BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.7 Rumput Laut
2.7.1 Kandungan Senyawa Aktif Ekstrak Rumput Laut
2.7.1.2 Protein
Struktur dan senyawa biologi dari rumput laut tidak banyak didokumentasikan seperti halnya polisakarida. Biasanya protein hanya 5% dari berat kering. Rumput laut memiliki sedikit kadar protein. Protein penting yang dapat ditemukan pada rumput laut adalah lektin, berikatan dengan karbohidrat dan berperan dalam komunikasi interselular. Protein juga berperan sebagai anti bakteri, anti virus dan anti inflamasi (Chojnacka et al., 2012).
2.7.1.3 PUFA (poly unsaturated fatty acid)
Fosfolipid dan glikolipid adalah lipid utama yang ditemukan di rumput laut. Ketika suhu lingkungan turun maka rumput laut akan mengakumulasikan PUFA. Spesies yang hidup di daerah dingin akan memiliki lebih banyak PUFA dibandingkan spesies rumput laut yang hidup di daerah dengan suhu lebih tinggi.
Rantai panjang PUFA sangat dibutuhkan oleh manusia karena perannya sangat penting untuk kesehatan dan hanya dihasilkan oleh tanaman (Chojnacka et al., 2012).
2.7.1.4 Pigmen
Pigmen yang terdapat di rumput laut dapat dibagi menjadi 3 grup utama yaitu klorofil, karotenoid dan phycobiliprotein. Karotenoid adalah pigmen organik yang terdapat di dalam khloroplast dan khromoplast. Diproduksi oleh ganggang laut, tanaman, jamur dan beberapa bakteri. Karotenoid merupakan antioksidan kuat dan berbeda- beda pada tiap spesies rumput laut. Karotenoid yang paling
penting pada rumput laut adalah β- karoten, fucoxanthin dan tokoferol (Chojnacka et al., 2012).
β-karoten berfungsi sebagai antioksidan sehingga mampu melindungi sel dari kerusakan oksidatif karena radikal bebas, dengan cara meniadakan aktivitas spesies radikal bebas tetapi hanya bekerja pada tekanan rendah yaitu sekitar 3,10- 2 atm (oksigen 2%). Aktivitas antioksidan yang dimiliki β-karoten akan hilang pada tekanan tinggi dan menunjukkan pengaruh pro- oksidan secara auto-katalitik (Merdekawati and Susanto, 2009).
Sekitar 70% dari total karotenoid adalah fucoxanthin (Chojnacka et al., 2012). Fucoxanthin memiliki aktivitas sebagai radical scavenging, imunomodulator, aktivitas sebagai singlet oxygen quenching dan masih banyak efek farmakologi lainnya (Moghadamtousi et al., 2014). Selain itu juga bertindak sebagai anti inflamasi, anti kanker, anti obesitas, anti diabetes, anti angiogenik, anti malaria dan memiliki efek protektif terhadap hati, pembuluh darah di otak, mata, kulit dan juga tulang (Peng et al., 2011).
Fucoxanthin secara signifikan menurunkan jumlah lemak hati dengan cara menghambat absorpsi lemak pada tikus yang diberi diet tinggi lemak, sehingga berat lemak di faeses meningkat, juga menurunkan akumulasi droplet lemak di hati, kemungkinan dengan cara menurunkan aktifitas dari enzim-enzim yang mensintesis asam lemak di hati. Fungsi lainnya adalah memperbaiki proliferasi sel dan meningkatkan kadar glutation di hati, sehingga akan menurunkan kerusakan interseluler yang terjadi akibat ROS, menurunkan kerusakan DNA (Peng et al., 2011).
Fucoxanthin memiliki potensi yang jauh lebih baik dari pada β-karoten dan retinol dalam mengurangi peroksidasi lipid di plasma. Berdasarkan penelitian, didapatkan bahwa fucoxanthin secara signifikan menurunkan konsentrasi trigliserida baik di plasma maupun hepatik, menurunkan enzim-enzim yang meregulasi kolesterol, serta meningkatkan konsentrasi dari HDL di plasma, meningkatkan kolesterol dan trigliserida di fekal. Sehingga dapat disimpulkan bahwa fucoxanthin memperbaiki profil lipid plasma dan hepatik, fekal lipid, massa lemak tubuh, metabolisme kolesterol hepatik, sintesa asam lemak, penyerapan lemak dan berperan sebagai regulator dari metabolisme lemak di jaringan lemak (Peng et al., 2011).
