UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

(1)

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN KARAKTERISASI

BAKTERI ASAM LAKTAT DARI LIMBAH CAIR RENDAMAN KACANG KEDELAI

SKRIPSI

ZAKIYAH ZAHRA NUR AMALIAH 1112102000026

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

AGUSTUS 2016

(2)

ii

ISOLASI DAN KARAKTERISASI

BAKTERI ASAM LAKTAT DARI LIMBAH CAIR RENDAMAN KACANG KEDELAI

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

ZAKIYAH ZAHRA NUR AMALIAH 1112102000026

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

AGUSTUS 2016

(3)

iii

(4)

iv

(5)

v

(6)

vi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Nama : Zakiyah Zahra Nur Amaliah Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Limbah Cair Rendaman Kacang Kedelai

Tempe adalah makanan tradisional Indonesia, dimana dalam pembuatannya terdapat limbah cair yang tidak dimanfaatkan kembali yaitu air rendaman kedelai. Bakteri Asam Laktat (BAL) diketahui terdapat pada setiap tahap pembuatan tempe termasuk pada saat perendaman kedelai. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi BAL yang terdapat pada limbah cair air rendaman kacang kedelai. Setelah dilakukan pengenceran sampai 10^-7, limbah cair air rendaman kacang kedelai diinokulasikan ke dalam MRSA tersuplementasi CaCO3 1%. Diperoleh delapan isolat dengan zona bening disekitar koloninya dengan morfologi koloni berbeda-beda yang diduga sebagai BAL. Kemudian dilakukan karakterisasi morfologi, biokimia, serta fisologi.

Kedelapan isolat memiliki karakteristik tidak membentuk spora, non motil, katalase negatif, dapat tumbuh pada suhu 37° dan 45°C serta NaCl konsentrasi 4%

dan 6,5%. Hasil dari uji keamanan menunjukkan kedelapan isolat negatif untuk uji aktivitas hemolisis. Tujuh dari delapan isolat merupakan Gram positif, sedangkan satu adalah Gram negatif. Tetapi hanya bakteri Gram positif yang dipilih karena memenuhi karakteristik BAL. Tujuh isolat yang memenuhi persyaratan BAL, diduga termasuk ke dalam genus Lactobacillus dengan tipe fermentasi heterofermentatif. Pada penelitian ini digunakan Lactobacillus casei ATCC 393 sebagai strain acuan.

Kata Kunci: Air rendaman kacang kedelai, bakteri asam laktat, isolasi, karakterisasi

(7)

vii

ABSTRACT

Name : Zakiyah Zahra Nur Amaliah Major : Pharmacy

Title : Isolation and Characterization Lactic Acid Bacteria from Soybean Soaking Water Liquid Waste

Tempeh is an Indonesia traditional food, which in the manufacturers have a liquid waste that no use again namely soybean soaking water. Lactic Acid Bacteria (LAB) has been known at every stage of tempeh production, included at soaking soybeans. This study aimed to isolate and characterize LAB contained in soybean soaking water liquid waste. After serial dilution to 10^-7, soybean soaking water liquid waste was inoculated on the MRSA contained 1% CaCO3. After incubation, there are 8 isolates which produce clear zone around their colonies with different colony morphology suspected as LAB. Morphological, physiological and biochemical characteristics were employed to identify LAB. All isolates were non-spore forming, non-motile, catalase negative, grow well at 37°

and 45°C, could be able to grow in the presence of 4% and 6.5% sodium chloride.

The results of safety test showed all isolates negative for hemolytic activity. Seven of eight isolates are Gram-positive, while one is a Gram-negative. But only Gram- positive were chosen as they represent the LAB characteristic. Seven isolates were identified as Lactobacillus with heterofermentative as the type fermentation. In this study, Lactobacillus casei ATCC 393 used as reference strain.

Keywords: Characterization, isolation, lactic acid bacteria, soybean soaking water

(8)

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji dan syukur kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat, dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan menyusun skripsi ini. Shalawat serta salam senantiasa penulis curahkan kepada Nabi Besar Muhammad SAW beserta keluarga, para sahabat serta para pengikut di jalan yang diridhoi-Nya.

Skripsi yang berjudul “Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Limbah Cair Rendaman Kacang Kedelai” disusun dalam rangka memenuhi persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Penulis menyadari bahwa dalam penelitian sampai penyusunan skripsi ini tidak akan terwujud tanpa adanya bantuan, bimbingan, dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis tidak lupa mengucapkan terima kasih banyak kepada:

1. Dr. Arief Sumantri, S. KM., M. Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si, Apt selaku Ketua dan Ibu Nelly Suryani, Ph.D, Apt selaku Sekretaris Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Ibu Puteri Amelia, M. Farm., Apt selaku pembimbing I dan bapak Saiful Bahri, M. Si selaku pembimbing II yang telah tulus ikhlas membimbing, memberi masukan, ilmu, nasihat, serta semangat kepada penulis.

4. Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt. selaku dosen penasehat akademik yang telah membimbing dan banyak membantu penulis dari awal perkuliahan.

5. Seluruh dosen Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta atas ilmu yang telah diberikan selama penulis menempuh pendidikan.

6. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Muhammad Yazid dan Ibunda Ida Farida yang selalu memberikan dukungan baik moril maupun materil, semangat, kasih sayang, dan doa yang tidak ada hentinya mengiringi setiap langkah penulis.

7. Adik-adik tersayang Putra Faris Syafiq Yasir dan Nawra Nurkamila Ghaniya, serta seluruh keluarga besar atas semangat, dukungan, dan doa kepada penulis.

8. Teman yang selalu mendengarkan keluh kesah, mendampingi, dan memberi semangat dalam menyelesaikan penelitian ini, Teungku Ahmad Shalahuddin.

9. Sahabat seperjuangan sejak putih abu-abu yang selalu menjadi tempat berbagi tangis dan tawa, Anindita Putri Hariyani Wimala dan Amanda Terrena Putri yang juga sedang menyelesaikan tesisnya.

(9)

ix

10. Kawan seperjuangan penelitian, Santi Susilawati atas bantuan, kesabaran, masukan, dan semangat dalam menyelesaikan penelitian ini.

11. Azmi, Moethia, Afina, Endang, Risha, Nisa Utami, Annissa Fadillah, Dian Aulia, Ade Rachma, Fenny, Nurul, Putri Wulandari, Khorunnisak, Dwi Putri, Rakha, Gadis, Safizah, Apriliana Nur, Vesty yang telah memberi semangat dan bantuan baik selama perkuliahan maupun penelitian hingga skripsi ini dapat selesai.

