang cukup melimpah

keberadaannya. Komponen utama limbah pada kelapa sawit adalah selulosa,

hemiselulosa dan lignin, sehingga limbah ini disebut sebagai limbah lignoselulosa

(Darnoko, 1993). Beberapa kapang yang tumbuh pada tanaman berkayu

dilaporkan mampu mendegradasi lignin dalam kayu. Kapang – kapang tersebut

terbukti memiliki aktivitas enzim lakase (Arora, D.S et al., 2000).

Indonesia menghasilkan limbah lignoselulosa dari pertanian (tongkol

jagung, kulit pisang dan jerami padi) yang sangat melimpah yaitu sekitar 200 juta

ton per tahun (Berita Resmi Statistik, 2006). Komponen utama lignoselulosa yang ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(18)

3

terdiri atas selulosa, hemiselulosa dan lignin. Dengan tingginya kadar lignin yang

terkandung dalam limbah tersebut, diharapkan keberadaan enzim lakase mampu

mendegradasi kompleks lignin yang terkandung dalam limbah tersebut. Substrat

limbah pertanian yang akan digunakan pada penelitian ini adalah tongkol jagung

dan jerami padi.

Penggunaan enzim untuk proses pengolahan limbah lignoselulosa masih

belum banyak dilakukan. Kebanyakan industri – industri lebih memilih untuk

melakukan pengolahan limbah dengan menggunakan zat kimia yang harganya

jauh lebih murah, namun hasilnya kebanyakan masih kurang memenuhi standar.

Hal ini akan lebih efektif apabila enzim lakase diproduksi untuk mendegradasi

lignin, yang kemudian dapat dimanfaatkan untuk keperluan penting lainnya.

Tingginya harga substrat mempengaruhi produksi enzim lakase. Enzim lakase

dapat diproduksi melalui limbah – limbah yang memiliki serat, limbah – limbah

berkayu, dan juga limbah lignoselulosa lainnya. Substrat dari enzim lakase ini

dapat menggunakan salah satu limbah lignoselulosa yang ada di Indonesia.

Pemanfaatan produk pertanian yang tidak berguna diharapkan dapat menekan

biaya produksi enzim lakase. Diharapkan limbah pertanian di Indonesia dapat

dioptimalkan pemanfaatannya.

Kapang merupakan organisme multiseluler yang dapat hidup melekat pada

substrat yang sesuai. Substrat yang baik, mampu mengembangbiakkan kapang

dalam jumlah yang besar. Jamur basidiomisetes merupakan kelompok utama

pendegradasi lignoselulosa. Walaupun beberapa bakteri diketahui dapat

mendegradasi lignin, tetapi bakteri yang mampu mendegradasi lignin secara

kompleks belum pernah dilaporkan. Jamur pelapuk kayu menghasilkan enzim - ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(19)

4

enzim pendegradasi lignoselulosa seperti golongan selulase, ligninase, dan

hemiselulase. Jamur pelapuk kayu digolongkan ke dalam jamur pelapuk putih dan

jamur pelapuk cokelat, yang masing - masing memiliki metabolisme degradatif

yang berbeda. Jamur pelapuk putih mampu mendegradasi seluruh komponen

material lignoselulosa termasuk lignin, sedang jamur pelapuk cokelat lebih

cenderung mendegradasi bagian selulosa dan hemiselulosa tetapi tidak lignin

(Munir, 2006). Penelitian ini menggunakan tandan kosong kelapa sawit untuk

mengisolasi kapang penghasil enzim lakase berdasarkan penelitian sebelumnya

yang dilakukan oleh Dewi (2010), yang berhasil mengisolasi empat kapang

Aspergillus sp. yang dapat menghasilkan enzim lakase.

Pada penelitian yang dilakukan oleh Dewi (2010) telah berhasil

mengisolasi empat kapang yang belum diketahui spesiesnya pada tandan kosong

kelapa sawit yang dapat menghasilkan enzim lakase. Keempat isolat kapang

tersebut telah dikarakteristik dan uji aktivitasnya. Dapat disimpulkan bahwa

keempat isolat kapang tandan kosong kelapa sawit tersebut memiliki aktivitas

enzim lakase yang hampir sama. Penelitian lanjutan akan dilakukan dengan

tahapan pemekatan dan pemurnian parsial enzim lakase dengan menggunakan

amonium sulfat. Pada proses ini enzim akan beragregat dan mengendap, sehingga

kompleks enzim yang murni akan mengendap bersama garam amonium sulfat,

proses ini dinamakan ‘salting out’. Tahapan selanjutnya adalah melakukan proses

dialisis untuk menghilangkan garam amonium sulfat. Tingkat kemurnian suatu

enzim diketahui dari aktivitas spesifik enzim tersebut, semakin tinggi aktivitas

spesifik suatu enzim maka enzim akan semakin murni. Selain itu juga dapat

diketahui berdasarkan kelipatan pemurnian enzim yang diperoleh. Hal ini dapat ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(20)

5

diketahui dengan cara membagi aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian dengan

aktivitas spesifik awal ekstrak kasar enzim (Minch, 1989).

Pada penelitian yang dilakukan sebelumnya oleh Aminah (2011) tentang

isolasi dan karakterisasi enzim selulase dari kapang Aspergillus sp.(1), disebutkan

bahwa salah satu isolat kapang penghasil enzim selulase memiliki aktivitas

terhadap substrat alam (tongkol jagung dan jerami padi). Namun, aktivitasnya

masih rendah, sehingga dalam penelitian akan digunakan enzim lakase untuk

mendegradasi lignin pada substrat tongkol jagung dan jerami padi yang

merupakan limbah pertanian terbanyak di Indonesia. Diharapkan enzim lakase

dari isolat kapang tandan kosong kelapa sawit mampu mengurangi kandungan

lignin dalam substrat alam, dan memudahkan proses hidrolisis substrat alam oleh

selulase.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah yang telah diuraikan di atas, dapat

dirumuskan suatu masalah penelitian sebagai berikut:

1. Berapakah aktivitas ekstrak kasar enzim lakase dari keempat isolat tandan

kosong kelapa sawit terhadap ABTS?

