Saran - SIMPULAN DAN SARAN - PDF Hubungan Antara Rasio Osteoprotegerin / Rank Ligand, Oligomeri

BAB VII SIMPULAN DAN SARAN

7.2 Saran

DAFTAR PUSTAKA

Amiable, N., Pelletier, J.P., Boileau, C., Lajeunesse, D., Duval, N. and Martel-Pelletier, J., 2009. Modulation of OPG, RANK and RANKL by human chondrocytes and their implication during osteoarthritis. Rheumatology, p.kep300.

Bellido, M., Lugo, L., Roman-Blas, J., Castañeda, S., Caeiro, J., Dapia, S., Calvo, E., Largo, R.

and Herrero-Beaumont, G., 2010. Subchondral bone microstructural damage by increased remodelling aggravates experimental osteoarthritis preceded by osteoporosis. Arthritis Research and Therapy, 12(4), p.R152

Bellido, M., Lugo, L., Roman-Blas, J.A., Castaneda, S., Calvo, E., Largo, R. and Herrero- Beaumont, G., 2011. Improving subchondral bone integrity reduces progression of cartilage damage in experimental osteoarthritis preceded by osteoporosis.

Osteoarthritis and cartilage, 19(10), pp.1228-1236

Bleasel JF, Poole AR, Heinegard D, et al. 1999. Changes in serum cartilage marker levels indicate altered cartilage metabolism in families with the osteoarthritis-related type II collagen gene COL2A1 mutation. Arthritis Rheum. 42:39-45

Boyce, B. F. & Xing, L.2007.Biology of RANK, RANKL, and osteoprotegerin.Arthritis research & therapy, 9: 1.

Çakırca, G., Mete, N., Batmaz, I., Sarıyıldız, M. A., Ulu, M. A., Yazmalar, L., Celepkolu, T. &

Çevik, R.2012.The relationship between bone mineral density and levels of RANKL, osteoprotegerin and cathepsin-K in patients with rheumatoid arthritis.Dicle Medical Journal/Dicle Tip Dergisi, 39.

Castañeda, S., Roman-Blas, J.A., Largo, R. and Herrero-Beaumont, G., 2012.Subchondral bone as a key target for osteoarthritis treatment. Biochemical pharmacology, 83(3), pp.315- 323

Chandler C.L., Desa, FM. 1991.The effects of estrogens on cartilage degradation using in vivo and in vitro models. Agents Actions, 34(1/2): 282-286

Creamer, P., Lethbridge-Cejku, M. & Hochberg, M. C.1998.Where does it hurt? Pain localization in osteoarthritis of the knee.Osteoarthritis and Cartilage, 6: 318-323.

Crotti, T., Smith, M.D., Hirsch, R., Soukoulis, S., Weedon, H., Capone, M., Ahern, M.J. and Haynes, D., 2003.Receptor activator NF κB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) protein expression in periodontitis. Journal of Periodontal Research, 38(4), pp.380-387

Crotti, T.N., Smith, M.D., Weedon, H., Ahern, M.J., Findlay, D.M., Kraan, M., Tak, P.P. and Haynes, D.R., 2002. Receptor activator NF-κB ligand (RANKL) expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, osteoarthritis, and from normal patients: semiquantitative and quantitative analysis.

Annals of the rheumatic diseases, 61(12), pp.1047-1054.

Fernandes, F. A., Pucinelli, M. L. C., da Silva, N. P. & Feldman, D.2007.Serum cartilage oligomeric matrix protein (COMP) levels in lutut osteoarthritis in a Brazilian population: clinical and radiological correlation.Scandinavian Journal of Rheumatology, 36: 211-215.

Fonseca, J.E., Cortez-Dias, N., Francisco, A., Sobral, M., Canhao, H., Resende, C., Castelao, W., Macieira, C., Sequeira, G., Saraiva, F. and da Silva, J.A., 2004. Inflammatory cell infiltrate and RANKL/OPG expression in rheumatoid synovium: comparison with other inflammatory arthropathies and correlation with outcome. Clinical and experimental rheumatology, 23(2), pp.185-192.