12. Laila, Ummi Habibah, Wida, Lilis, Eha, Noni, Zulfa, Vano, dan teman-teman mikrobiologi lainnya, terima kasih atas kerja sama serta suka duka selama penelitian berlangsung.

13. Laboran Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Mba Rani, Kak Tiwi, Kak Lisna, Kak Eris, Kak Walid, Kak Yaenap, dan Kak Rahmadi serta Mba Puji laboran PLT yang banyak membantu selama penulis melakukan penelitian.

14. Keluarga besar pengurus HMPS Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta periode 2014-2015 atas pengalaman dan pelajaran kepada penulis.

15. Teman-teman Farmasi 2012 khususnya kelas AC atas kebersamaan, suka duka, dan motivasi selama perkuliahan.

16. Seluruh pihak yang telah banyak membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini baik secara langsung maupun tidak langsung yang namanya tak dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna dan banyak kekurangan. Oleh karena itu saran serta kritik yang membangun sangat diharapkan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan pada umumnya dan bagi ilmu farmasi pada khususnya. Amin Ya Robbal’alamin.

Jakarta, Agustus 2016

Penulis

(10)

x

(11)

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PERSYARATAN ORISINALITAS ... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ... v

ABSTRAK ... vi

ABSTRACT ... vii

KATA PENGANTAR ... viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ... x

DAFTAR ISI ... xi

DAFTAR TABEL ... xiii

DAFTAR GAMBAR ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xv

BAB I. PENDAHULUAN ... 1

1.1. Latar Belakang ... 1

1.2. Rumusan Masalah ... 3

1.3. Tujuan Penelitian ... 3

1.4. Manfaat Penelitian ... 3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 4

2.1. Probiotik ... 4

2.2. Strain Bakteri Asam Laktat ... 5

2.3. Efek Menguntungkan Probiotik ... 7

2.4. Metabolisme Bakteri Asam Laktat ... 11

2.5. Produksi Asam Organik ... 14

2.6. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme ... 15

2.7. Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme ... 16

2.7.1. Pengukuran Pertumbuhan Mikroba Secara Langsung ... 16

2.7.2. Pengukuran Pertumbuhan Mikroba Secara Tidak Langsung ... 17

BAB III. METODE PENELITIAN ... 18

3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian ... 18

3.2. Alat dan Bahan ... 18

3.2.1. Alat ... 18

3.2.2. Bahan ... 18

3.3. Prosedur Kerja ... 18

3.3.1. Persiapan Alat dan Bahan yang Digunakan ... 18

3.3.1.1. Preparasi Alat ... 18

3.3.1.2. Preparasi Sampel ... 19

3.3.1.3. Pembuatan Medium MRSA (de Man Rogosa Sharpe Agar) 19 3.3.2. Isolasi Bakteri Asam Laktat ... 19

3.3.3. Pemurnian ... 20

3.3.4. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat ... 20

3.3.4.1. Pengamatan Morfologi Bakteri Asam Laktat ... 20

3.3.4.2. Pengamatan Fisiologi dan Biokimia Bakteri Asam Laktat .. 21

3.3.5. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat ... 21

(12)

xii

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 22

4.1. Hasil ... 22

4.1.1. Isolasi Bakteri Asam Laktat ... 22

4.1.2. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat ... 22

4.1.2.1. Morfologi Isolat Bakteri Asam Laktat ... 23

4.1.2.2. Fisiologi dan Biokimia Isolat Bakteri Asam Laktat ... 23

4.1.3. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat ... 23

4.4 Pembahasan ... 24

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 36

5.1. Kesimpulan ... 36

5.2. Saran ... 36

DAFTAR PUSTAKA ... 37

LAMPIRAN ... 42

(13)

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Mikroorganisme Probiotik ... 7

Tabel 4.1 Morfologi Koloni Isolat ... 22

Tabel 4.2 Karakteristik Isolat BAL dan Strain Acuan ... 24

Tabel 4.3 Identifikasi Tingkat Genus (Generic Assignment) ... 33

(14)

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Jalur Metabolisme Homofermentatif ... 12

Gambar 2.2 Jalur Metabolisme Heterofermentatif ... 13

Gambar 4.1 Hasil Isolasi BAL ... 25

Gambar 4.2 Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel Bakteri ... 26

Gambar 4.3 Hasil Pewarnaan Endospora ... 27

Gambar 4.4 Hasil Uji Motilitas ... 28

Gambar 4.5 Hasil Uji Katalase ... 29

Gambar 4.6 Hasil Uji Produksi Gas ... 30

Gambar 4.7 Hasil Uji Aktivitas Hemolisis ... 34

(15)

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Alur Penelitian ... 42

Lampiran 2. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Agar ... 43

Lampiran 3. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Broth ... 45

Lampiran 4. Hasil Isolasi BAL dari Limbah Cair Tempe ... 46

Lampiran 5. Hasil Perhitungan Total Plate Count (TPC) ... 47

Lampiran 6. Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel ... 48

Lampiran 7. Hasil Pewarnaan Endospora ... 49

Lampiran 8. Hasil Uji Katalase ... 50

Lampiran 9. Hasil Uji Motilitas ... 51

Lampiran 10. Hasil Uji Produksi Gas ... 52

Lampiran 11. Hasil Uji Ketahanan Suhu ... 53

Lampiran 12. Hasil Uji Ketahanan NaCl ... 55

Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Hemolisis ... 57

Lampiran 14. Alat dan Bahan yang Digunakan ... 58

(16)

1

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Proses fermentasi merupakan salah satu metode pengawetan yang dapat dideskripsikan sebagai suatu proses perubahan secara biokimia pada bahan pangan oleh aktivitas mikroorganisme (Hidayat dan Sri, 2006). Fermentasi telah digunakan secara luas oleh masyarakat tidak hanya untuk mengawetkan pangan, tetapi juga digunakan untuk memproduksi berbagai produk pangan yang diinginkan dari susu, daging, ikan, telur, biji-bijian, buah, dan sayuran.

Fermentasi pangan melibatkan proses konversi bahan dasar menjadi pangan fermentasi, oleh pertumbuhan dan aktivitas metabolisme mikroorganisme yang diinginkan. Mikroorganisme tersebut memanfaatkan beberapa komponen bahan dasar pangan sebagai substrat untuk menghasilkan energi dan komponen seluler, meningkatkan populasi, dan menghasilkan beberapa produk yang tidak digunakan sebagai produk akhir yang disekresikan ke lingkungan. Proses fermentasi dapat meningkatkan nilai gizi bahan yang berkualitas rendah, yang merupakan suatu cara untuk menghilangkan zat antinutrisi dan racun yang terkandung dalam suatu bahan makanan (Sopandi dan Wardah, 2014).