2.7.1.5 Polifenol
Polifenol diproduksi oleh banyak tanaman termasuk rumput laut dan merupakan antioksidan kuat. Polifenol yang terdapat di rumput laut adalah asam fenolik, flavonoid, isoflavon, cinnamic acid, asam benzoate, quercetin dan lignin (Chojnacka et al., 2012; Namvar et al., 2013).
Rumput laut memproduksi polifenol untuk melindungi dirinya dari kondisi eksternal. Polifenol dapat memberikan atom hidrogen yang dimilikinya pada radikal bebas dan membentuk radikal yang non reaktif dan berperan dalam menekan terjadinya peroksidasi lipid. Senyawa polifenol yang ditemukan pada rumput laut memiliki fungsi foto protektif dan aktivitas anti- photo aging sehingga dapat mencegah terjadinya stress oksidatif dan kerusakan yang terjadi karena sinar
UV. Kadar polifenol pada rumput laut tergantung juga pada cara ekstraksi (Chojnacka et al., 2012; Namvar et al., 2013).
Flavonoids merupakan komponen polyphenolic yang terdapat pada banyak tanaman. Berdasarkan struktur kimia, diketahui terdapat lebih 4000 flavonoid, yang efeknya menguntungkan bagi kesehatan tubuh, utamanya sebagai antioksidan yang kuat dan kemampuan mengikat zat tertentu yang berbahaya bagi tubuh (chelat). Efek perlindungan dari flavonoid dalam sistem biologikal adalah kapasitasnya untuk mentransfer elektron kepada radikal bebas, mengikat katalis logam, mengaktifkan antioksidan enzimatik, mengurangi radikal α-tocopherol, dan menghambat oksidasi (Heim et al., 2002). Kemampuan untuk membasmi radikal bebas utamanya disebabkan karena reaktifitas yang tinggi dari gugus hydroxyl flavonoid dengan reaksi sebagai berikut ;
F- OH + R F- O + RH
Efek chelating dari flavonoid dengan menetralkan ion besi dari kelebihan besi dalam sel hepar, sehingga menghambat kerusakan oksidatif. Reaksi dari besi fero dengan hidrogen peroksida menghasilkan radikal hidroksil yang kemudian mengoksidasi biomolekul di sekitarnya. Dikenal sebagai reaksi Fenton, yang berhubungan dengan konsentrasi tembaga atau besi. Reaksi Fenton ini dihambat dengan kuat oleh flavonoid (Heim et al., 2002).
Phlorotannin adalah salah satu grup tannin dan termasuk ke dalam kelompok polifenol. Kandungan phlorotannin berbeda pada tiap spesies, berkisar antara 1-10% dari berat kering rumput laut. Sampel Kappaphycus alvarezii yang
didapat dari Kudat, Borneo mengandung 22.5 mg phlorotannin ekuivalen/ gram ekstrak rumput laut. Phlorotannin adalah salah satu antioksidan kuat karena strukturnya yang unik dan menunjukkan aktivitas antioksidan 10x lebih kuat dibandingkan dengan asam askorbat dan α-tokoferol. Karena merupakan salah satu antioksidan kuat, maka phlorotannin juga berperan dalam penyembuhan luka dan memiliki efek hepatoprotektif, antimikroba dan memiliki efek pencerah sehingga dipakai dalam industri kosmetik. Secara umum, karena phlorotannin termasuk ke dalam grup polifenol, maka aktivitas antioksidan pada phlorotannin dimungkinkan karena adanya cincin fenol yang berperan sebagai electron traps untuk radikal bebas (Senthil and Murugan, 2013; Chojnacka et al., 2012; Namvar et al., 2011). Phlorotannin memiliki scavenging activity yang sangat kuat terhadap radikal anion superoksida, dan dilaporkan juga bahwa phlorotannin memiliki interaksi yang kuat dengan lapisan bilayer lemak dan dapat mencegah terjadinya peroksidasi lipid (Shibata et al., 2007).