2. Berapakah tingkat kemurnian enzim lakase dari keempat spesies isolat kapang

tandan kosong kelapa sawit hasil presipitasi garam amonium sulfat apabila

dibandingkan dengan ekstrak kasarnya?

3. Bagaimanakah profil permukaan dari substrat alam yang telah diberi

perlakuan enzim lakase dengan aktivitas tertinggi menggunakan analisis

SEM?

(21)

6

1.3Tujuan Penelitian

1. Menentukan aktivitas ekstrak kasar enzim lakase dari keempat isolat kapang

tandan kosong kelapa sawit penelitian Dewi (2010) terhadap substrat ABTS.

2. Menentukan tingkat kemurnian enzim lakase dari keempat spesies isolat

kapang tandan kosong kelapa sawit hasil presipitasi garam amonium sulfat

apabila dibandingkan dengan ekstrak kasarnya.

3. Mengetahui profil permukaan dari substrat alam (tongkol jagung dan jerami

padi) yang telah diberi perlakuan enzim lakase dengan aktivitas tertinggi

menggunakan analisis SEM.

1.4Manfaat Penelitian

Penelitian ini bermanfaat dalam industri pengolahan limbah tongkol

jagung dan jerami padi serta limbah lignoselulosa yang lain agar dapat digunakan

kembali sebagai bahan baku atau produk lain.

(22)

7 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kapang (Fungi)

Kapang merupakan cendawan eukariotik, bersifat multiseluler, dapat

bereproduksi secara aseksual dan seksual, berbentuk filamen (seperti benang),

merupakan mikroorganisme aerob dan bersifat heterotrof. Kapang dapat

berkembang biak secara aseksual dan seksual. Berkembang biak secara aseksual

dengan cara pembelahan sel, penguncupan, atau pembentukan spora. Sedangkan

berkembangbiak secara seksual dapat dengan cara peleburan nucleus dari dua sel

induknya. Kapang dapat bertahan dengan keadaan alam yang tidak

menguntungkan dengan cara membentuk spora yang berdinding tebal (Pelczardan

Chan, 2005). Kapang tidak dapat melakukan fotosintesis sehingga untuk

memenuhi kebutuhan energinya, kapang memproduksi enzim ekstraseluler

(Wainwright, 1992). Beberapa kapang yang dapat hidup pada bahan yang

mengandung lignoselulosa yang tinggi akan mengeluarkan enzim yang dapat

mendegradasi bahan tersebut sebagai nutrisinya (Herliyana et al., 2008).

2.1.1 White Rot Fungi

Fungi pelapuk putih merupakan kelompok fungi yang memiliki

kemampuan pendegradasi lignin paling tinggi. Degradasi lignin dalam kayu

menyebabkan terbentuknya kantung – kantung yang berwarna putih, sehingga

fungi ini disebut sebagai fungi pelapuk putih. Fungi ini melakukan dekomposisi

lignin sehingga dapat mencapai selulosa dan hemiselulosa (Pérez, 2002). ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(23)

8

Gambar 2.1 Fungi pelapuk putih

2.2 Enzim

Enzim merupakan suatu biokatalis dalam sistem biologi yang bekerja

secara spesifik. Bekerja dengan urut – urutan yang teratur, enzim mengkatalisis

ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi yang meyimpan

dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat makromolekul sel dari

prekursor sederhana (Lehninger, 2007). Fungsi dari enzim adalah meningkatkan

kecepatan reaksi dengan cara menyediakan suatu jalur reaksi yang baru melalui

transisinya. Enzim bekerja untuk menurunkan energi aktivasi, sehingga reaksi

lebih mudah dicapai daripada reaksi tanpa katalis. Enzim dapat mempercepat

reaksi 103 sampai 106 kali lebih cepat dibandingkan tanpa menggunakan katalis.

Reaksi enzimatis hanya bekerja pada pH dan suhu tertentu serta dapat

menunjukkan kekhususan stereoisomerik. Keunggulan enzim sebagai

biokatalisator antara lain daya katalitiknya yang tinggi, spesifitas tinggi, dapat

bekerja pada kondisi suhu da pH yang tidak ekstrim, aktivitas katalitik beberapa ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(24)

9

enzim dapat dikendalikan dan diproduksi, sehingga memudahkan penyediaannya

(Stryer, 2002).

Reaksi katalitik oleh enzim pada umumnya bersifat cepat membentuk

reaksi kesetimbangan tanpa disertai reaksi samping, bekerja dalam larutan encer,

berlangsung pada suhu rendah dan kondisi netral (Ottaway et al., 1984).

Berdasarkan biosintesisnya, ada dua macam enzim yaitu enzim konstitutif

dan enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di dalam

sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan. Sedangkan enzim induktif adalah

enzim yang berada di dalam sel dengan jumlah yang tidak tetap, tergantung pada

keberadaan induser. Jumlah enzim dapat bertambah sampai ribuan kali bahkan

lebih apabila di dalam medium terdapat substrat yang berperan sebagai induser,

terutama apabila substrat penginduksi merupakan satu – satunya sumber karbon

(Stryer, 2002).

2.2.1 Struktur enzim

Struktur enzim terdiri dari struktur primer, sekunder, tersier, dan kuartener.