Giner, M., Rios, M.J., Montoya, M.J., Vázquez, M.A., Naji, L. and Pérez-Cano, R., 2009.RANKL/OPG in primary cultures of osteoblasts from post-menopausal women.

Differences between osteoporotic hip fractures and osteoarthritis. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 113(1), pp.46-51

Hassan, A., Eltarhouny, S., Hashem, H., Algaidi, S., Abdallah, A. & Sandokji, A.Parallel Assessment of Bone Mineral Density and RANKL/OPG Ratio in Saudi Females.

Haynes, D.R., Barg, E., Crotti, T.N., Holding, C., Weedon, H., Atkins, G.J., Zannetino, A., Ahern, M.J., Coleman, M., Roberts‐Thomson, P.J. and Kraan, M., 2003.

Osteoprotegerin expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathies and osteoarthritis and normal controls. Rheumatology, 42(1), pp.123-134

Lajeunesse, D., Pelletier, J.P. and Martel-Pelletier, J., 2010. Targeting subchondral bone for treating osteoarthritis: what is the evidence?. Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 24(1), pp.51-70.

Logar, D.B., Komadina, R., Preželj, J., Ostanek, B., Trošt, Z. and Marc, J., 2007. Expression of bone resorption genes in osteoarthritis and in osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism, 25(4), pp.219-225.

Moreno‐Rubio, J., Herrero‐Beaumont, G. and Largo, R., 2010. Nonsteroidal antiinflammatory drugs and prostaglandin E2 modulate the synthesis of osteoprotegerin and RANKL in the cartilage of patients with severe lututosteoarthritis. Arthritis & Rheumatism, 62(2), pp.478-488.

Pelletier, J., Lajeunesse, D., Fahmi, H., Lavigne, M. and Martel-Pelletier, J., 2008. The differential expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) in human osteoarthritic subchondral bone

osteoblasts is an indicator of the metabolic state of these disease cells. Clinical and experimental rheumatology, 26(2), p.295

Pelletier, J.P., Velasco, C.R., Padrines, M. and Martel-Pelletier, J., 2009. New perspective in osteoarthritis: the OPG and RANKL system as a potential therapeutic target?. The Keio journal of medicine, 58(1), pp.29-40.

Pelletier, J.P., Vergés, J., Lajeunesse, D., Montell, E., Fahmi, H., Lavigne, M. and Martel- Pelletier, J., 2007. Chondroitin and glucosamine sulfate in combination decrease the pro-resorptive properties of human osteoarthritis subchondral bone osteoblasts: a basic science study. Arthritis Research and Therapy, 9(6), p.R117

Pilichou, A., Papassotiriou, I., Michalakakou, K., Fessatou, S., Fandridis, E., Papachristou, G.

and Terpos, E., 2008. High levels of synovial fluid osteoprotegerin (OPG) and increased serum ratio of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) to OPG correlate with disease severity in patients with primary lututosteoarthritis.

Clinical biochemistry, 41(9), pp.746-749.

Punzi L., Oliviero F., Ramonda R. 2010. New horizons in osteoarthritis. Swiss Med Wkly 140:

w13098.

Skoumal, M., Kolarz, G., Haberhauer, G., Woloszczuk, W., Hawa, G. and Klingler, A., 2005.Osteoprotegerin and the receptor activator of NF-kappa B ligand in the serum and synovial fluid. A comparison of patients with longstanding rheumatoid arthritis and osteoarthritis.Rheumatology international, 26(1), pp.63-69.

Remuzgo-Martínez, S., Genre, F., López-Mejías, R., Ubilla, B., Mijares, V., Pina, T., Corrales, A., Blanco, R., Martín, J. & Llorca, J.2016.Expression of osteoprotegerin and its ligands, RANKL and TRAIL, in rheumatoid arthritis.Scientific Reports, 6.