2.7.1.6 Mineral
Ganggang adalah salah satu sumber makanan yang kaya mineral. Dapat mencapai 40% karena rumput laut mengakumulasikan ion metal dari air garam.
Rumput laut mengandung banyak sodium (Chojnacka et al., 2012).
Karena keterbatasan laboratorium, maka melalui pemeriksaan fitokimia didapatkan data ekstrak rumput laut (Kappaphycus alvarezii) yang digunakan pada penelitian ini mengandung flavonoid 68,48 mg/100gr QE bb, total fenol
385,06 mg/100gr GAE bb, kapasitas antioksidan 946,72 mg/L GAEAC bb dan mengandung betakaroten 70,47 ug/100gr bb (Lampiran 3).
2.8 Hewan Coba Tikus (Rattus novergicus) 2.8.1 Penggunaan tikus
Penggunaan hewan coba tikus galur Wistar dikarenakan tikus telah diketahui sifat-sifatnya dengan baik, mudah dipelihara, merupakan hewan yang relatif sehat dan cocok untuk berbagai macam penelitian. Terdapat beberapa galur tikus antara lain galur Sprague-dawley yang berwarna albino berkepala kecil dengan ekor lebih panjang dari pada badannya dan galur Wistar yang ditandai dengan kepala yang besar dan dengan ekor yang lebih pendek. Tikus galur Wistar lebih besar daripada famili tikus umumnya, dimana tikus galur Wistar ini dapat mencapai ukuran 40 cm, yang diukur dari hidung sampai ujung ekor dan berat berkisar antara 180-200 gram. Tikus betina biasanya memiliki ukuran lebih kecil dari tikus jantan dan memiliki kematangan seksual pada umur 4 bulan dan tikus ini dapat hidup selama 4 tahun (Kusumawati, 2004).
Tikus putih jantan dipilih sebagai subjek dalam penelitian ini karena tidak dipengaruhi oleh siklus menstruasi dan kehamilan (Ngatidjan, 2006). Berdasarkan survei yang dilakukan oleh Riskesda tahun 2007 tentang penggunaan alkohol, yang melibatkan koresponden laki-laki berusia di atas 15 tahun, maka penelitian ini mengambil sampel tikus berumur 24-26 minggu, karena pada usia tersebut tikus sudah dewasa dan tikus berumur 24 minggu (6 bulan) setara dengan manusia berumur 18 tahun (Sengupta, 2013).
2.8.2 Pemberian makanan dan minuman
Bahan dasar makanan tikus dapat bervariasi, misalnya protein 20-25%, lemak 5%, karbohidrat 45-50%, serat kasar 5%, abu 4-5%, vitamin A 4000 IU/kg, vitamin D 1000 IU/kg, alfa tokoferol 30 mg/kg, asam linoleat 3 g/kg, tiamin 4 mg/kg, riboflavin 3 mg/kg, pantotenat 8 mg/kg, vitamin B12 50 μg/kg, biotin 10 μg/kg, piridoksin 40μg/kg dan kolin 1000 mg/kg. Untuk memenuhi kebutuhan makanan tikus, di Indonesia digunakan makanan ayam petelur dengan kandungan protein 17%, yang mudah didapatkan di toko makanan ayam dan pemberian minum tikus ad libitum (Ngatidjan, 2006).
2.8.3 Pemantauan keselamatan tikus
Diperlukan pemantauan keselamatan tikus di laboratorium antara lain (Ngatidjan, 2006):
1. Kandang tikus harus cukup kuat, tidak mudah rusak, mudah dibersihkan (satu kali seminggu), mudah dipasang lagi, hewan tidak mudah lepas, harus tahan terhadap gigitan tikus dan hewan tampak jelas dari luar. Alas kandang harus mudah menyerap air, pada umumnya yang dipakai serbuk gergaji atau sekam padi.
2. Menciptakan suasana lingkungan yang stabil dan sesuai dengan keperluan fisiologis tikus. Diatur suhu, kelembaban dan kecepatan pertukaran udara yang ekstrim harus dihindari.