Struktur primer terdiri dari urutan asam amino dari protein. Urutan, macam, dan

jumlah asam amino yang membentuk rantai polipeptida adalah struktur primer

protein. Struktur sekunder adalah tingkat struktur organisasi pada protein yang

menjelaskan pelipatan rantai polipeptida menjadi motif struktural alfa-helix dan

beta sheet yang disebabkan adanya ikatan hidrogen pada tulang punggung

polipeptida (Kendrew, 1994).

Struktur tersier protein merupakan bentuk yang paling stabil, karena

ditunjang oleh berbagai jenis ikatan yang menstabilkan struktur tersier protein.

Jenis ikatan tersebut antara lain : ikatan hidrogen yang terdapat di antara gugus R ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(25)

10

residu asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion di antara gugus R

yang berlawanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik dan

ikatan kovalen berupa ikatan disulfida dari residu sistein (Ottoway et al., 1984).

Struktur tersier disebabkan oleh interaksi rantai samping polipeptida, membentuk

konformasi tiga dimensi protein secara keseluruhan (Kendrew, 1994).

Struktur kuartener terbentuk karena adanya interaksi beberapa rantai

polipeptida membentuk oligomer. Oligomer berinteraksi kembali melalui ikatan

ionik, ikatan van der waals, dan ikatan hidrofobik (Bodanzky, 1998).

2.2.2 Klasifikasi Enzim

Berdasarkan Nelson dan Michael, 2003, enzim diklasifikasikan menjadi

enam kelas berdasarkan tipe reaksi yang dikatalisnya yaitu sebagai berikut.

1. Oksidoreduktase merupakan golongan enzim yang dapat mengkatalis

pemisahan dan penambahkan elektron atau hidrogen.

2. Transferase merupakan golongan enzim yang mengkatalis pemindahan

gugus senyawa kimia.

3. Hidrolase merupakan golongan enzim yang dapat memutus ikatan kimia

dengan penambahan air.

4. Liase merupakan golongan enzim yang membentuk ikatan rangkap dengan

melepas satu gugus kimia. Golongan enzim ini memutuskan berbagai

ikatan kimia selain melalui hidrolisis dan oksidasi.

5. Isomerase merupakan golongan enzim yang mengkatalis perubahan pada

isomer.

6. Ligase merupakan golongan enzim yang menggabungkan dua molekul

yang disertai dengan hidrolisis ATP.

(26)

11

2.2.3 Kekhususan Enzim

Substrat harus memiliki hubungan tertentu terhadap bentuk dan sifat kimia

sisi aktif enzim agar bisa terjadi suatu ikatan. Enzim bersifat spesifik terhadap

suatu reaksi. Menurut Price dan Lewis (2006), kekhususan enzim terhadap reaksi

dapat bersifat :

1. Kekhususan sterik merupakan kekhususan absolut, dimana golongan enzim

bekerja berdasarkan stereokimia struktur molekul dari substratnya. Dari dua

senyawa yang enansiomer, enzim hanya bereaksi dengan salah satunya.

2. Kekhususan reaksi dimana terdapat dua golongan enzim yang bekerja

berdasarkan substrat-substrat yang memiliki gugus fungsional sejenis yang

bekerja berdasarkan jenis reaksinya yaitu :

1)Kekhususan relatif, apabila suatu enzim bekerja terhadap substrat yang

memiliki gugus fungsional sejenis.

2)Kekhususan absolut, apabila suatu enzim bekerja terhadap satu substrat

saja.

2.2.4 Mekanisme kerja enzim

Mekanisme katalisis enzim merupakan reaksi yang melibatkan gugus

fungsi residu asam amino yang terdapat pada sisi aktif enzim. Sebagai katalis

biologi, enzim mempercepat reaksi dengan cara menciptakan suatu keadaan

transisi terstabilisasi melalui pembentukan kompleks enzim-substrat yang

mempunyai energi aktivasi lebih rendah. Energi aktivasi merupakan energi

tertinggi yang harus dicapai agar suatu reaksi dapat terjadi. Dengan lebih

rendahnya energi aktivasi maka berarti lebih banyak molekul yang dapat

mencapainya sehingga reaksi berjalan lebih cepat. ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(27)

12

Sebelum melakukan fungsi katalitiknya, enzim terlebih dahulu membentuk

ikatan dengan substrat, digambarkan dengan persamaan sebagai berikut :

Gambar 2.2 Reaksi enzimatis

Langkah pertama dalam proses katalisis adalah pembentukan kompleks enzim

substrat. Substrat diikat pada daerah yang dinamakan sisi aktif enzim. Reaksi

kimia yang terjadi dalam kompleks enzim substrat tersebut dapat dilanjutkan

dengan pelepasan produk dan enzim.

Mekanisme katalisis enzim merupakan reaksi-reaksi yang melibatkan

gugus-gugus fungsi dari residu asam amino yang terdapat pada sisi aktif enzim.

Sisi aktif enzim adalah tempat pengikatan substrat yang mengandung residu asam

amino sebagai gugus katalitiknya. Dan secara langsung terlibat dalam pembuatan

serta pemutusan ikatan selama proses katalisis. Ciri – ciri umum sisi aktif enzim

yaitu lokasi sisi aktif enzim merupakan bagian kecil dari keseluruhan molekul

enzim, hanya residu yang ada pada sisi aktif enzim yang terlibat pada proses

katalisis dan melakukan kontak dengan substratnya; Sisi aktif enzim memiliki

struktur tiga dimensi yang dibentuk oleh gugus – gugus asam amino yang

berbeda; Pengikatan substrat dengan enzim dipengaruhi oleh adanya gaya tarik –

menarik yang lemah. Interaksi reversible biomolekul dapat berlangsung karena

adanya ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya van der waals, dan interaksi

hidrofobik; Sisi aktif enzim berbentuk kantung atau celah. Hal ini mempengaruhi

perlindungan terhadap sisi aktif tersebut; Proses pengikatan substrat pada enzim ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(28)

13

membentuk kompleks enzim-substrat merupakan tahap awal berlangsungnya

katalis enzimatik (Puspaningsih, 2004).

Ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat merupakan ikatan yang

lemah, seperti ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya – gaya van der waals,

ataupun interaksi hidrofobik. Interaksi yang terjadi antara molekul enzim dan

substrat melibatkan gugusan reaktif atau gugus pengikat ( binding group ) dari

enzim maupun substrat, dan enzim hanya dapat mengikat substrat yang memiliki

gugusan – gugusan reaktif yang sama. Proses katalitik melibatkan sejumlah

gugusan – gugusan reaktif lain yang disebut gugusan katalitik ( catalytic group ).

Enzim hanya dapat mengikat substrat yang memiliki gugus reaktif yang sama

(Stryer et al., 2002). Model interaksi enzim substrat dibedakan menjadi :

1. Model Lock and Key (lubang dan anak kunci) : dikemukakan oleh Emil

Fischer pada tahun 1890. Dalam model Fischer, tempat katalitik dianggap

terbentuk terlebih dahulu agar sesuai dengan substratnya (Stryer et al., 2002).

Pada model ini, spesifitas pengikatan tergantung pada ketepatan pengaturan

atom-atom pada sisi aktif. Substrat dapat terikat pada enzim bila mempunyai

ukuran atau bentuk yang sesuai dengan sisi aktif enzim (Gambar 2.5). Dapat

disimpulkan bahwa satu enzim hanya dapat berikatan pada satu model substrat

yang memiliki sisi aktif yang sesuai dengan enzim. Meskipun dalam model ini

termasuk dalam model cetakan yang kaku, namun dapat dipakai untuk

memahami sifat – sifat tertentu dari enzim. ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(29)

14

Gambar 2.3 Interaksi substrat dan enzim model Lock and Key (Stryer et al., 2002)

2. Model Induced Fit : dikemukakan oleh Daniel G. Koshland pada tahun 1958.

Koshland mengemukakan bahwa ukuran atau bentuk sisi aktif enzim dapat

mengalami modifikasi oleh adanya pengikatan substrat (Gambar 2.6). Pada

model ini, sisi aktif enzim diasumsikan cocok dengan substratnya sesaat

setelah enzim mengikat substrat. Jadi substrat dianggap mampu menginduksi

perubahan bentuk dalam sisi aktif enzim. Perubahan ini menempatkan residu

asam amino pada sisi aktif enzim yang memungkinkan terjadinya pengikatan

substrat selama proses katalisis. Enzim menunjukkan fleksibilitasnya dalam

berikatan dengan substrat (Stryer et al., 2002).

Gambar 2.4 Interaksi substrat dan enzim model induced fit (Stryer et al., 2002)

2.2.5 Aktivitas enzim

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah : konsentrasi

enzim, konsentrasi substrat, temperatur dan pH. ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(30)

15

2.2.5.1 Konsentrasi enzim

Kecepatan reaksi suatu enzim dipengaruhi oleh konsentrasi enzim.

Banyaknya substrat yang diubah menjadi produk sebanding dengan tinggi

konsentrasi enzim yang digunakan (Gambar 2.5). Semakin tinggi konsentrasi

enzim maka laju reaksi berjalan lebih cepat selama konsentrasi enzim jauh lebih

sedikit dibanding substrat (Stryer et al., 2002).

Gambar 2.5 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi

2.2.5.2 Konsentrasi substrat

Apabila konsentrasi substrat semakin tinggi maka laju reaksi akan semakin

cepat. Namun bila konsentrasi diperbesar lagi maka tidak terjadi penambahan laju

reaksi. (Gambar 2.6). Hal tersebut disebabkan karena enzim telah jenuh dengan

substrat. Pada konsentrasi substrat yang menghasilkan laju reaksi maksimal,

penambahan konsentrasi substrat lebih lanjut tidak akan merubah laju reaksi

(Stryer et al., 2002).

Gambar 2.6 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi

Laj

u reaksi

Konsentrasi substrat

Laju

reaks

i

Konsentrasi enzim ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(31)

16

2.2.5.3 Pengaruh temperatur

Semakin tinggi temperatur maka laju reaksi berjalan makin cepat. Hal

tersebut disebabkan karena atom – atom yang terdapat dalam molekul enzim

memiliki energi yang tinggi, sehingga energi pengaktifan akan tercapai. Akan

tetapi apabila temperatur dinaikkan lebih tinggi maka laju reaksi akan menurun,

dapat dilihat gambar 2.7. Hal tersebut dikarenakan enzim mengalami denaturasi

sehingga enzim kehilangan aktivitasnya (Stryer et al., 2002).

Gambar 2.7 Pengaruh temperatur terhadap laju reaksi

2.2.5.4 Pengaruh pH

Enzim memiliki muatan positif atau negatif pada suatu pH tertentu. Hal ini

dikarenakan enzim dapat bersifat basa, netral, atau asam tergantung rantai

samping susunan proteinnya. Pada pH tertentu enzim dapat beraktivitas

maksimum (pH optimum). pH optimum tergantung pada masing-masing enzim

karena setiap enzim memiliki pH optimum yang spesifik yang bergantung pada

konsentrasi substrat. Apabila pH semakin jauh dari titik pH optimum maka laju

reaksi dari enzim akan rendah. Pada gambar ditunjukkan kurva pH optimum

(Gambar 2.8) (Stryer et al., 2002).