Sejak ditemukannya teknologi fermentasi pangan, produk hasil fermentasi tidak hanya mempunyai daya awet yang tinggi dengan kualitas sesuai dengan yang diharapkan, tetapi juga mempunyai efek menyehatkan khususnya terhadap kesehatan saluran cerna (Sopandi dan Wardah, 2014). Saluran pencernaan manusia mengandung lebih dari 10 x 10¹⁴ mikroorganisme yang berpengaruh terhadap kesehatan manusia, sebab aktif melakukan bermacam-macam metabolisme. Sekitar 1.000 spesies bakteri terdapat dalam saluran pencernaan (Ray, 2004). Berbagai kompartemen dalam saluran pencernaan dihuni oleh populasi mikroorganisme. Dalam usus besar terdapat populasi dominan yang penting dan dapat bersimbiosis secara baik dengan inang, sehingga berperan penting dalam kesehatan (Roberfroid, et al., 2010).

Probiotik merupakan mikroorganisme yang bila dikonsumsi per oral akan memberikan dampak positif bagi kesehatan manusia (Firmansyah, 2001). Bakteri

(17)

2

probiotik dapat menghasilkan berbagai macam senyawa seperti asam laktat, asam asetat, bakteriosin, dan reuterin yang dapat menghambat pertumbuhan patogen.

Asam organik (asam laktat dan asam asetat) tersebut berfungsi menurunkan pH sehingga mempengaruhi pertumbuhan patogen serta menjadi racun untuk mikroba (Sopandi dan Wardah, 2014). Secara tradisional, Bakteri Asam Laktat (BAL) digunakan sebagai probiotik.

Pangan yang diperoleh dari proses fermentasi banyak berasal dari biji- bijian, salah satu diantaranya kacang kedelai yang banyak digunakan sebagai bahan dasar dari pangan fermentasi seperti tempe, kecap, dan tauco. Tempe adalah makanan hasil fermentasi tradisional Indonesia yang telah mendunia, dimana telah banyak berada di luaran sebab kandungannya yang sangat bagus untuk kesehatan. Banyak penelitian dan review telah dilakukan mengenai tempe serta keberadaan dari BAL pada tempe pun telah dilaporkan (Kormin, et al., 2001;

Moreno, et al., 2002). Seperti yang telah dipaparkan diatas, BAL memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan patogen saat proses fermentasi tempe.

Pada tahun 2013, Pisol, et al. mengisolasi BAL dari tempe, dimana dilakukan tidak hanya pada produk tempe namun pada tiap langkah pembuatan tempe. Didapatkan hasil kandungan BAL tertinggi terdapat pada air rendaman kedelai, yakni Lactobacillus heterofermentatif. Pada tahun 2015, Pisol, et al.

melakukan isolasi BAL kembali namun didapatkan hasil yang berbeda, dimana pada air rendaman diisolasi Enterococcus faecium, Leuconostoc lactis, serta Leuconostoc sp.

Pada proses pembuatan tempe di pabrik, dilakukan terlebih dahulu perebusan kacang kedelai lalu didiamkan selama semalaman, setelah itu baru dilakukan proses pembuatan tempe selanjutnya. Air rendaman tersebut biasanya tidak digunakan kembali sehingga akan dibuang begitu saja atau terkadang digunakan juga sebagai pakan cair ternak.

Melihat ketersediaannya yang banyak serta tidak dimanfaatkan kembali, air rendaman kedelai tersebut atau limbah cair ini dapat diteliti lebih lanjut mengenai kandungan BAL didalamnya. Dari hasil penelitian sebelumnya yang menyatakan hasil isolasi BAL yang berbeda juga dapat mendasari penelitian ini.

(18)

Apakah akan didapatkan isolat yang berbeda pula, mengingat tempat pengambilan sampel yang juga berbeda. Berdasarkan uraian diatas, maka dapat dilakukan isolasi dan identifikasi BAL dari limbah cair rendaman kedelai pada produsen tempe.

1.2. Rumusan Masalah

1. Apakah isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) dapat diperoleh dari limbah cair rendaman kacang kedelai?

2. Bagaimanakah karakteristik isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) yang telah diperoleh dari limbah cair rendaman kacang kedelai?

1.3. Tujuan Penelitian

1. Untuk memperoleh isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) dari limbah cair rendaman kacang kedelai.

2. Untuk mengetahui karakteristik Bakteri Asam Laktat (BAL) yang diperoleh dari limbah cair rendaman kacang kedelai.

1.4. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi mengenai keberadaan dan karakteristik Bakteri Asam Laktat (BAL) dari limbah cair rendaman kacang kedelai pada produsen tempe.

(19)

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Probiotik

Istilah probiotik berasal dari bahasa Yunani, yang berarti ―untuk kehidupan‖. Para ahli dari Food and Agriculture Organization (FAO) dan World Health Organization (WHO) mendefinisikan probiotik sebagai mikroorganisme yang hidup, dimana saat diadministrasikan dalam jumlah yang adekuat akan memberikan keuntungan di sisi kesehatan pada host-nya. Berdasarkan definisi tersebut, probiotik tidak seharusnya ditunjuk sebagai agen bioterapeutik (Reid, et al., 2003).

Probiotik adalah spesies mikroba yang dikonsumsi dengan tujuan mengubah flora gastrointestinal, dimana akan memberikan manfaat untuk kesehatan. Penggunaan mikroba dimulai secara tidak sengaja berabad-abad yang lalu ketika orang mencatat pertama kalinya terdapat efek menguntungkan untuk kesehatan dari mengkonsumsi makanan fermentasi (Gogineni, et al., 2013).

Probiotik memiliki sejarah yang panjang, dimulai dari pencatatan pertama dikonsumsinya minuman berbakteri oleh manusia yakni lebih dari 2000 tahun yang lalu. Awal dari peradaban probiotik ditetapkan secara ilmiah oleh Metchnikoff pada Pasteur Institue di Paris. Metchnikoff (1907) mengamati umur petani Bulgarian yang panjang dan dihubungkan dengan tingginya konsumsi susu asam. Selama penelitian ini, beliau berhipotesis bahwa mikroflora normal usus dapat memberikan efek samping pada host dan konsumsi beberapa bakteri dapat memberikan efek sebaliknya. Metchnikoff melakukan pengobatan dengan menggunakan sesuatu yang sekarang ini dikenal sebagai Lactobacillus delbruckeii subsp. bulgaricus yang dimana dengan Streptococcus salivarius subsp.

thermopillus digunakan untuk memfermentasi susu pada produksi yogurt tradisional (Desai, 2008).