3. Tikus harus diperlakukan dengan kasih sayang.
BAB III
KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Berpikir
Proses penuaan dapat disebabkan oleh beberapa faktor, baik faktor eksternal, misalnya polusi, stres, makanan yang tidak sehat, maupun bisa disebabkan faktor internal, di antaranya radikal bebas, hormon yang berkurang, genetik dan lainnya.
Peran radikal bebas pada proses penuaan sangat penting, karena radikal bebas akan menyebabkan stres oksidatif yang pada akhirnya dapat menimbulkan kerusakan, bahkan kematian sel dalam tubuh. Konsumsi alkohol dapat meningkatkan radikal bebas dan menempati urutan ketiga di dunia sebagai faktor risiko dari berbagai penyakit dan disabilitas.
Alkohol yang dikonsumsi, 90% di antaranya akan dimetabolisme oleh tubuh terutama hati oleh enzim alkohol dehidrogenase (ADH) dan koenzim nikotinamid-adenine-dinukleotida (NAD) menjadi asetaldehid yang merupakan produk yang sangat reaktif dan sangat beracun sehingga menyebabkan kerusakan jaringan atau sel. Oleh karena itu hati menjadi target organ yang utama dari kerusakan yang dtimbulkan oleh alkohol. Jika hati mengalami kerusakan, enzim aspartate aminotransferase (AST) dan alanin aminotransferase (ALT) yang terdapat di hati akan keluar dari sel hati sehingga kadarnya meningkat dalam darah. Kedua enzim ini merupakan indikator terbaik untuk mengidentifikasi kerusakan hati karena peningkatan kedua enzim ini terjadi lebih awal dan
umumnya peningkatannya lebih drastis dari enzim lainnya. Rusaknya sel hati akan menyebabkan gangguan dalam metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein.
Sehingga bila terjadi kerusakan pada hati maka fungsi hati untuk memecah lemak juga akan terganggu dan bila hal ini terus berlanjut maka akan berkembang menjadi perlemakan hati.
Banyak antioksidan yang dapat meredam efek buruk dari radikal bebas, salah satunya adalah rumput laut yang memiliki komponen bioaktif polifenol seperti flavonoid dan phlorotannin. Polifenol dapat memberikan atom hidrogen yang dimilikinya pada radikal bebas dan membentuk senyawa yang non-reaktif dan berperan dalam menekan terjadinya peroksidasi lipid dan cincin fenol berperan sebagai electron traps untuk radikal bebas. Hal ini ditandai dengan adanya penghambatan peningkatan kadar serum alanine aminotransferase dan aspartate aminotransferase.
3.2 Konsep
Gambar 3.1 Bagan Kerangka Konsep Keterangan:
Diteliti ---> Tidak diteliti
3.3 Hipotesis Penelitian
1. Pemberian ekstrak rumput laut (Kappaphycus alvarezii) menghambat peningkatan alanine aminotransferase (ALT) pada tikus (Rattus norvegicus) yang diberi alkohol.
Tikus yang diberi Alkohol Kadar ALT Kadar AST Perlemakan hati/
Steatosis Faktor Internal
Genetik Hormonal Jenis Kelamin
Ekstrak Rumput Laut
Faktor Eksternal Polusi
Stres Nutrisi
2. Pemberian ekstrak rumput laut (Kappaphycus alvarezii) menghambat peningkatan aspartate aminotransferase (AST) pada tikus (Rattus norvegicus) yang diberi alkohol.
3. Pemberian ekstrak rumput laut (Kappaphycus alvarezii) menghambat terjadinya perlemakan sel hati/ steatosis pada tikus (Rattus norvegicus) yang diberi alkohol.
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan menggunakan Post Test Only Control Group Design (Marczyk et al., 2005).