Temperatur

Laj

u

reaksi

(32)

17

Gambar 2.8 Pengaruh pH terhadap laju reaksi

2.3 Enzim Lakase

Lakase adalah sekelompok enzim yang dihasilkan oleh jamur pelapuk

putih (white rot fungi) secara ekstraseluler (Schmidt, 2006). Nama lakase berasal

dari fakta bahwa ekstrak pertama yang mampu untuk mengoksidasi fenol dengan

oksigen atmosfir, diisolasi dari Rhus vernicifera, suatu pohon yang berasal dari

Jepang yang menghasilkan lak (Paolo, 1992). Salah satu substrat dari enzim

lakase adalah ABTS (asam 2,2’-azinobis-2-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonat) dapat

berperan sebagai mediator yang memungkinkan oksidasi komponen non fenolik

yang tidak dapat dioksidasi oleh lakase sendiri (Wells A, et al., 2006). Enzim

lakase mampu mendegradasi lignin pada tumbuhan. Enzim pendegradasi lignin

(lignolitik) terdiri dari lakase (polifenol oksidase), lignin peroksidase (Li-P) dan

mangan peroksidase (Mn-P). Ketiganya merupakan multi enzim ekstraseluler

yang berperan dalam proses depolimerisasi lignin (Anindyawati, 2009).

Gambar 2.9 Representasi pita sinar-X dari struktur kristal lakase III dari Trametes versicolor (PDB code 1KYA) (Oxford, 2007).

pH

Laj

u reaksi

(33)

18

2.4 Lignin

Lignin merupakan bahan penguat yang terdapat bersama – sama selulosa

di dinding sel tumbuhan (Robinson, 1995). Lignin membentuk matriks yang

mengelilingi selulosa dan hemiselulosa, penyedia kekuatan pohon dan pelindung

dari biodegradasi (Fadillah, dkk, 2008).

Gambar 2.10 Lignin, selulase, dan hemiselulase pada jaringan tumbuhan

Lignin tergolong dalam bagian utama dari dinding sel tanaman yang

merupakan polimer terbanyak setelah selulosa. Secara kimia, lignin sebenarnya

merupakan polimer yang mengandung satuan sejenis koniferil alkohol. Karena

struktur kimianya kompleks, lignin sangat sulit didegradasi dan hanya beberapa

jenis mikrobia tertentu saja yang mampu mendegradasi senyawa ini (Erni, et al,

2003).

Ketiga prekursor penyusun lignin adalah conyferyl alcohol, p-coumaryl

alcohol, dan synapyl alcohol (Pearl,1967) :

Gambar 2.11 Prekursor penyusun lignin 1) p-coumaryl alcohol, 2) conyferyl alcohol, 3) synapyl alcohol

(34)

19

Gambar 2.12 Struktur 3D lignin

Gambar 2.13 Struktur lignin

2.5 Substrat Alam

Keberadaan lignin dalam limbah lignoselulosa seringkali menjadi

penghambat pemanfaatan limbah lignoselulosa, terutama limbah pertanian.

Tongkol jagung dan jerami padi merupakan limbah pertanian yang sangat ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(35)

20

melimpah keberadaannya. Limbah – limbah tersebut memiliki komposisi antara

lain:

1) Komposisi serat tongkol jagung adalah 23,74% lignin, 65,96% selulosa,

dan 10,82% hemiselulosa (Meryandini et al., 2009).

2) Menurut Davendra (1982) dalam Meryandini et al., (2009), jerami padi

terdiri atas 33% selulosa, 26% hemiselulosa, 7% lignin serta 13% silika.

2.6 Pemurnian Enzim

Pemurnian enzim dilakukan untuk mendapatkan suatu enzim yang bebas

dari pengotor. Tujuan dari pemurnian enzim ini adalah untuk memisahkan dan

memurnikan enzim secara parsial enzim lakase dari protein – protein lain yang

terdapat dalam ekstrak kasar enzim. Tahap – tahap pemurnian enzim tergantung

dari tujuan akhir, apakah untuk tujuan komersial atau tujuan riset (Harris et al.,

1989). Enzim yang dimurnikan secara parsial masih dapat digunakan untuk tujuan

komersial, sedang enzim murni atau hampir murni dikehendaki untuk tujuan riset

atau dalam produk analitik.

Langkah awal dalam pemurnian enzim adalah preparasi ekstrak kasar yang

mengandung protein menjadi bentuk yang dapat dilarutkan. Teknik isolasi protein

tersebut tergantung dari lokasi protein yang akan diisolasi, yaitu protein

intraseluler atau protein ekstraseluler. Tahapan isolasi protein intraseluler diawali

dengan mencuci jaringan atau sel dengan buffer salin yang bertujuan untuk

menghilangkan pengotor atau bahan ekstraseluler. Selanjutnya dilakukan lisis sel

untuk memecah atau membuka sel menggunakan mortar atau pestle, homogenizer,

sonicator, tissue grinder, cell disruptor, blender hingga menghasilkan homogenat.

Kemudian, sentrifugasi homogenat tersebut sampai membentuk supernatan dan ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(36)

21

pelet sel. Supernatan merupakan ekstrak kasar yang mengandung protein yang

diinginkan, sedangkan pelet sel mengandung protein membran. Jika protein yang

diinginkan berasosiasi dengan membran, maka isolasi protein dilakukan dengan

mengisolasi organel dan ditangani dengan deterjen atau didisrupsi (Harris et al.,

1989). Untuk tahapan isolasi protein ekstraseluler dilakukan dengan cara

sentrifugasi cairan sel atau medium kultur menghasilkan supernatan dan pelet sel.

Supernatan merupakan ekstrak kasar, sedangkan pelet sel mengandung sel dan

komponen non protein. Pemurnian enzim dilakukan berdasarkan sifat kelarutan,

ukuran, dan muatan afinitas pengikatan spesifik dari enzim itu sendiri. Tabel

kemurnian enzim terdapat pada gambar 2.14.