Sniekers Y.H., Weinans H., van Osch G. JVM. Van Leeuwen J. PTM. 2010. Oestrogen is important for maintenance of cartilage and subchondral bone in a murine model of lututosteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. [Cited 2010 January 19]. Available from: URL: http://arthritis-research.com/content/12/5/R182

Solomon L., Warwick D., Nayagam S. 2010. Appley’s System of Orthopaedics and Fractures 9 edition

Takayanagi, H., Iizuka, H., Juji, T., Nakagawa, T., Yamamoto, A., Miyazaki, T., Koshihara, Y., Oda, H., Nakamura, K. and Tanaka, S., 2000. Involvement of receptor activator of nuclear factor κB ligand/osteoclast differentiation factor in osteoclastogenesis from synoviocytes in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism, 43(2), pp.259-269 Tsai C.L., Liu T.K. 1992. Osteoarthritis in women: its relationship to estrogen and current

trends. Life Sci; 50: 1737-44

Tseng S., Hari Reddi H., Di Cesare PE. 2009. Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP): A Biomarker of Arthritis. Biomarker Insights 4: 33-34.

Upton, A.R., Holding, C.A., Dharmapatni, A.A. and Haynes, D.R., 2012.The expression of RANKL and OPG in the various grades of osteoarthritic cartilage. Rheumatology international, 32(2), pp.535-540

Ushiyama T., Ueyama H., Inoue K., Ohkubo J., Hukuda S. 1999. Expression of genes for estrogen receptors α and β in human articular chondrocytes. Osteoarthritis cartilage;

7:560-566.

Valdes A. M. 2010. Molecular pathogenesis and genetics of osteoarthritis: implications for personalized medicine. Personalized Medicine. 7: 49-63.

Verma P and Krishna D. 2013. Serum Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP) in lututOsteoarthritis: A Novel Diagnostic and Prognostic Biomarker. J Orthop Res, 31:

999-1006

Vilım, V., Olejarova, M., Macháček, S., Gatterova, J., Kraus, V. & Pavelka, K.2002.Serum levels of cartilage oligomeric matrix protein (COMP) correlate with radiographic progression of lututosteoarthritis. Osteoarthritis and cartilage, 10: 707-713.

Vilim V, Vytasek R Olejarova M, Machacek S, Gatterova J, Prochazka B, Kraus VB, Pavelka K. 2001. Serum cartilage oligomeric matrix protein reflect the presence of clinically diagnosed synovitis in patients with lututosteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage.

9:612-8.

Wojdasiewicz P., Poniatowski L.A., Szukiewicz D., 2014. The Role of Inflammatory and Anti- Inflammatory Cytokines in the Pathogenesis of Osteoarthritis: Review Article.

Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation, pp 1-20.

Wollheim F A. 2003. Early stage of osteoarthritis: the search for sensitive predictor Ann Rheum, 62: 1031-1032

LAMPIRAN 1

PENJELASAN PERSETUJUAN PENELITIAN

Judul: HUBUNGAN RASIO OSTEOPROTEGERIN / RANK LIGAND, KADAR CARTILAGENOUS OLIGOMERIC MATRIX PROTEIN DENGAN DERAJAT

NYERI PADA PENDERITA OSTEOARTHRITIS LUTUT SIMTOMATIS WANITA PASKA MENOPAUSE

Peneliti utama: dr. I Gusti Bagus Arie Mahaputra B Latar belakang penelitian:

Degenerasi sendi pada osteoarthritis (OA) adalah gangguan sendi yang paling umum, dijumpai diusia tua. Penyakit ini lebih sering ditemukan pada perempuan daripada laki-laki. Hormonal sangat berperan dalam proses degenerasi dari sendi ini.

Sendi yang lazim terkena OA adalah dasar jempol, sendi jari, pinggul, dan lutut, meskipun leher (cervical spine) dan punggung bawah (lumbal tulang belakang) juga akan terpengaruh. Penderita osteoarthritis lebih banyak dialami oleh para wanita terutama setelah memasuki masa menopause. Penyakit ini menyebabkan nyeri dan cacat fungsional, mengakibatkan beban ekonomi dan sosial yang signifikan pada penderita.

Degenerasi tulang rawan mulai didaerah yang mengalami tekanan berlebihan.