Penelitian selanjutnya dilakukan langsung dengan bakteri yang diisolasi dari usus sebagai probiotik. Setelah itu banyak spesies mikroorganisme yang digunakan, yaitu bakteri yang memproduksi asam laktat (lactobacilli, streptococci, enterococci, lactococci, bifidobacteria) dan juga Bacillus spp. serta fungi seperti

(20)

Saccharomyces spp. dan Aspergillus spp (Desai, 2008). Bakteri asam laktat (BAL), bakteri non-asam laktat, dan jamur dapat dikatakan sebagai probiotik.

Bakteri asam laktat merupakan probiotik yang paling penting dan paling memberikan efek yang menguntukan terhadap saluran pencernaan manusia (Holzapfel, et al., 2001). Berdasarkan Guidelines on Probiotics and Prebiotics, karakteristik probiotik dapat dijelaskan sebagai berikut (Malago, et al., 2011):

1. Tidak kehilangan sifat aslinya selama masa penyimpanan.

2. Secara normal berada di saluran pencernaan manusia.

3. Harus dapat bertahan hidup, dapat melawan pertahanan barrier lambung, tahan terhadap kerja pencernaan dari getah lambung, enzim pencernaan, dan garam empedu, serta harus berkoloni di dalam usus.

4. Harus bisa melekat dan berkoloni dengan sel intestinal. Struktur membran bakteri berperan dalam mekanisme perlekatan dan berpasangan langsung dengan mukosa, permukaan protein, dan mungkin dengan beberapa lainnya yang berlendir.

5. Harus menimbulkan fungsi metabolik pada pencernaan, yang bermanfaat bagi kesehatan manusia, dan antagonis mikroorganisme patogen dengan memproduksi zat anti-mikroba.

6. Tidak boleh menyebabkan reaksi berbahaya dan aman terhadap sistem imun (dinyatakan aman atau status GRAS).

7. Resistensi terhadap antibiotik.

8. Harus dikelola dalam dosis yang adekuat dan memiliki rasio efikasi biaya yang tepat dan seimbang.

2.2. Strain Bakteri Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri yang termasuk dalam filum Firmicute. Bakteri yang termasuk dalam kelompok ini adalah Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus dan Weissella (Jay, 1992). Kelompok bakteri ini termasuk bakteri Gram positif, tidak berspora, tidak berpigmen mesofil, serta

(21)

6

berbentuk kokus dan batang. Bakteri ini dapat hidup pada temperatur antara 5- 50ºC dan bersifat katalase negatif (Perry, et al., 1997).

Nama bakteri asam laktat diperoleh dari kemampuannya dalam memfermentasi gula menjadi asam laktat. Bakteri asam laktat juga terdapat dalam tubuh manusia sebagai flora normal tubuh (Prescott, et al., 2002). Bakteri yang termasuk ke dalam Bifidobacterium dan Lactobacillus secara luas digunakan sebagai probiotik, dimana terbagi menjadi dua kelompok yakni yang berasal dari usus dan vagina. Bifidobacteria merupakan kelompok penting dalam kultur probiotik yang biasanya digunakan dalam produk olahan susu fermentasi.

Bifidobacterium adalah bakteri Gram positif, anaerobik, tidak motil, dan tidak dapat membentuk spora. Mereka mungkin memiliki beberapa bentuk, seperti batang yang melengkung pendek, batang berbentuk stik, dan batang berbentuk Y.

Untuk pertumbuhan Bifidobacteria, pH optimumya adalah 6,0-7,0 dan tidak akan tumbuh pada pH kurang dari 4,5 dan lebih dari 8,5. Temperatur optimum untuk tumbuh 37-41°C, minimum 25-28°C, dan maksimum 43-45°C. Kultur Bifidobacterium yang digunakan sebagai probiotik diantaranya B. adolescentis, B.

longum, B. infantis,dan B. breve (Ozyurt, et al., 2014).

Bakteri asam laktat (BAL) biasanya dideskripsikan sebagai mikroorganisme Gram positif, tidak memiliki sitokrom, menyukai keadaan anaerob tetapi aerotolerant, tahan asam, dan dapat menyebabkan peragian. Genus yang sangat penting saat ini diantaranya: Lactobacillus, Lactococcus, Enterocococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, dan Bifidobacterium (Ozyurt, et al., 2014)

Pertumbuhan dari L. acidophilus terjadi pada temperatur 45°C, atau optimum antara 35 dan 40°C. Organisme ini akan tumbuh pada media yang sedikit asam yaitu pada pH 6,4-4,5, tetapi pertumbuhan akan terhenti pada pH 4,0- 3,6, dengan pH optimum 5,5-6,0. L. rhamnosus adalah BAL dengan kemampuan probiotik. Aktivitas petumbuhan BAL dipengaruhi oleh kondisi fermentasi, seperti pH, temperatur, komposisi medium, dan faktor lainnya (Ozyurt, et al., 2014).

(22)

Tabel 2.1 Mikroorganisme Probiotik

Spesies Lactobacillus Spesies Bifidobacterium L. acidophilus

L. amylovorus L. casei

L. crispatus L. delbrueckii

subsp. Bulgaricus L. gallinarum

L. gasseri L. johnsonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus

B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. longum

BAL lainnya Non BAL

Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Lactococcus lactis

Leuconstoc mesenteroides Pediococcus acidilactici Sporolactobacillus inulinus Streptococcus thermophilus

Bacillus cereus var. toyoi Escherichia coli strain nissle Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces boulardii

(Sumber: Holzapfel, et al., 2001)

2.3. Efek Menguntungkan Bakteri Asam Laktat

Dalam beberapa tahun terakhir berbagai aplikasi dari produk farmaseutikal dan medisinal telah diidentifikasi, dan probiotik diselidiki lebih lanjut mengenai efek menguntungkannya untuk kesehatan. Pada dasarnya karakteristik mikroba berbeda-beda, berbagai bentuk formulasi telah dikembangkan untuk kondisi klinis yang berbeda-beda pula. Dimana spesies

(23)

8

dengan karakteristik yang beragam diindikasikan untuk kondisi klinis yang berbeda (Aron, et al., 2015).

Efek menguntungkan dari mengkonsumsi sel hidup adalah kemampuan sel hidup bakteri yang dapat memberi perlindungan terhadap patogen enterik, memberi enzim yang membantu proses metabolisme beberapa nutrisi pangan seperti laktase yang menghidrolisis laktosa, detoksifikasi komponen pangan yang merugikan, menstimulasi sistem imun, dan mengembangkan aktivitas peristaltik usus. Keuntungan lain dari mengkonsumsi sel hidup bakteri yakni hidrolisis laktosa dan penurunan kadar kolesterol serum, kanker kolon, gangguan usus, penyakit alergi, serta modulasi respon imun (Sopandi dan Wardah, 2014).