Gambar 2.14 Tabel kemurnian protein (Scopes, 1994)

2.6.1 Pemekatan enzim

Menurut Harris et al., 1989, pemekatan enzim merupakan tahap awal dari

prosedur pemurnian enzim sebelum tahap pemurnian berikutnya atau dapat pula

digunakan untuk keperluan analisis enzim. Ada dua tahap pemekatan enzim, yaitu

dengan menggunakan metode analitik dan metode preparatif. Untuk metode

preparatif dilakukan dengan metode fraksinasi garam, fraksinasi pelarut organik, ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(37)

22

fraksinasi dengan menggunakan polimer organik, ultrafiltrasi, liofilisasi, dan

dialisis (Bollag dan Edelstein, 1991). Metode fraksinasi enzim yang biasa

dilakukan yaitu fraksinasi garam ammonium sulfat dan pelarut organik aseton.

Untuk metode analitik, menggunakan fraksinasi asam (asam trikloroasetat),

fraksinasi organik (aseton atau etanol), dan imunopresipitasi yang dapat

menyebabkan denaturasi protein. Dalam metode ini aktivitas enzim tidak menjadi

prioritas.

Prinsip dari fraksinasi garam berdasarkan pada kelarutan protein yang

berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan

daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein pada pH dan

suhu tertentu berpengaruh pada meningkatnya kenaikan konsentrasi garam

(salting in). Kenaikan kelarutan protein menyebabkan meningkatnya kekuatan ion

larutan. Pada penambahan garam pada konsentrasi tertentu menyebabkan

kelarutan protein akan menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan

garam – garam semakin banyak menyebabkan penarikan selubung air yang

mengelilingi permukaan protein. Peristiwa yang seperti ini akan mengakibatkan

protein akan saling berinteraksi, beragregasi, dan mengendap (Harris et al., 1989),

(Scopes, 1994). Ammonium sulfat merupakan garam yang paling sering

digunakan untuk mengendapkan protein karena memiliki kelarutan yang tinggi

dalam air, relatif tidak mahal, dan dapat mempertahankan kestabilan protein di

dalam larutan amonium sulfat (2M-3M) selama bertahun – tahun (Scopes, 1994).

Tahap pemekatan enzim selanjutnya adalah dialisis. Garam berlebih yang

terdapat dalam larutan enzim yang telah difraksinasi dengan ammonium sulfat

dapat dihilangkan dengan cara dialisis, diafiltrasi, dan filtrasi gel. Dalam tahap ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(38)

23

dialisis, protein ditempatkan dalam sebuah tabung selofan (membran

semipermeabel) yang ujung – ujungnya diikat. Kemudian tabung tersebut

direndam dengan larutan buffer tertentu. Molekul yang berukuran kecil akan

keluar dari membran, sedang molekul yang memiliki ukuran lebih besar akan

tertahan di dalam tabung selofan. Larutan buffer yang digunakan untuk merendam

tabung selofan diganti setiap kali larutan buffer akan jenuh, agar proses dialisis

berjalan dengan baik.

Gambar 2.15 Proses dialisis ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(39)

24 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia, Fakultas Sains dan

Teknologi Universitas Airlangga dan Laboratorium Sentral, Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Malang. Penelitian dimulai dari

bulan Februari 2012 sampai dengan Juli 2012.

3.2 Sampel, Bahan, dan Alat Penelitian

3.2.1 Sampel penelitian

Sampel yang digunakan adalah keempat isolat kapang dari tandan kosong

kelapa sawit yang menjadi koleksi Laboratorium Biokimia, Departemen Kimia,

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga.

3.2.2 Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kentang, agar – agar,

dextrose, pewarna non-phenol ABTS (Asam

2,2’azinobisdi-3-ethylbenzthiazolinesulphonat), Asam Asetat Glacial, Yeast Extract, Malt Extract,

Asam Sitrat, Natrium Fosfat Dibasis, Kalium Hidroksida, Kalsium Fosfat,

Natrium Asetat, Ammonium sulfat, Etanol 96%, Larutan Asam Fosfat 85%, dan

akuades.

(40)

25

3.2.3 Alat penelitian

Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu Erlenmeyer

100 dan 250 mL, pipet mikro, autoklaf (Ogawa Seiki, CO, LTD. Osk 6508),

sentrifuge dingin (Beckman model TJ-R), shaker incubator (Heidolph Unimax

1010, Inkubator 1000), waterbath (Sanyo Rikogakukikai), oven (Isotemp* oven

model 655F), freezer, lemari es (Sharp matric), spektrofotometer UV-VIS

(Shimadzu UV-1700), timbangan analitik (OHAUS), laminar air flow cabinet

(Kottermann), pH meter (Metrohm 744), tabung Eppendorf, tabung selofan, SEM

(Scanning Electron Microscopy) (FEL tipe Inspect-S50) milik laboratorium

bersama Fakultas MIPA Universitas Negeri Malang, dan alat – alat gelas yang

biasa digunakan di laboratorium.

(41)

26

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Diagram alir penelitian

Peremajaan Keempat Spesies Kapang TKKS (Tandan Kosong Kelapa Sawit)

Produksi Enzim Lakase dari Keempat Spesies Isolat Kapang TKKS

Uji Aktivitas Spesifik Keempat Enzim Lakase dengan ABTS

Pemurnian Parsial Enzim Lakase dengan Variasi Kejenuhan

Amonium Sulfat

Penentuan Tingkat Kemurnian Keempat Enzim Lakase

Uji Aktivitas Spesifik Keempat Enzim Lakase yang Telah Dipekatkan dengan

Amonium Sulfat terhadap ABTS

Menentukan Kadar Protein dengan Metode Bradford

Uji Aktivitas Enzim Lakase Terpilih dengan Substrat Alam

(Tongkol Jagung dan Jerami Padi) dengan Analisis SEM Menentukan Enzim Lakase yang

Memiliki Aktivitas Tertinggi

(42)

27

3.3.2 Pembuatan media

3.3.2.1 Media padat

3.3.2.1.1 Media PDA

Kentang 20 g dikupas, dibersihkan kemudian diiris tipis. Irisan kentang

tersebut direbus dalam 80 mL aquades sampai kentang menjadi lunak. Air rebusan

kentang disaring dalam gelas Beaker sehingga diperoleh suspensi bening

kemudian endapannya dibuang. Suspensi bening dipindahkan dalam tabung

Erlenmeyer 250 mL dan ditambahkan akuades hingga volume akhir 100 mL,

kemudian ditambahkan dextrose dan agar batangan masing-masing 1,5 g.