Degenerasi ini menyebabkan terjadinya fibrilasi tulang rawan sendi sampaimenimbulkan sclerosis tulang subchondral. Yang makin berat menimbulkan terjadinya pembentukan osteophyte, keluhan yang paling mencolok adalah nyeri lutut yang makin berat setelah aktifitas (Solomon, 2010).

Nyeri merupakan tanda yang khas pada penderita osteoarthritis lutut. Nyeri bisa berupa mekanikal ataupun non-mekanikal. Penderita biasanya mengeluh nyeri

yang dirasakan saat berjalan ataupun saat sendi tersebut bergerak. Keluhan nyeri yang di rasakan membuat penderita datang menemui dokter untuk berobat. Secara langsung, nyeri dapat dinilai dengan Visual Analouge Scale (VAS), dimana terbagi atas derajat nyeri ringan, sedang maupun berat. Nyeri ini berasal dari sendi lutut yang mengalami proses-proses inflamasi ataupun degenerasi. Nyeri merupakan perasaan atau persepsi tidak nyaman yang dialami oleh pasien. Nyeri sangatlah objektif, sehingga dalam pengukurannya nyeri menggunakan angka NRS (Numerical Rating Scale) atau VAS (Visual Analouge Scale). Dalam VAS nyeri di bagi berdasarkan nyeri ringan, nyeri sedang dan nyeri berat (Vilim V, 2001)

Nyeri yang tejadi merupakan tanda dari adanya kelainan pada tulang subchondral. Disamping adanya inflamasi pada sendi, destruksi tulang subchondral erat dihubungkan dengan rasio OPG/RANKL (Pelletier et al, 2008). Penelitian terbaru oleh Tseng et al, 2009 melaporkan keterlibatan OPG dan RANKL pada OA, dimana OPG dan RANKL berperan dalam proses resorpsi pembentukan tulang subchondral pada kerusakan tulang. Disamping itu juga bisa karena proses inflamasi sinovium sebagai akibat adanya debris degenerasi tulang rawan sendi (yang ditandai dengan adanya COMP). Untuk itu COMP serum diperiksa dan dihubungkan dengan derajat nyeri pada penderita osteoarthritis lutut simtomatis wanita paska menopause.

Kerusakan tulang rawan ini ditandai dengan meningkatnya COMP. Sebagai indikator diagnosis COMP berkorelasi dengan keparahan penyakit. Hal ini dibuktikan dengan terdeteksinya COMP 10 kali lebih tinggi dalam cairan sinovial penderita dengan osteoarthritis (Tseng et al, 2009). Namun sampai saat ini, belum ada penelitian yang

meneliti hubungan antara rasio OPG/RANKL dan COMP dengan derajat nyeri pada penderita osteoarthritis lutut simtomatis pada wanita paska menopause.

OPG merupakan sebuah molekul protein yang dihasilkan oleh sel osteoblast yang nantinya berfungsi untuk mempertahankan proses osteoclasis atau remodeling tulang tetap dalam keadaan normal. Sama seperti OPG, RANKL adalah molekul protein yang akan berikatan di reseptor RANK pada osteoclast. Regulasi dari ikatan ini sangat dipengaruhi oleh keadaan hormonal dari tiap individu. Pada kondisi paska menopause, regulasi dari OPG dan RANKL akan mengalami gangguan. Untuk itu sebagai latar belakang masalah dari penelitian ini, perbandingan rasio OPG/RANKL merupakan penentu penting massa tulang dan integritas skelet terutama di daerah subchondral. Untuk menilai tingkat kerusakan yang terjadi di tulang subchonndral pada penderita osteoarthritis lutut wanita pasca menopause. Pemahaman tentang mekanisme OPG/RANKL dalam meregulasi pembentukan osteoklas telah berkembang dalam 10 tahun terakhir ini, dan berperan dalam pathogenesis OA lutut terutama dalam remodeling tulang subchondral. Keterlibatan OPG dan RANKL selama proses resorpsi pembentukan tulang subchondral yang telah terbukti terjadi, di mana ada di tahap kerusakan tulang dan proses pembentukan tulang.