Berdasarkan karakteristik mikroba, spesies, dan formulasi yang berbeda- beda, probiotik dapat digunakan diantaranya untuk kondisi sebagai berikut:

a. Penyakit kulit

Kulit adalah organ terluas dan yang kontak langsung dengan lingkungan luar, dimana secara konstan terekspos dengan mikroorganisme dan bisa menjadi tempat hidupnya. Mikroba tersebut dapat berinteraksi dengan mikroba lainnya, sel manusia, serta sistem imun sel yang bisa menimbulkan resiko penyakit kulit seperti jerawat, dermatitis atropik, dan eczema. Salah satu dari efek menguntungkan probiotik adalah menekan inflamasi pada jerawat. Setelah mengkonsumsi Lactobacillus spp. selama 12 minggu, pasien mengalami kemajuan yang signifikan ditinjau dari lesi pada jerawat. Begitu pula pada penggunaan L. plantarum, B. lactis Bb-12, dan L. rhamnosus GG (LGG) dalam pengobatan dermatitis atropik (Aron, et al., 2015).

b. Penyakit saluran cerna

Berbagai penyakit dapat terjadi saluran cerna mulai dari ulser peptic, diare, konstipasi, dan lain-lain. Beberapa strain BAL dapat mengontrol infeksi H.

pylori (penyebab ulser peptik) jika diberikan bersamaan dengan perawatan medis (Iqbal, et al., 2014). Strain tertentu dari Lactobacillus dan Bifidobacterium secara in vitro memiliki efek melawan H. pylori melalui pelepasan bakteriosin atau produksi asam organik, dan/atau menghambat adhesi ke sel epitel (Vandenplas, et al., 2014). Probiotik juga diketahui dapat menjadi agen pencahar dengan cara memodulasi flora normal usus dan mempengaruhi fungsi utama usus yaitu

(24)

motilitas usus. Modulasi flora normal usus juga mengubah aktivitas metabolisme usus, seperti produksi gas dan asam lemak rantai pendek. Dimana asam lemak rantai pendek ini mempunyai korelasi dengan waktu transit usus (Lee dan Salminen, 2009 dalam Utami, 2013).

c. Kanker

Probiotik memainkan peran protektif dalam mengikat dan/atau degradasi karsinogen, awalnya ini didapat dari tipe diet barat, banyak dalam daging merah yang dipanggang. Banyak penelitian dalam mencit mengindikasikan bahwa penggunaan beberapa lactobacilli mengurangi ambilan kembali mutagen oleh jaringan berbeda. Setelah dilakukan pengamatan dengan manusia, menunjukkan konsumsi olahan yang mengandung lactobacilli dapat mengurangi ekskresi senyawa mutagen baik pada urin maupun pada feses (Aron, et al., 2015).

Dari hasil uji in vitro dan in vivo, baik pada hewan uji maupun uji klinis pada manusia, B. lactis Bb12 dan Lb. rhamnosus GG dan kombinasi keduanya (sinbiotik) diinkubasi dengan campuran prebiotik oligofruktosa dan inulin.

Supernatan dari fermentasi mengandung kuantitas yang besar dari butirat dan ditempatkan dalam tabung dengan sel kanker HT2 manusia. Sel tumor yang masih hidup kondisinya lemah dan proliferasi sel dihambat. Tikus dengan kanker kolon dan diberi makan dengan inulin tipe fruktan menunjukkan penurunan insiden kanker kolon. Manusia dengan polip pada kolon yang diberikan regimen sinbiotik menunjukkan penurunan yang nyata pada sel DNA yang rusak (Aron, et al., 2015).

d. Penurunan kadar kolestrol serum

Konsumsi susu yang mengandung mikroorganisme dan konsumsi sel hidup bakteri dalam jumlah tinggi yang menguntungkan usus, diketahui berkaitan dengan kadar kolestrol serum yang rendah pada manusia. Penurunan kadar kolestrol tersebut diduga disebabkan oleh dua faktor. Faktor pertama, kemampuan beberapa Lactobacillus dalam usus untuk memetabollisme kolestrol yang berasal dari pangan, sehingga mengurangi jumlah kolestrol yang diabsorpsi dalam darah.

Dan faktor kedua, beberapa Lactobacillus dapat melakukan dekonjugasi garam empedu dan mencegah reabsorpsi kolestrol dalam hati, yang pada gilirannya hati menggunakan lebih banyak kolesterol serum untuk mensistesis garam empedu

(25)

10

dan secara tidak langsung menurunkan kadar kolesterol dalam serum (Guarner, et al., 1998 dan Lee, et al., 1999 dalam Sopandi dan Wardah, 2014).

e. Memodulasi respon imun

Mikroorganisme usus dianggap dapat bertindak sebagai penghalang, membantu sistem regulasi, dan respons imun lokal. Regulasi immunofisiologis dalam usus bergantung pada pembentukan mikroflora indigenous (Isolauri, et al., 2001). Sifat atau fungsi mikroorganisme usus tersebut lebih efektif pada usia muda, selama terjadi perkembangan jaringan limfoid dalam usus. Mikroflora normal yang berada dalam saluran pencernaan pada usia muda, dapat membantu pengembangan imunitas melalui pemberian antigen yang berkaitan dengan reaksi inflamasi dalam usus (Guarner, et al., 1998; Lee, et al., 1999; Ray, 2004 dalam Sopandi dan Wardah, 2014). Pemberian probiotik secara oral juga dapat membantu mengatasi permasalahan respon imun, disebabkan oleh mikroflora yang tidak menguntungkan usus. Efek yang menguntungkan dari probiotik tersebut diduga dihasilkan oleh perubahan permeabilitas usus, perubahan mikroflora usus, pengembangan fungsi penghalang imunologi usus, dan menghambat respons inflamasi usus (Ray, 2004).

f. Bacterial Vaginitis (BV)

Lactobacillus spp, adalah unsur mikroba yang dominan dalam mengatur keberadaaan, pertumbuhan, kolonisasi, dan persisten mikroorganisme non- endogen di vagina. Seiring dengan naiknya jumlah Lactobacillus spp., maka proteksi terhadap uropathogen pun ikut meningkat. Dinyatakan pula bahwa lactobacilli memproduksi biofilm yang melindungi sel urogenital. Terdapat penelitian dengan 40 wanita yang mengalami Bacterial Vaginitis (BV), dan diberikan secara acak pengobatan kapsul mengandung L. rhamnosus GR-1 dan L.

reuteri RC-14 selama 5 hari atau gel metronidazole 0,75% dua kali sehari. Dan hasilnya menunjukkan terdapat kesembuhan yang signifikan pada subjek yang menerima probiotik lactobacilli dibandingkan metronidazole (Aron, et al., 2015).