Campuran bahan dipanaskan di atas kompor listrik hingga semua bahan terlarut

sempurna. Setelah bahan larut sempurna, tabung Erlenmeyer ditutup rapat dengan

kapas selanjutnya dilapisi dengan aluminium foil. Media disterilkan dengan

autoclave pada tekanan 1 atm, temperatur 121o_{C selama 15-20 menit.}

3.3.2.1.2 Media PDA agar miring

Potato Dextrose Agar (PDA) dituang ke dalam tabung reaksi masing –

masing 6 mL. Kemudian mulut tabung ditutup dengan kapas dan dilapisi

aluminium foil. Tabung reaksi berisi PDA disterilkan dalam autoclave suhu

121°C selama 20 menit. Setelah steril dimiringkan dan ditunggu sampai memadat.

3.3.2.1.3 Persiapan substrat alam

Jerami padi dan tongkol jagung dikeringkan terlebih dahulu pada

temperatur 70 oC dalam oven hingga beratnya konstan. Masing-masing substrat ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(43)

28

dipotong – potong ± 1 cm untuk analisis SEM. Substrat disterilisasi dengan

autoclave untuk menghindari kontaminasi.

3.3.2.2 Media cair

Media cair yang digunakan adalah media GMY (Glucose Malt Yeast).

Media cair ini berfungsi sebagai media pertumbuhan. Komposisi dari media GMY

adalah 4 gr Glukosa, 4 gr Yeast Extract, dan 10 gr Malt Extract. Campuran

dilarutkan dalam akuades, kemudian diatur hingga pH mencapai 7,2 dengan

KOH 0,2 N. Selanjutnya, ditambah akuades sampai volume nya 1000 mL. Media

ini disterilkan dalam autoclave suhu 121°C selama 20 menit.

3.3.3 Persiapan tabung selofan

Menyiapkan tabung selofan yang akan didialisis. Tabung selofan yang

telah disiapkan dididihkan selama 30 menit dalam larutan EDTA (dalam suasana

basa), kemudian dibilas dengan akuades. Salah satu ujung dari selofan diikat

sehingga enzim dapat dimasukkan untuk proses dialisis

3.3.4 Peremajaan kapang

Media padat yang telah disterilkan digunakan untuk meremajakan kapang.

Proses peremajaan kapang dilakukan secara aseptik di laminar air flow cabinet.

Dalam ruang laminar air flow, disiapkan bunsen, isolat kapang terdahulu, ose, dan

alkohol. Dalam media PDA agar miring yang baru digoreskan 1 ose isolat kapang

setelah itu ditutup dengan kapas yang telah disterilkan kemudian dilapisi

aluminium foil dan diinkubasi pada temperatur 37oC selama 5 hari. ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(44)

29

3.3.5 Pembuatan larutan

3.3.5.1 Larutan buffer universal

Larutan stok A, asam sitrat (C6H8O7) 0,1 M dibuat dengan cara

menimbang 1,921 gram asam sitrat lalu dilarutkan dalam aquades dan diencerkan

dalam labu ukur 100 mL hingga tanda batas. Larutan stok B, natrium fosfat

dibasis (Na2HPO4.7H2O) 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 5,365 gram lalu

dilarutkan dalam aquades dan diencerkan dalam labu ukur 100 mL hingga tanda

batas. Larutan buffer universal pH 3-8 dibuat dengan cara mencampurkan larutan

A dan B dengan komposisi larutan yang sesuai kemudian diencerkan dalam

aquades sampai volume campuran tepat 100 mL.

A (mL) B (mL) pH

79,45 20,55 3

61,45 38,55 4

48,50 51,50 5

36,85 63,15 6

17,65 82,35 7

2,75 97,25 8

Tabel 1. Komposisi buffer universal ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(45)

30

3.3.5.2 Pembuatan larutan substrat ABTS

3.3.5.2.1 Pembuatan larutan asam asetat (CH3COOH) 0,2 M

Larutan Asam Asetat 0,2 M dibuat dengan cara mengencerkan asam asetat

glasial 17,487437 M. Sebanyak 1,14 mL asam asetat glasial dimasukkan ke dalam

labu ukur 100 mL kemudian diencerkan dengan akuades sampai tanda batas dan

dikocok sampai homogen.

3.3.5.2.2 Pembuatan larutan natrium asetat (CH3COONa) 0.2 M

Larutan natrium asetat 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 1,6406 gr

natrium asetat. Natrium asetat tersebut dilarutkan dalam akuades dengan

menggunakan beaker glass, lalu dipindahkan ke dalam labu ukur 10 mL, dan

diencerkan dengan akuades sampai tanda batas dan dikocok sampai homogen.

3.3.5.2.3 Pembuatan buffer sodium asetat pH 4,5

Larutan buffer sodium Asetat pH 4,5 dibuat dengan mencampurkan

larutan asam asetat dan natrium asetat. Sebanyak 30,5 mL larutan asam asetat

0,2 M 19,5 mL larutan natrium asetat 0,2 M dimasukkan dalam labu ukur 100 mL

kemudian ditambahkan akuades sampai tanda batas dan dikocok sampai

homogen. Larutan tersebut diukur pHnya sampai menunjukkan pH 4,5.