Penelitian ini ingin mengetahui apakah ada hubungan antara rasio OPG/RANKL serta kadar COMP serum dengan derajat nyeri pada penderita OA lutut simtomatis wanita paska menopouse.

Pada penelitian ini dibutuhkan 75 sampel untuk dilakukan pemeriksaan x-ray knee posisi (AP/Lateral) atau pasien yang sudah mempunyai x-ray knee AP/Lateral.

Dari hasil pemeriksaan x-ray knee yang terdiagnosis OA lutut, diambil sampel

darahnya sebanyak 8 cc yang akan dibagi kedalam 2 tabung, tabung I mengandung mengandung heparin sebanyak 4 cc serum darah dan tabung II tanpa antikoagulan sebanyak 4 cc serum darah. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan Osteoprotegerin, RANK Ligand dan COMP.

Pengambilan dilakukan di rumah sakit pada saat Ibu diperiksa oleh dokter yang merawat. Risiko yang mungkin terjadi selama pengambilan darah adalah nyeri ringan, perdarahan di bawah kulit atau tidak sadar karena faktor psikologis.

Penanganan untuk kemungkinan risiko yang terjadi selama pengambilan darah telah disiapkan oleh dokter dan paramedis. Peserta penelitian tidak dibebani biaya untuk pengambilan serta pemeriksaan darah ini.

Kami sangat berterima kasih apabila ibu berkenan berpartisipasi dalam penelitian ini serta dapat berpartisipasi dalam penelitian ini. Ibu tidak dipaksa untuk ikut berpartisipasi dalam penelitian ini serta dapat mengundurkan diri dari penelitian ini kapan saja tanpa syarat atau sanksi apapun. Kami menjamin bahwa bahan dan data yang kami peroleh tidak akan digunakan untuk kepentingan lain dan terjaga kerahasiaannya. Data ini mungkin dipublikasikan tanpa mencantumkan identitas Ibu.

Bila masih ada hal-hal lain yang perlu ditanyakan, Ibu dapat menghubungi dokter I Gusti Bagus Arie Mahaputra B di Sub bagian Orthopaedi & Traumatologi RSUP Sanglah, Jalan Pulau Bali, Denpasar. Nomor telepon yang dapat dihubungi adalah 081294054013. Bersamaan ini kami sertakan formulir persetujuan untuk mengikuti penelitian.

LAMPIRAN 2

SURAT PERSETUJUAN PESERTA DALAM PENELITIAN

Yang Bertandatangan di bawah ini:

Nama : ………

Umur : ………

Jenis kelamin : ………

Pekerjaan : ………

Alamat : ………

No. KTP : ………

Tlp/Hp no : ………

Setelah mendapat penjelasan yang cukup serta memahami dan menyadari manfaat dan risiko penelitian yang berjudul:

HUBUNGAN RASIO OSTEOPROTEGERIN / RANK LIGAND, KADAR CARTILAGENOUS OLIGOMERIC MATRIX PROTEIN DENGAN DERAJAT NYERI PADA PENDERITA OSTEOARTHRITIS LUTUT

SIMTOMATIS WANITA PASKA MENOPAUSE

Dengan sukarela menyetujui diikut sertakan dalam penelitian di atas dan mengikuti berbagai prosedur pemeriksaan seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya. Saya tidak keberatan bila kemudian bahan-bahan tersebut beserta hasilnya menjadi bagian dari Laboratorium / SMF Orthopaedi dan Traumatologi RSUP Sanglah Denpasar, guna kepentingan ilmu pengetahuan. Saya juga mematuhi segala ketentuan – ketentuan penelitian yang sudah saya pahami, dengan catatan apabila suatu waktu merasa dirugikan dalam bentuk apapun, berhak membatalkan persetujuan ini.

Denpasar, 2017

Mengetahui: Yang menyetujui,

Penanggung jawab penelitian Peserta penelitian,

(dr. IGB Arie Mahaputra B) (……….)