g. Penurunan penyakit alergi

Keberadaan mikroflora normal usus sejak lahir sampai dewasa, dapat berperan penting dalam menghambat beberapa respon imun spesifik. Mikroflora normal dalam saluran pencernaan masuk ke dalam tubuh melalui makanan, air,

(26)

udara, dan sumber lingkungan lain (Guarner dan Schaafma, 1998 dan Lee, et al., 1999 dalam Sopandi dan Wardah, 2014). Pemeliharaan bayi dalam lingkungan yang sangat steril dan pemberian pangan olahan yang semisteril, dapat mengganggu pembentukan atau keberadaan mikroflora normal dalam saluran pencernaan. Hal tersebut menyebabkan sistem imun bayi mengembangkan respon inflamasi terhadap beberapa antigen pangan. Probiotik mengandung bakteri usus yang menguntungkan dapat mempunyai efek penekan terhadap reaksi tersebut, dengan menstimulasi produk sitokin antiinflamasi dan menurunkan reaksi alergi dalam individu yang sensitif (Ray, 2004).

2.4. Metabolisme Bakteri Asam Laktat

Energi seluler BAL diperoleh dari fermentasi karbohidrat, untuk menghasilkan asam organik sebagai produknya. Perolehan energi seluler oleh BAL dilakukan melalui dua jalur yang berbeda. BAL dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan metabolisme karbohidratnya yaitu homofermentatif dan heterofermentatif (Ozyurt, et al., 2014).

Bakteri homofermentatif hanya menghasilkan laktat sebagai produk utama dari fermentasi glukosa. Bakteri homofermentatif melakukan jalur glikolisis Emden-Meyerhof-Parnas (EMP), pada molekul 6 karbon glukosa difosforilasi dan diisomerisasi sebelum didegradasi oleh enzim aldolase menjadi gliseraldehid-3-fosfat, kemudian diubah menjadi piruvat. Selama proses fosforilasi, dihasilkan 2 molekul ATP untuk setiap molekul glukosa yang difermentasi (Sopandi dan Wardah, 2014). Kelompok homofermentatif terdiri dari Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus, dan beberapa lactobacilli (Vasiljevic and Shah 2008 dalam Ozyurt, et al., 2014).

Sedangkan, bakteri heterofermentatif menghasilkan asam laktat, etanol atau asetat, dan karbon dioksida dari glukosa. Heterofermentatif tidak mempunyai enzim aldolase dan mengubah heksosa, glukosa menjadi pentosa melalui serangkaian reaksi (Sopandi dan Wardah, 2014). Kelompok heterofermentatif terdiri dari Leuconostoc, Weissella, dan beberapa lactobacilli (Vasiljevic and Shah 2008 dalam Ozyurt, et al., 2014).

(27)

12

Gambar 2.1 Jalur metabolisme homofermentatif (Sumber: Kusuma, 2009)

Fruktosa Glukosa

Fruktosa-6-fosfat

ATP ADP Glukosa-6-fosfat ATP

ADP

2 Gliseraldehid-3-fosfat ATP ADP

2-piruvat

2-Laktat 4 ATP

4 ADP 2 Pi

2 NAD⁺

2 NADH

4 ATP

4 ADP 2 NAD⁺

2 NADH

(28)

Gambar 2.2 Jalur metabolisme heterofermentatif (Sumber: Kusuma, 2009) Glukosa

Glukosa-6-fosfat ATP ADP

Fruktosa-6-fosfat ATP ADP

6-fosfoglukonat 2 NAD⁺ 2 NADH

Ribulosa-5-fosfat 2 NAD⁺ 2 NADH CO2

Xilulosa-5-fosfat

Gliseraldehid-3-fosfat Asetil fosfat Asetat

ATP ADP

Piruvat

Laktat NAD⁺

NADH 2 ADP

2 ATP 2 P_i

NADH NAD⁺

CoA P_i

Etanol

NADH NAD⁺ Asetil CoA

Asetaldehid NADH NAD⁺

Fruktosa

(29)

14

2.5. Produksi Asam Organik

Fermentasi mikroorganisme biasanya menghasilkan asam organik seperti asam asetat, asam glukonat, asam sitrat, asam itakonat, asam giberelat, dan asam laktat (Pratiwi, 2008). Asam-asam organik dari produk fermentasi merupakan hasil hidrolisis asam lemak dan juga sebagai hasil aktivitas pertumbuhan bakteri.

Penentuan kuantitatif asam organik pada produk fermentasi adalah penting untuk mempelajari kontribusi bagi aroma sebagian besar produk fermentasi, alasan gizi, dan sebagai indikator aktivitas bakteri (Bevilacqua & Califano, 1989 dalam Nur, 2005).

a) Asam glukonat, asam ini diproduksi oleh berbagai bakteri termasuk spesies Acetobacter dan oleh beberapa fungi seperti Penicillium dan Aspergillus.

Aspergillus niger mengoksidasi glukosa menjadi asam glukonat dalam reaksi enzimatik tunggal oleh enzim glukosa oksidase. Asam glukonat memiliki beberapa kegunaan, seperti kalsium glukonat yang merupakan produk farmasi untuk menyuplai kalsium dalam tubuh (Pratiwi, 2008).

b) Asam sitrat diproduksi oleh Aspergillus niger dengan molasses sebagai substrat fermentasinya. Transformasi asam sitrat oleh Aspergillus terreus dapat digunakan untuk mempoduksi asam itakonat dalam dua langkah reaksi.

Langkah pertama yaitu perubahan asam sitrat menjadi asam cis-akonitat melalui proses hidroksilasi dan langkah kedua yaitu langkah karboksilasi asam cis-akionat menjadi asam itakonat. Proses fermentasi ini memerlukan pH berkisar pada 2,2 (Pratiwi, 2008).

c) Asam giberelat diproduksi oleh fungi Gibberella fujikoroi (Fusarium moniliforme). Diperlukan media glukosa-garam mineral pada saat proses fermentasi, temperatur inkubasi berkisar pada 25°C dengan pH asam (Pratiwi, 2008).

d) Asam laktat diproduksi oleh Lactobacillus delbrueckii, spesies Lactobacillus lainnya, Streptococcus, dan Leuconostoc. Asam laktat digunakan untuk mengawetkan makanan pada industri penyamakan kulit dan industri tekstil.

Media yang digunakan dalam fermentasi asam laktat ini memerlukan glukosa 10-15%, kalsium karbonat 10% untuk menetralisasi asam laktat yang dihasilkan, amonium fosfat, dan sejumlah kecil sumber nitrogen. Gula jagung,

(30)

pati kentang, dan gandum sering digunakan sebagai sumber karbohidrat.

