Kubis merupakan salah satu sayuran lokal dengan kandungan karbohidrat yang tinggi, sehingga dapat mendorong pertumbuhan bakteri asam laktat (BAL) selama fermentasi. Fermentasi kubis meningkatkan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat karena kandungan karbohidratnya yang tinggi.
Tujuan Penelitian
Dengan adanya informasi tersebut maka perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan isolat BAL yang memiliki aktivitas antibakteri dan mengidentifikasi isolat BAL tersebut dengan teknik PCR.
Urgensi Penelitian
Kubis (Brassica oleracea L.)
Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat menghasilkan beberapa komponen antimikroba yaitu asam organik, karbon dioksida, hidrogen peroksida, diasetil, reuterin dan bakteriosin (Suranto et al 2005). Kelompok bakteri ini tidak memecah protein, dan secara fermentasi dapat mengubah berbagai jenis karbohidrat menjadi asam laktat, sehingga disebut bakteri asam laktat.
Fermentasi Asam Laktat
PH optimum untuk BAL adalah sekitar 4 – 5, sehingga bakteri asam laktat dapat bersaing dengan bakteri lain terutama bakteri patogen yang memiliki pH optimum 7,2 – 7,6. Pangan yang terkontaminasi bakteri asam laktat akan rusak oleh asam tersebut dan menjadi busuk jika terkontaminasi juga dengan bakteri pembusuk (Surono, 2001).
Isolasi DNA
Fermentasi dapat dilakukan dengan kultur murni atau alami serta dengan kultur tunggal atau kultur campuran. Kultur murni merupakan mikroorganisme yang akan digunakan dalam fermentasi dengan sifat dan karakteristik yang diketahui secara pasti sehingga produk yang dihasilkan memiliki stabilitas mutu yang jelas.
Gen 16S rRNA
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Primer yang berada sebelum daerah target disebut primer maju dan primer yang berada setelah daerah target disebut primer mundur. Optimalisasi suhu annealing dimulai dengan menghitung suhu leleh (Tm) ikatan primer dan cetakan DNA, sedangkan suhu annealing (TA) 5 oC lebih rendah dari Tm primer sebenarnya.
Elektroforesis
Peningkatan jumlah siklus PCR melebihi 35 siklus tidak memberikan efek positif, seperti yang terlihat pada gambar di bawah ini (Fatchiyah et al 2011).
Road Map Penelitian
- Rancangan Penelitian
- Lokasi Penelitian
- Alat dan Bahan a. Alat penelitian
- Persiapan dan pengambilan sampel
- fermentasi kubis dan isolasi bakteri asam laktat
- Identifikasi Morfologi Bakteri Asam Laktat
- Uji Aktivitas Antibakteri
- isolasi DNA
- Amplifikasi Gen 16S rRNA
- Elektroforesis
- Sekuensing DNA
- Analisis Data Sequensing
- Fishbond Penelitian
Peralatan yang digunakan meliputi tabung reaksi, rak tabung reaksi, labu Erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, cawan petri, spatula, indikator pH, tabung mikrosentrifus, mikropipet (Neson), mikrotip, batang pengaduk, jarum Ose, pembakar Bunsen, autoklaf (Sentrifugal Hirayama 5), sentrifugal otoklaf (Hirayama-Hirayama), inkubator (Memmert), oven (Memmert), Laminar Air Flow (LAF), piring panas (Ake) bono), kapas, kain kasa, caliper, vortex, kol fermentasi. Kubis (Brassica oleracea var. capitata), Aqua destillata, NaCl 0,85%, NaCl 3%, alkohol 96%, alkohol 70%, kristal violet, larutan iodin, safranin, larutan buffer Tris-EDTA, Promega Kit, GoTaq Green Master Mix, Nucleropol 1%, gel agarosa Bebas Nukleropol (b/v), bakteri B acillus cereus, bakteri Shigella dysentriae, De Mann Ro gosa Sharpe Agar (MRSA) Medium, deMann Rogosa Sharpe Broth (MRSB), Muller Hinton Agar (MHA), Muller Hinton Broth (MHB), Nutrient Broth (NBNA), Nutrient Broth (NBNA). Irisan kubis dimasukkan ke dalam fermentor dan direndam dalam larutan garam 3% selama 3 hari dan ditutup rapat sampai pH ±4.