Saksi pihak peneliti Saksi pihak peserta penelitian

(………) (………)

LAMPIRAN 3

KUESIONER PENELITIAN

HUBUNGAN RASIO OSTEOPROTEGERIN / RANK LIGAND, KADAR CARTILAGENOUS OLIGOMERIC MATRIX PROTEIN DENGAN DERAJAT NYERI PADA PENDERITA OSTEOARTHRITIS LUTUT

SIMTOMATIS WANITA PASKA MENOPOUSE

IDENTITAS

1. NAMA LENGKAP : 2. TEMPAT/TGL LAHIR :

3. NO. CM :

4. NO TELP/ HP :

5. ALAMAT :

RIWAYAT PENYAKIT 1. ANAMNESIS

A. NYERI LUTUT

LUTUT KANAN + / - LUTUT KIRI + / - a. YA 1. Sejak : < 6 bulan

Sejak : > 6 bulan

2. MECHANICAL PAIN : + / - (Tanya aktifitas pencetus) Jawaban:

3. NON-MECHANICAL PAIN : + / - (Tunjuk Dengan Jari) Lokasi Nyeri :

b. TIDAK B. NYERI

Sepanjang hari + / hilang timbul +

Nyeri timbul mendadak + / perlahan-lahan + Nyeri Tempat Lain: Lokasi :

C. SKALA NYERI VAS

D. LAMA MENOPAUSE : tahun

2. RIWAYAT PENYAKIT DAN PENGOBATAN SEBELUMNYA 1. Menderita infeksi (akut atau kronis)

a. Ya , sejak b. Tidak

2. Operasi pengangkatan indung telur / Rahim / a. Ya , kapan?

b. Tidak

3. Mengkonsumsi obat-obatan hormonal / terapi sulih hormone / pemakaian pil KB / suntik

a. Ya , nama obat b. Tidak

4. Mengkonsumsi obat-obat kortikosteroid ± 6 bulan

a. Ya , sejak nama obat

b. Tidak

5. Menderita penyakit malignancy / keganasan a. Ya, sebutkan

b. Tidak

6. Mengalami trauma lutut a. Ya, sebutkan

b. Tidak

STATUS FISIK DAN DATA ANTROPOMETRI

1. Tinggi Badan : cm

2. Berat Badan : kg

3. BMI / IMT :

PEMERIKSAAN LABORATORIUM A. Pemeriksaan sitokin

a. Osteoprotegerin : b. RANKL :

c. COMP :

d. IL-6 :

e. Il-10 :

PEMERIKSAAN RADIOLOGI I. X-RAY GENU AP/LAT

A. OA LUTUT (+)

a. Berkurangnya Celah sendi + / -

b. Osteophyte + / -

c.Subchondral calcification + / -

LAMPIRAN 4 : PROTOKOL PENELITIAN

1. Pada penderita pasca menopause dilakukan anamnesis, pemeriksaan fisik dan penentuan derajat nyeri serta untuk menentukan lamanya menopause

2. Pada penderita pasca menopause dilakukan pemeriksaan X- Ray Knee AP/Lateral untuk menentukan adanya OA lutut yang ditandai dengan osteofit, penyempitan joint space dan adanya subchondral sclerosis.

3. Jika memenuhi kriteria inklusi dan tidak memenuhi kriteria eksklusi dilanjutkan dengan pengukuran index massa tubuh.

4. Selanjutnya dilakukan pengambilan sampel darah dan dilakukan pemeriksaan darah osteoprotegerin, RANK Ligand dan COMP serum dengan pemeriksaan ELISA.

LAMPIRAN 5 : PEMERIKSAAN OSTEOPROTEGERIN (OPG) PERSIAPAN SAMPEL

1. Elabscience hanya bertanggung jawab untuk kit itu sendiri, tetapi tidak untuk sampel yang dikonsumsi selama percobaan. pengguna harus menghitung jumlah yang mungkin dari sampel yang dibutuhkan dalam seluruh tes. Pemesanan sampel yang cukup di muka dianjurkan.