3.3.5.2.4 Pembuatan larutan substrat ABTS 0,4 mM

Larutan substrat ABTS dibuat dengan cara menimbang 0,011 gr ABTS.

ABTS tersebut dilarutkan dalam buffer sodium asetat pH 4,5 dengan

menggunakan akuades. Selanjutnya larutan tersebut dipindah ke dalam labu ukur ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(46)

31

50 mL secara kuantitatif. Larutan diencerkan dengan buffer sodium asetat sampai

tanda batas dan dikocok sampai homogen.

3.6 Produksi Enzim Lakase

Kapang yang telah tumbuh di media PDA, dibuat inokulum dengan cara

melarutkan konidia atau spora dengan akuades steril. Inokulum ini dimasukkan

sebanyak 200µL ke dalam media cair GMY yang diberi penambahan larutan

CuSO4 0,05 mM. Media GMY yang mengandung inokulum ini diinkubasi selama

waktu terbaik pada masing – masing kapang pada suhu ruang dan digojog dengan

kecepatan 150 rpm. Pada waktu terbaik masing – masing kapang, media GMY

yang telah diinkubasi dan digojog, disentrifugasi dengan kecepatan 3300 rpm, 4°C

selama 2 menit. Supernatan yang terbentuk pada media setelah disentrifugasi

inilah yang disebut enzim lakase.

3.7 Uji Aktivitas Enzim Lakase

Uji aktivitas enzim lakase dilakukan berdasarkan metode Bourbonnais dan

Paice (1990). Prinsip uji ini adalah sebagai berikut : pewarna non-phenol Asam

2,2’-azinobis-di-(3-ethylbenzthiazolinesulphonate) (ABTS), dioksidasi oleh

lakase menjadi radikal kation (ABTS) yang lebih stabil. Konsentrasi radikal

kation yang berwarna biru kehijauan (dibaca pada panjang gelombang 420 nm)

berkolerasi dengan aktivitas lakase.

Pengukuran aktivitas lakase dilakukan dengan menggunakan kondisi

optimum hasil penelitian Dewi (2010). Pengukuran tersebut dilakukan dengan

cara sebagai berikut : Larutan 0,4 mM ABTS dalam buffer natrium asetat (pH 4,5)

sebanyak 1160 µL dimasukkan ke dalam kuvet 1,5 mL, kemudian ditambahkan ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(47)

32

40 µL enzim dan dikocok agar tercampur homogen. Kemudian absorbansi radikal

kation diamati pada panjang gelombang 420 nm (

ε

mM = 36 mM-1 _cm-1_{) selama}

lima menit menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Perubahan absorbansi

radikal kation ini diamati setiap menit. Aktivitas lakase dinyatakan sebagai

International Unit (IU) per liter, dengan 1 IU didefinisikan sebagai jumLah enzim

yang dapat mengoksidasi 1 µmol ABTS tiap menit. Aktivitas lakase ditentukan

dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:

Dengan :

V = volume total reaksi (mL)

v = volume enzim (mL)

ε

=

extinction coefficient ABTS pada 420 nm = 36 mM-1 cm-1

d = Light path of cuvette (cm)

∆A.min-1 _{= perubahan absorbansi tiap menit pada 420 nm}

3.8 Penentuan Kadar Protein Lakase

Metode yang digunakan dalam menentukan kadar protein pada penelitian

ini adalah metode Bradford (1976) dengan menggunakan standar Bovine Serum

Albumin (BSA). Langkah awal yang dilakukan adalah menyiapkan reagen

Bradford yang terdiri dari 50 mg Coomassie brilliant blue G-250 yang dilarutkan

dalam 25 mL etanol 96%, kemudian ditambahkan 50 mL asam fosfat 85% dan

diencerkan dengan akuades sampai volume 500 mL. Analisis sampel dilakukan

dengan cara memasukkan 10 µL sampel dalam tabung Eppendorf kemudian ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

(48)

33

ditambahkan akuades sampai volume 100 µL lalu ditambahkan reagen Bradford.

Blanko yang digunakan terdiri dari 100 µL akuades dan 1 µL reagen Bradford.

Setelah itu, larutan dihomogenkan dengan vortex, kemudian absorbansi dibaca

dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.

Standar BSA dibuat pada kisaran 100 – 500 µg/mL dari stok BSA dengan

kadar 1 mg/mL. Dari stok tersebut dilakukan pengenceran dengan akuades untuk

memperoleh konsentrasi yang diinginkan. Blanko yang digunakan adalah 100 µL

akuades dan 1 mL reagen Bradford. Selanjutnya absorbansi dibaca dengan

menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm.

3.9 Pemurnian Enzim

Ekstrak kasar enzim lakase dari isolat kapang TKKS dipresipitasi dengan

amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan tertentu. Tabel kejenuhan amonium

sulfat yang digunakan adalah berdasarkan tabel Scopes (1994).

Setelah dipresipitasi dengan amonium sulfat kemudian dilakukan

sentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm, selama 20 menit pada suhu 4°C. Endapan

enzim dilarutkan dalam buffer tertentu dengan pH optimumnya masing – masing,

kemudian didialisis. Dialisis dilakukan dengan cara memasukkan larutan enzim

lakase tersebut ke dalam tabung selofan. Tabung selofan yang berisi enzim lakase

direndam dalam larutan buffer dengan konsentrasi yang lebih rendah dengan pH

optimumnya masing – masing sambil diaduk dengan pengaduk magnetik dan

diletakkan dalam ruangan bersuhu tertentu.