Kol fermentasi sebanyak 1 ml diambil secara aseptis kemudian dibuat pengenceran berantai dari 10-1 sampai 10-7 dalam larutan NaCl 0,85% steril kemudian divortex. Isolat bakteri asam laktat dibuat biakan stok dengan cara mengambil 1 os hasil biakan pada MRSB dan ditumbuhkan dalam 5 ml media miring MRSA, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam dan disimpan pada suhu 4 – 10 oC (Zubaidah 2009). Amplifikasi PCR dilakukan dengan volume sampel per reaksi 30 µL menggunakan primer 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGTCCAG- 3') dan 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3') (Jinbo 2008).
Reaksi PCR menggunakan PCR Thermal Cyclers (Bio-Rad, UK) dengan predenaturasi pertama pada suhu 94°C selama 90 detik, dilanjutkan dengan 30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik, primer annealing pada suhu 50°C selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 70°C selama 30 detik. Gel elektroforesis direndam dalam larutan etidium bromida (Sigma-Aldrich, USA) selama 15 menit di ruangan gelap. Analisis hasil sekuensing dilakukan dengan melakukan BLAST terhadap sekuens nukleotida hasil sekuensing gen 16S rRNA dengan database yang tersedia di website www.ncbi.nlm.nih.go.
Hasil Determinasi
Fementasi Kubis
Isolasi bakteri asam laktat dilakukan dengan cara menginokulasi 1 ml larutan hasil fermentasi ke dalam 9 ml larutan NaCl 0,85% hingga diperoleh pengenceran 10-1. Kemudian dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml untuk diinokulasikan ke dalam 9 ml larutan NaCl 0,85% untuk mendapatkan pengenceran 10-2, demikian seterusnya sampai diperoleh pengenceran 10-7. Pengenceran dilakukan untuk mengurangi kepadatan bakteri yang akan ditanam sehingga isolat bakteri yang tumbuh pada media MRSA tidak menumpuk dan lebih mudah dimurnikan.
Isolasi bakteri asam laktat dari kubis fermentasi dilakukan dengan menggunakan media MRSA yang merupakan media selektif untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Metode ini dipilih agar pertumbuhan bakteri lebih merata dan bakteri tidak menumpuk pada biakan MRSA. Pemilihan isolat tersebut dilihat berdasarkan morfologi bakteri asam laktat yaitu berbentuk bulat, cembung, berwarna putih dan bertepi bening.
Identifikasi Morfologi Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL)
Uji Aktivitas Antibakteri Bakteri Asam Laktat
Hasil uji aktivitas antibakteri bakteri asam laktat dapat diamati berdasarkan zona bening yang terbentuk di sekitar diskus intervertebralis. Zona bening yang terbentuk menunjukkan bahwa bakteri asam laktat memiliki efek penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji yang digunakan yaitu Bacillus cereus bakteri positif dan Shigella dysentriae bakteri negatif (Lampiran 5 dan 6). Berdasarkan Tabel 1 dan 2 terlihat bahwa isolat bakteri asam laktat memiliki daya hambat yang relatif sedang hingga kuat terhadap bakteri Bacillus cereus yang merupakan bakteri positif dan Shigella dysenteriae yang merupakan bakteri negatif.
Pada penelitian ini, hasil uji aktivitas antibakteri bakteri asam laktat dari kubis fermentasi memiliki daya hambat yang lebih besar terhadap bakteri Shigella dysenteriae dibandingkan daya hambatnya terhadap bakteri Bacillus cereus. Menurut Alakoni tahun 2000, tingginya daya hambat bakteri gram negatif diduga disebabkan oleh senyawa antibakteri berupa asam organik yaitu asam laktat dan asam asetat. Asam laktat mampu merusak permeabilitas bakteri gram negatif dengan merusak membran luar bakteri gram negatif.
Asam laktat adalah molekul yang larut dalam air yang memungkinkannya menembus periplasma bakteri gram negatif pada membran luar. Asam laktat akan merusak permeabilitas membran luar pelindung, yaitu lapisan lipopolisakarida (LPS) yang terletak di permukaan membran. Oleh karena itu, dipilih isolat K32 untuk selanjutnya dilakukan pengujian dengan metode PCR untuk mengetahui jenis isolat bakteri K32 yang memiliki aktivitas antibakteri paling tinggi terhadap bakteri Bacillus cereus dan Shigella dysenteriae.
Isolasi DNA Bakteri Asam Laktat
Kerusakan pada membran sel luar menyebabkan senyawa antimikroba lainnya, termasuk diasetil, hidrogen peroksida, dan bakteriosin, memasuki membran sitoplasma dan merusak aktivitas intraseluler, yang pada akhirnya dapat membunuh sel. Isolasi DNA bakteri menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit yang terdiri dari beberapa reagen yaitu larutan lisis nuklear, larutan RNAse, larutan presipitasi protein, isopropanol, lisozim, EDTA, dan larutan rehidrasi DNA. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan zat menurut berat molekul dengan menggunakan gaya sentrifugal, sehingga zat yang lebih berat akan berada di bawah dan zat yang lebih ringan akan berada di atas.