2. Jika sampel tidak disebutkan dalam manual ini, pra-percobaan untuk menentukan validitas kit yang diperlukan.

3. Tissue atau ekstraksi sel sampel disiapkan oleh kimia buffer lisis dapat menyebabkan tak terduga Elisa hasil karena dampak dari bahan kimia tertentu.

4. Karena kemungkinan ketidakcocokan antara antigen dari asal-usul lain dan antibodi yang digunakan dalam kit kami, beberapa protein asli atau rekombinan dari produsen lain mungkin tidak terdeteksi oleh kit kami.

5. Dipengaruhi oleh faktor termasuk kelangsungan hidup sel, jumlah sel atau pengambilan sampel waktu, molekul dari supernatan kultur sel mungkin tidak terdeteksi oleh kit.

6. sampel Terlalu hemolyzed tidak cocok untuk digunakan dalam pengujian tersebut.

7. sampel segar tanpa penyimpanan lama direkomendasikan untuk tes. Jika tidak, degradasi protein dan denaturalisasi dapat terjadi pada mereka sampel dan akhirnya menyebabkan hasil yang salah.

PREPARASI REAGEN

Bawa semua reagen ke suhu kamar (18-25 ℃) sebelum digunakan.

Wash Buffer - Encerkan 30 ml Concentrated Wash Buffer menjadi 750 mL Wash Buffer dengan air deionisasi atau suling. Masukan solusi yang tidak terpakai kembali di 4 ℃. Jika kristal telah terbentuk dalam konsentrat, Anda dapat menghangatkan dengan 40 ℃ air mandi (suhu pemanasan tidak boleh melebihi 50 ℃) dan mencampurnya dengan lembut sampai kristal telah benar-benar larut. Solusinya harus didinginkan sampai suhu kamar sebelum digunakan.

Standar - Siapkan standar dalam waktu 15 menit sebelum digunakan. Centrifuge di 10.000 × g selama 1 menit, dan menyusun kembali Standar dengan 1.0mL dari Standard Reference & Pengencer Sampel. Kencangkan tutup, biarkan selama 10 menit dan mengubahnya terbalik beberapa kali. Setelah larut sepenuhnya, mencampurnya secara menyeluruh dengan pipet. rekonstitusi ini menghasilkan larutan stok dari 10ng / mL. Kemudian membuat pengenceran serial yang diperlukan (membuat seri pengenceran di sumur langsung tidak diizinkan). Konsentrasi yang direkomendasikan adalah sebagai berikut: 10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.156,0 ng / mL. Jika Anda ingin membuat larutan standar dengan konsentrasi 5NG / mL, Anda harus take0.5mL standar pada 10ng / mL, tambahkan ke tabung EP dengan 0.5ml Referensi Standard & Pengencer Contoh, dan campuran it.Procedures untuk mempersiapkan konsentrasi tetap semua sama. Standar murni berfungsi sebagai standar tertinggi (10ng / mL). The Standard Reference & Sampel Pengencer berfungsi sebagai nol (0 ng / mL).

(Standar juga dapat diencerkan sesuai dengan jumlah yang sebenarnya, seperti 200μL / tabung)

Biotinylated Detection Ab - Hitung jumlah yang diperlukan sebelum percobaan (100μL / baik). Dalam persiapan yang sebenarnya, Anda harus mempersiapkan 100 ~ 200μL lebih. Centrifuge tabung saham sebelum digunakan, encerkan terkonsentrasi BiotinylatedDetection Ab untuk konsentrasi bekerja usingBiotinylated Deteksi AbDiluent (1: 100).

Concentrated HRP Conjugate - Hitung jumlah yang diperlukan sebelum percobaan (100μL / baik). Dalam persiapan yang sebenarnya, Anda harus mempersiapkan 100 ~ 200μL lebih. Mencairkan Konsentrat HRP Conjugate dengan konsentrasi bekerja menggunakan Konsentrat HRP ConjugateDiluent (1: 100).

Substrat Reagen: Karena sensitif terhadap cahaya dan kontaminan, sehingga Anda tidak harus membuka botol sampai Anda membutuhkannya! Dosis yang dibutuhkan reagen dapat disedot dengan tips disterilkan dan reagen sisa yang tidak terpakai tidak boleh dibuang kembali ke botol lagi.