Rancangan penelitian dapat digambarkan sebagai berikut:
P0
P1 Gambar 4.1 Skema Rancangan Penelitian
Keterangan:
P : Populasi S : Sampel R : Random
P0 : Perlakuan kelompok kontrol yang diberikan akuades sebanyak 1cc/200gr bb tikus + alkohol 40% sebanyak 1cc/200gr bb tikus
P1 : Perlakuan pada kelompok yang diberikan ekstrak rumput laut (Kappaphycus alvarezii) dengan dosis 180 mg/1cc per 200 bb tikus + alkohol 40% sebanyak 1cc/200gr bb tikus
O1 : Observasi kadar ALT, AST dan steatosis pada post test kelompok kontrol (P0)
P S R
O1
O2
O2: Observasi kadar ALT, AST dan steatosis pada post test kelompok perlakuan (P1)
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian a. Lokasi penelitian
1. Analisis fitokimia rumput laut (Kappaphycus alvarezii) dilakukan di Laboratorium Analisis Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana.
2. Pembuatan ekstrak rumput laut (Kappaphycus alvarezii) dilakukan di Laboratorium Sumber Daya Genetika dan Biologi Molekuler Universitas Udayana serta Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.
3. Penelitian dilaksanakan di Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.
4. Pemeriksaan ALT dan AST dilaksanakan di UPT. Balai Laboratorium Kesehatan Provinsi Bali.
5. Pemeriksaan perlemakan sel hati dilaksanakan di Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana.
b. Waktu penelitian :
Penelitian ini dilakukan pada 2 Desember 2016- 7 Februari 2017, dengan perincian:
1. Tujuh hari untuk adaptasi subjek untuk penelitian pendahuluan.
2. Pada penelitian pendahuluan tikus dibagi menjadi 4 kelompok yaitu kelompok kontrol P0 yang diberikan akuades sebagai plasebo sebanyak 1cc/200gr bb tikus, kelompok perlakuan P1 diberikan ekstrak rumput laut sebanyak 40 mg/200gr bb tikus, kelompok perlakuan P2 diberikan ekstrak rumput laut sebanyak 80 mg/200gr bb tikus, kelompok perlakuan P3 diberikan ekstrak rumput laut sebanyak 180mg/200gr bb tikus. 1 jam kemudian semua tikus diberikan alkohol 40% sebanyak 1cc/200gr selama empat belas hari untuk menginduksi terjadinya perlemakan hati. Hari ke-14 perlakuan, darah tikus diambil untuk pemeriksaan kadar ALT dan AST kemudian dilakukan pembedahan untuk menghitung jumlah perlemakan sel hati.
3. Tujuh hari untuk analisis data.
4. Tujuh hari untuk adaptasi subjek penelitian.
5. Empat belas hari untuk pemberian plasebo (akuades) sebanyak 1cc/200gr bb tikus dan alkohol 40% sebanyak 1cc/200gr bb tikus pada kelompok kontrol (P0), pemberian ekstrak rumput laut (Kappaphycus alvarezii) dengan dosis 180mg/1cc per 200gr bb tikus ditambah pemberian alkohol 40% sebanyak 1cc/200gr bb tikus pada kelompok perlakuan P1. Hari ke-14 perlakuan, darah tikus diambil untuk pemeriksaan kadar ALT dan AST kemudian dilakukan pembedahan untuk menghitung jumlah perlemakan sel hati.
6. Lima belas hari untuk analisis data dan penyusunan laporan.
4.3. Subjek Penelitian 4.3.1. Subjek penelitian
Subjek penelitian adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan Wistar, berumur antara 24-26 minggu, dengan berat badan 180-200 gram.
4.3.2. Kriteria subjek 1. Kriteria inklusi
a. Tikus (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar sehat
b. Umur 24- 26 minggu (setara dengan manusia berusia 18 tahun) c. Berat badan 180-200 gram
2. Kriteria drop out
Tikus mati saat penelitian 4.3.3 Besaran sampel
Pada penelitian ini sampel diperhitungkan dengan Rumus Federer (Sastroasmoro and Ismail, 2008) jumlah sampel minimal.
Rumus Federer : ( n – 1) ( t – 1) ≥ 15
Keterangan: n = jumlah sampel tiap kelompok perlakuan t = jumlah kelompok perlakuan
Dengan demikian, maka diperoleh:
(n - 1) (2 - 1) ≥ 15 (n - 1) 1 ≥ 15 (n - 1) ≥ 15 n = 16
Minimal jumlah sampel = 16, ditambah 10% untuk mengatasi drop out menjadi 18 ekor tikus per masing-masing kelompok. Karena jumlah kelompok adalah 2, maka jumlah tikus seluruhnya adalah 36 ekor.