Temperatur inkubasi antara 45-50°C dengan pH antara 5,5-6,5. Setelah proses fermentasi 5-7 hari, kurang lebih 90% gula telah diubah menjadi asam laktat, kalsium karbonat selanjutnya ditambahkan untuk menaikkan pH hingga 10, kemudian media fermentasi dipanaskan dan disaring. Prosedur ini akan membunuh bakteri, mengkoagulasi protein, menghilangkan sisa kalsium karbonat, dan mendekomposisi residu karbohidrat (Pratiwi, 2008).

2.6. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme

Pertumbuhan adalah pertambahan teratur semua komponen suatu organisme. Pertumbuhan mikroorganisme ditunjukkan adanya peningkatan jumlah mikroorganisme, bukan peningkatan ukuran sel individu. Fase pertumbuhan mikroorganisme terdiri dari empat macam (Pratiwi, 2008):

1) Fase lag (fase adaptasi)

Merupakan fase penyesuaian mikroorganisme pada suatu lingkungan baru.

Ciri dari fase ini yaitu tidak adanya peningkatan jumlah sel, yang ada hanya peningkatan ukuran sel. Lama fase lag tergantung kondisi dan jumlah awal mikroorganisme dan media pertumbuhan (Pratiwi, 2008).

2) Fase log (fase eksponensial)

Yakni fase dimana mikroorganisme tumbuh dan membelah pada kecepatan maksimum, tergantung pada genetika mikroorganisme, sifat media, dan kondisi pertumbuhan. Terdapat hal yang dapat menghambat laju pertumbuhan, seperti nutrisi yang terkandung dalam kultur habis sehingga hasil metabolisme yang bersifat racun tertimbun dan dapat menghambat pertumbuhan (Pratiwi, 2008).

3) Fase stasioner

Saat pertumbuhan mikoorganisme terhenti dan terjadi keseimbangan antara jumlah sel yang membelah dengan jumlah sel yang mati. Fase ini yaitu fase dimana terjadinya akumulasi produk buangan yang toksik. Terdapat kehilangan sel yang lambat karena kematian diimbangi pembentukan sel baru melalui pertumbuhan dan pembelahan dengan nutrisi yang dilepaskan oleh sel-sel mati (Pratiwi, 2008).

(31)

16

4) Fase kematian

Pada fase ini, jumlah sel yang mati meningkat. Faktor penyebabnya karena ketidaktersediaan nutrisi dan akumulasi produk buangan yang toksik (Pratiwi, 2008).

2.7. Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme

Parameter pengukuran pertumbuhan mikroorganisme yaitu konsentrasi sel (jumlah sel per satuan isi kultur) ataupun densitas sel (berat kering sel per satuan isi kultur). Pengukuran pertumbuhan mikroorganisme ada dua cara, yakni secara langsung dan tidak langsung (Pratiwi, 2008)

2.7.1 Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme Secara Langsung a) Pengukuran menggunakan bilik hitung (counting chamber)

Pengukuran bakteri digunakan bilik hitung Petroff-Hausser, sedangkan pengukuran mikroorganisme eukariot digunakan hemositometer. Keuntungan metode ini yaitu mudah, murah, cepat, dan dapat diperoleh informasi ukuran dam morfologi mikroorganisme. Sedangkan kerugiannya yaitu populasi mikroorganisme yang digunakan harus banyak (minimum berkisar 10⁶ CFU/ml), karena pengukuran dengan volume dalam jumlah sedikit tidak dapat membedakan antara sel hidup dan sel mati, serta kesulitan menghitung sel yang motil (Pratiwi, 2008).

b) Pengukuran menggunakan electronic counter

Suspensi mikroorganisme dialirkan melalui lubang kecil (orifice) dengan bantuan aliran listrik. Elektroda yang ditempatkan pada dua sisi orifice mengukur tahanan listrik (ditandai dengan naiknya tahanan) pada saat bakteri melalui orifice.

Pada saat inilah sel terhitung. Keuntungannya adalah hasil didapat lebih cepat, lebih akurat, serta sel dengan ukuran besar dapat terhitung. Namun, metode ini tidak bisa digunakan untuk menghitung bakteri karena adanya gangguan debris, filament, dan sebagainya, serta tidak dapat membedakan sel hidup dan sel mati (Pratiwi, 2008).

c) Pengukuran dengan plating technique

Merupakan metode perhitungan jumlah sel tampak (visible) dan berdasarkan asumsi bakteri hidup akan tumbuh, membelah, dan memproduksi

(32)

satu koloni tunggal. Mula-mula dibuat seri pengenceran sampel dan ditumbuhkan pada media padat. Pengukuran dilakukan pada plate dengan jumlah koloni berkisar 25-250 atau 30-300 dengan satuan CFU (colony forming unit).

Keuntungannya yakni sederhana, mudah, dan sensitif. Tetapi harus digunakan media yang sesuai dan penghitungannya kurang akurat karena satu koloni tidak selalu berasal dari satu individu sel (Pratiwi, 2008).

d) Pengukuran dengan menggunakan teknik filtrasi membran (membrane filtration technique)

Sampel dialirkan pada suatu sistem filter membran dengan bantuan vacum.

Bakteri yang terperangkap ditumbuhkan pada media yang sesuai dan jumlah koloninya dihitung. Metode ini memiliki kelebihan dapat menghitung sel hidup dan sistem peghitungannya langsung, sedangkan kerugiannya adalah tidak ekonomis (Pratiwi, 2008).

2.7.2 Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme Secara Tidak Langsung a) Pengukuran kekeruhan/turbidity

Bakteri yang bermultiplikasi pada media cair akan menyebabkan media menjadi keruh. Spektrofotometer atau kalorimeter digunakan dengan membandingkan densitas optik antara media tanpa pertumbuhan dengan yang terdapat pertumbuhan bakteri (Pratiwi, 2008).

b) Pengukuran aktivitas metabolik

Berdasarkan jumlah produk metabolik tertentu, seperti asam atau CO2

yang menunjukkan jumlah mikroorganisme terdapat didalam media (Pratiwi, 2008).

c) Pengukuran berat sel kering (BSK)

Merupakan metode yang umum digunakan untuk mengukur pertumbuhan fungi berfilamen. Miselium fungi dipisahkan dari media dan dihitung sebagai berat kotor. Selanjutnya miselium dicuci dan dikeringkan dengan desikator dan ditimbang beberapa kali hingga mencapai berat konstan yang dihitung sebagai berat sel kering (Pratiwi, 2008).