Catatan: Harap tidak mempersiapkan reagen langsung dalam botol Pengencer yang disediakan dalam kit. Terkontaminasi air atau wadah untuk persiapan reagen akan mempengaruhi hasilnya. Prosedur cuci: 1. Automated Washer: Tambah 350μL cuci

penyangga ke masing-masing dengan baik, interval antara injeksi dan hisap harus mengatur tentang tahun 60-an. 2.

Washing Procedure::

1. Automated Washer: Tambah 350μL cuci penyangga ke masing-masing dengan baik, interval antara injeksi dan hisap harus mengatur tentang tahun 60-an.

2. Manual Wash : Tambah 350μLWash Buffer ke masing-masing dengan baik, rendam selama 1 ~ 2 menit. Setelah mencuci terakhir, tuang tersisa Wash Buffer dengan membalik piring dan blotting kering dengan rap itu tegas terhadap bersih dan handuk kertas penyerap pada permukaan yang keras.

PROSEDUR ASSAY

Bawa semua reagen dan sampel ke suhu kamar sebelum digunakan. Centrifuge sampel lagi setelah pencairan sebelum pengujian tersebut. Semua reagen harus dicampur secara menyeluruh dengan lembut berputar-putar sebelum pipetting.

Hindari berbusa. Ini direkomendasikan bahwa semua sampel dan standar akan diuji dalam rangkap dua.

1. Tambahkan Contoh: Tambahkan 100μL dari Standard, Blank, atau Sampel per sumur. Kosong juga ditambahkan dengan Standar Referensi & pengencer Sampel.

Solusi ditambahkan ke bawah lempeng ELISA mikro baik, menghindari menyentuh dinding dalam dan berbusa mungkin. Mencampurnya dengan lembut. Menutupi piring dengan sealer kami sediakan. Inkubasi selama 90 menit pada 37 ℃.

2. Biotinylated Deteksi Ab: Hapus cairan masing-masing dengan baik, tidak mencuci. Segera menambahkan 100μL dari Biotinylated Deteksi Ab solusi bekerja untuk masing-masing dengan baik. Tutup dengan sealer Lempeng. Tekan dengan lembut piring untuk memastikan menyeluruh pencampuran. Inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ° C.

3. Cuci: Aspirasi setiap baik dan mencuci, mengulangi proses tiga kali. Cuci dengan mengisi masing-masing dengan baik dengan Wash Buffer (sekitar 350μL) (botol semprot, multi-channel pipet, dispenser berjenis atau mesin cuci otomatis yang diperlukan). penghapusan lengkap cair pada setiap langkah sangat penting. Setelah mencuci terakhir, hapus tetap Wash Buffer oleh aspirating atau decanting.

Membalikkan piring dan tepuk melawan tebal kertas penyerap bersih.

4. HRP Conjugate: Tambahkan 100μL dari solusi HRP Conjugateworking untuk masing-masing dengan baik. Tutup dengan sealer Lempeng. Inkubasi selama 30 menit pada 37 ° C.

5. Cuci: Ulangi proses pencucian selama lima kali dilakukan pada langkah 3.

6. Substrat: Tambah 90μL dari Substrat Solusi untuk masing-masing dengan baik.

Tutup dengan sealer Lempeng baru. Inkubasi selama sekitar 15 menit pada suhu 37 ° C. Melindungi piring dari cahaya. Waktu reaksi dapat dipersingkat atau diperpanjang sesuai dengan perubahan warna yang sebenarnya, tetapi tidak lebih dari 30 menit.

Ketika gradien jelas muncul di sumur standar, pengguna harus mengakhiri reaksi.

7. Berhenti: Tambah 50μLof Stop Solution untuk setiap baik. Kemudian, warna berubah menjadi kuning segera. Perintah untuk menambahkan stop solution harus sama sebagai solusi substrat.

Dalam dokumen PDF Hubungan Antara Rasio Osteoprotegerin / Rank Ligand, Oligomeric ... - Unud (Halaman 85-178)