4.3.4 Teknik penentuan sampel
Teknik pengambilan sampel dalam penelitian ini dilakukan dengan cara sebagai berikut:
1. Dilakukan pemilihan sampel dari populasi tikus berdasarkan kriteria inklusi, yaitu tikus jantan sehat, berumur 24-26 minggu, berat badan tikus antara 180-200 gram.
2. Dari sampel yang telah memenuhi kriteria inklusi, diambil secara random untuk mendapatkan jumlah sampel penelitian.
3. Dari sampel yang telah dipilih kemudian dibagi menjadi 2 kelompok secara random yaitu kelompok kontrol (P0) dan kelompok perlakuan (P1).
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Klasifikasi variabel penelitian
Klasifikasi variabel penelitian dibedakan menjadi:
1. Variabel bebas : ekstrak rumput laut (Kappaphycus alvarezii) 2. Variabel tergantung : kadar ALT dan AST, jumlah perlemakan sel hati 3. Variabel terkendali : a. varian tikus
b. jenis kelamin, usia, berat badan
c. kandang, cahaya, suhu d. makan dan minum
4.4.2 Definisi operasional variabel
a. Rumput laut yang digunakan adalah rumput laut jenis brown strain Kappaphycus alvarezii (rumput laut Filipina) yang tumbuh di daerah pantai Pulau Serangan, Bali. Ekstrak berupa pasta yang dibuat di Laboratorium Sumber Daya Genetika dan Biologi Molekuler Universitas Udayana serta Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Pembuatan ekstrak dengan mengeringkan rumput laut dengan cara diangin-anginkan, lalu dipotong menjadi bagian-bagian kecil dan dihancurkan menggunakan blender.
Kemudian dimaserasi menggunakan etanol 96% dengan perbandingan 1 bagian rumput laut dan 9 bagian etanol. Diaduk sesekali dan ditempatkan di ruang gelap. Maserasi dilakukan minimal 1x24 jam lalu disaring menggunakan kertas saring Whatman dan ditampung dengan baker glass.
Hasil saringan kemudian diuapkan dengan rotary evaporator dengan suhu water bath 450C. Setelah selesai, ekstrak ditampung menggunakan baker glass (Laboratory Animal Unit, Universitas Udayana). Diberikan melalui jalur intragastrik menggunakan spuit yang sudah dilepaskan jarumnya, dengan dosis 180 mg/1cc per 200 gram bb tikus.
b. Alkohol yang digunakan adalah whisky merk Martell dengan kadar alkohol 40% dengan dosis 1cc/200gr bb tikus. Diberikan melalui jalur
intragastrik. Berdasarkan data yang didapat dari Riskesdas 2007, konsumsi alkohol yang terbanyak di Bali adalah minuman tradisional seperti tuak Bali dengan kadar alkohol 40%. Penelitian ini menggunakan whisky merk Martell karena kadar alkohol sudah diukur sesuai standar dan kandungan alkohol lebih stabil jika dibandingkan dengan minuman tradisional seperti tuak atau arak Bali.
c. Alanine Aminotransferase (ALT) merupakan enzim hati yang digunakan untuk penanda cidera hepatoseluler (IU/l). Bersifat khas dan spesifik.
Kadar ALT normal pada tikus putih adalah 12,6±4,40 IU/l. Sampel darah diambil dari area canthus medialis sinus orbitalis tikus putih. Pengukuran kadar ALT menggunakan kit merk DiaSys. Pembacaan aktivitas ALT menggunakan alat spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 365 nm.
d. Aspartate Aminotransferase (AST) merupakan enzim hati yang digunakan sebagai penanda cidera hepatoseluler (IU/l). Kadar AST normal pada tikus putih adalah 141±67,4 IU/l. Sampel darah diambil dari area canthus medialis sinus orbitalis tikus putih. Pengukuran kadar AST menggunakan kit merk DiaSys. Pembacaan aktivitas AST menggunakan alat spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 365 nm.
e. Sel hati (hepatosit) yang mengalami perlemakan adalah hepatosit yang vakuolanya mendesak nukleus ke perifer, pewarnaan preparat histologi menggunakan hematoxyllin-eosin, kemudian dilihat melalui mikroskop dengan pembesaran 400x dengan lensa obyektif. Setiap preparat diamati 4
lapang pandang yaitu pada keempat sudut di sekitar V.Sentralis, difoto, kemudian dihitung menggunakan perangkat lunak Image Tool.