Pelet sel diambil dan ditambahkan ke dalam EDTA yang bekerja merusak dinding sel secara kimiawi dengan mengikat ion magnesium yang akan merusak asam nukleat (Muladno 2002). Penambahan Nuclei Lysis Solution bekerja melisiskan sel dan nukleus dengan cara membentuk ikatan kimia pada membran sel. Penambahan isopopanol pada supernatan berperan membentuk untaian DNA sehingga terjadi presipitasi DNA.
Isopropanol bekerja dengan menurunkan aktivitas molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan mengendap. DNA Ladder Lane 1 kb Hasil elektroforesis yang dilakukan menunjukkan bahwa DNA genomik isolat K32 dari kubis fermentasi menunjukkan hasil positif. Pita DNA genom pada Gambar 1 memiliki ukuran lebih dari 10.000 bp, DNA genom memiliki ukuran molekul yang relatif besar karena terdiri dari semua gen yang dikandungnya.
Amplifikasi DNA Genom dengan PCR
Proses amplifikasi PCR terdiri dari 3 langkah utama yaitu denaturasi, penempelan primer dan pemanjangan pita DNA. Predenaturasi dilakukan pada suhu 94°C selama 90 detik kemudian dilanjutkan dengan tahap denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik. Langkah denaturasi yang tidak lengkap dapat mengakibatkan re-double stranding DNA dan mengakibatkan kegagalan proses PCR.
Tahap selanjutnya adalah tahap annealing yaitu tahap perlekatan primer yang bertujuan untuk memberikan waktu primer berikatan dengan daerah target DNA. Tahap selanjutnya adalah proses pemanjangan untai DNA, yang bertujuan untuk memperpanjang ikatan DNA yang telah difiksasi oleh primer. Proses denaturasi, pengikatan primer dan pemanjangan pita berlangsung selama 30 siklus dengan tujuan menggandakan amplikon.
Smear adalah molekul dengan berat berbeda yang mungkin berasal dari DNA terdegradasi atau produk sampingan lain yang tidak diketahui (Herison 2003). Smear menunjukkan bahwa DNA genom yang diisolasi tidak lagi utuh, mungkin terfragmentasi selama ekstraksi (Sisharmini et al. 2001). Amplikon yang telah dielektroforesis diberi label dan dikemas dalam parafilm untuk mencegah kebocoran saat mengirimkan sampel untuk pengurutan nukleotida.
Analisis Data Sekuensing
Program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) berguna untuk mencari kesamaan antara sekuens DNA atau protein yang ingin diketahui dengan database sekuens lain yang tersedia di GenBank (Bedell et al 2003). Hasil menunjukkan bahwa isolat bakteri K32 dari kubis fermentasi memiliki urutan basa nukleotida yang mirip dengan nilai query coverage 99% dengan Lactobacillus buchneri. Cakupan kueri adalah persentase panjang nukleotida yang disejajarkan dengan database yang terdapat dalam BLAST.
Simpulan
Saran
Dampak analisis sekuens gen 16S rRNA untuk identifikasi bakteri pada mikrobiologi klinis dan penyakit menular. Kajian kemampuan Lactobacillus casei dalam produksi asam laktat dari tetes tebu pada limbah cair tebu menggunakan sistem kultur batch. Peran Bakteri Asam Laktat (Lactobacillus Plantarum) Terhadap Umur Simpan Fillet Ikan Nila Merah Pada Suhu Rendah.
Isolasi, karakterisasi dan identifikasi DNA bakteri asam laktat (BAL) yang berpotensi sebagai agen antimikroba dari fermentasi buah markisa kuning (Passiflora edulis var. flavicarpa). Aktivitas antimikroba bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi dari feses orangutan (Pongo pygmaeus) terhadap penghambatan pertumbuhan bakteri enterik patogen secara in vitro. Isolasi bakteri asam laktat dari kubis yang memiliki kemampuan untuk menghambat bakteri patogen (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli dan Salmonella thypimurium).
Hasil uji aktivitas antibakteri bakteri asam laktat kubis fermentasi (Brassica oleracea L.) terhadap bakteri Bacillus cereus. Hasil uji aktivitas antibakteri bakteri asam laktat dari kubis fermentasi (Brassica oleracea L.) terhadap bakteri Shigella dysentriae.