Penghitungan dengan cara menjumlahkan sel hepatosit yang mengalami perlemakan pada 4 lapang pandang tersebut.
f. Tikus Wistar jantan adalah hewan percobaan berupa tikus jenis Rattus norvegicus jenis kelamin jantan, yang sehat, berat 180-200 gram, berusia 24-26 minggu (6 bulan).
4.5 Bahan Penelitian
a. Ekstrak rumput laut yang digunakan berasal dari rumput laut jenis brown strain Kappaphycus alvarezii (rumput laut Filipina) yang tumbuh di daerah pantai Pulau Serangan, Bali. Ekstrak berupa pasta yang dibuat di Laboratorium Sumber Daya Genetika dan Biologi Molekuler Universitas Udayana serta Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Diberikan melalui jalur intragastrik menggunakan spuit yang sudah dilepaskan jarumnya, dengan dosis 180 mg/1cc per 200 gram bb tikus.
Ekstrak rumput laut dibuat dengan cara mengeringkan rumput laut dengan cara diangin-anginkan, lalu dipotong menjadi bagian-bagian kecil dan dihancurkan menggunakan blender. Kemudian dimaserasi menggunakan etanol 96% dengan perbandingan 1 bagian rumput laut dan 9 bagian etanol. Diaduk sesekali dan ditempatkan di ruang gelap. Maserasi dilakukan minimal 1x24 jam lalu disaring menggunakan kertas saring
Whatman dan ditampung dengan baker glass. Hasil saringan kemudian diuapkan dengan rotary evaporator dengan suhu water bath 450C. Setelah selesai, ekstrak ditampung menggunakan baker glass (Laboratory Animal Unit, Universitas Udayana). Penelitian yang dilakukan oleh Ismail and Tan (2002) dari Departemen Nutrisi, Universitas Putra Malaysia menggunakan suhu 400C untuk menghilangkan residu etanol pada ekstrak rumput laut. Tetapi pada penelitian yang dilakukan oleh Fahmi et al (2014) dari Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya, digunakan suhu 780C sebagai titik didih etanol.
b. Alkohol yang digunakan adalah whisky Martell dengan kadar alkohol 40%
dengan sebanyak 1 cc/200 gr bb tikus.
c. Tikus jantan galur wistar umur 24-26 minggu dengan berat 180-200 gr.
d. Bahan-bahan untuk metode baku histologi pemeriksaan jaringan : 1. Larutan buffer formalin 10%
2. Parafin 3. Albumin
4. Hematoksilin-eosin 5. Larutan xylol
6. Alkohol bertingkat 30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%
7. Akuades 8. Acid alcohol 9. entelan
e. Bahan untuk anestesi dan eutanasia: Ketamin xylazine
f. Akuades sebagai plasebo 4.6 Alat Penelitian
1. Alat yang dibutuhkan untuk membuat ekstrak rumput laut (kertas saring Whatman, baker glass, erlenmyer, rotary evaporator, spatula, timbangan analitik, botol labu untuk ekstrak)
2. Kandang tikus putih beserta kelengkapan pemberian makan
3. Timbangan khusus untuk mengukur berat badan tikus, merk Sartorius yang tersedia di Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana
4. Sonde
5. Peralatan untuk mengambil sampel darah tikus (mikropipet) 6. Tabung berisi antikoagulan EDTA
7. Kit pemeriksaan AST dan ALT merk DiaSys
8. Alat spektofotometer UV dengan panjang gelombang 365 nm
9. Peralatan bedah untuk mengambil sampel hati tikus (minor surgery set) 10. Botol-botol falcon untuk menempatkan organ hati
11. Mikrotom
12. Seperangkat alat untuk membuat preparat histologi (objek glass, cawan petri, hot plate)
13. Mikroskop