(33)

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juli 2016 di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan Laboratorium Formulasi Sediaan Steril Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat

Peralatan yang digunakan pada penelitian adalah kapas, kain kasa, tisu, kaca objek, jarum ose, batang spreader, spatula, pembakar spirtus, alumunium foil, plastic wrap, kertas saring, pipet tetes, kaca objek, tabung reaksi, rak tabung reaksi, beaker glass, erlenmeyer, cawan petri, mikropipet (Thermo Scientific), tabung eppendorf, termometer, vortex, timbangan analitik (Ogawa Seiki), anaerobic jar (Oxoid), mikroskop optik, pH meter (Horiba, Jepang), autoklaf digital (Ogawa Seiki), inkubator (France Etuves), laminar air flow, lemari pendingin (GEA), dan oven (Memmert).

3.2.2. Bahan

Bahan yang digunakan antara lain sampel limbah cair air rendaman kacang kedelai dari satu produsen tempe yang berlokasi di Cikoko, Pancoran, Jakarta Selatan, NaCl, kalsium karbonat (CaCO3), media MRS Agar (Merck), media MRS broth (Conda pronadisa), media SIM (Merck), pepton water (Merck), media blood agar, kristal violet, lugol, alkohol 96%, safranin, malakit hijau, aquadest, hidrogen peroksida (H2O2) 3%, minyak imersi, dan alkohol 70%

3.3. Prosedur Kerja

3.3.1. Persiapan Alat dan Bahan yang Digunakan 3.3.1.1. Preparasi Alat

Peralatan gelas seperti cawan petri, batang spreader, batang pengaduk, erlenmeyer, beaker glass, tabung reaksi masing-masing dibungkus dengan kertas

(34)

hvs dan kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf digital pada suhu 121°C selama 15 menit.

3.3.1.2. Preparasi Sampel

Sampel berupa air rendaman kacang kedelai selama satu malam. Sampel yang diambil yaitu pada tahapan awal pembuatan tempe. Pembuatan tempe dimulai dari perebusan bahan baku kacang kedelai impor seberat kurang lebih 120 kg selama 2 jam menggunakan air sumur dilanjutkan dengan perendaman menggunakan air perebusnya selama 24 jam. Kedelai yang telah direndam ditiriskan dengan pengayak berlubang besar untuk selanjutnya dikupas menggunakan mesin penggiling dan dicuci dengan air mengalir. Kedelai yang telah dingin ditaburi dengan ragi kemudian dicetak dan dikemas menggunakan daun atau plastik.

3.3.1.3. Pembuatan Medium MRSA (de Man Rogosa Sharpe Agar)

Sejumlah 68,2 gram serbuk MRS ditimbang, media ini disuplementasi dengan CaCO3 sebanyak 1% dan kemudian dilarutkan dalam 1 liter air destilasi dan dipanaskan hingga mendidih. Lalu media disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

3.3.2. Isolasi Bakteri Asam Laktat

Sebanyak 1 mL dari sampel secara aseptis ditambahkan ke dalam 9 mL larutan pengencer yaitu pepton water steril (0,1%, b/v) dan dihomogenkan yang merupakan pengenceran ke-1. Kemudian, dilakukan pengenceran bertingkat sampai pengenceran ke-7. Diambil 0,1 mL cuplikan dari tiga seri pengenceran terakhir dan dikulturkan pada agar de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA) tersuplementasi CaCO3 1% menggunakan metode spread plate. Diinkubasi selama 48 jam pada inkubator suhu 37°C. Koloni yang tumbuh dihitung dan jumlah totalnya dihitung menggunakan metode total plate count (TPC).

(35)

20

3.3.3. Pemurnian

Koloni yang tumbuh dengan zona bening disekelilingnya dilakukan pemurnian sel dengan cara menggoreskan pada media MRSA tersuplementasi CaCO3 1% dengan metode kuadran diinkubasi selama 24 jam pada inkubator suhu 37°C agar diperoleh koloni tunggal untuk selanjutnya disubkultur kembali sebagai isolat tunggal murni.

3.3.4. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat 3.3.4.1. Pengamatan Morfologi Bakteri Asam Laktat

Pengamatan morfologi dari bakteri asam laktat (BAL) meliputi:

a) Pewarnaaan Gram: diteteskan NaCl fisiologis pada kaca ojek isolat lalu diambil satu ose isolat dari agar miring. Isolat tersebut disebarkan pada kaca objek lalu difiksasi. Gentian violet diteteskan diatas preparat dan biarkan selama 1 menit. Preparat dicuci dengan air mengalir. Cairan lugol diteteskan pada preparat kemudian dibiarkan kembali selama 1 menit. Preparat dicuci dan diteteskan dengan alkohol 96% selama 30 detik. Preparat dicuci dengan air mengalir. Terakhir, preparat diteteskan dengan safranin dan dibiarkan selama 45-60 detik. Preparat dicuci dan dikeringkan untuk diamati dibawah mikroskop. Bakteri Gram positif akan berwarna ungu dan bakteri Gram negatif berwarna merah.

b) Pewarnaan endospora: Preparat yang telah difiksasi diletakkan diatas penangas air lalu ditutup dengan kertas saring. Malakit hijau diteteskan dan dibiarkan selama 5 menit. Preparat dicuci dengan air mengalir. Dilakukan kembali pewarnaan dengan safranin kemudian biarkan selama 60 detik.

Preparat dicuci, hasilnya diamati dibawah mikroskop. Endospora akan berwarna hijau sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah (Harley, 2005) c) Uji motilitas dilakukan dengan media setengah padat, diambil sebanyak satu

ose isolat bakteri dan diinokulasikan secara vertikal pada media SIM (Sulfida Indol Motility). Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37° C. Hasil uji motilitas bakteri positif dapat dilihat dengan adanya pertumbuhan bakteri pada permukaan media atau tidak hanya bekas pada tusukan, sedangkan bakteri non motil tumbuh sepanjang tusukan (Harley, 2005).

(36)

3.3.4.2. Pengamatan Fisiologi dan Biokimia Bakteri Asam Laktat

Pengamatan fisiologi dan biokimia dari bakteri asam laktat (BAL) meliputi:

a) Uji katalase dilakukan dengan menggunakan hidrogen peroksida (H2O2) 3%.

Isolat diambil dari stok kultur dan diletakkan pada kaca objek. Satu sampai dua tetes H2O2 3% ditambahkan ke isolat. Jika terbentuk gelembung mengindikasikan bakteri positif katalase, dan jika tidak maka mengindikasikan bakteri negatif katalase (Harley, 2005).

b) Uji produksi gas dilakukan dengan menumbuhkan kultur isolat dalam media MRS broth dalam tabung reaksi yang diberi tabung durham dengan keadaan terbalik untuk menangkap gas yang dihasilkan. Lalu diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37° C (Romadhon, et al., 2012).

c) Ditumbuhkan pada temperatur yang berbeda-beda dengan menggunakan MRS broth kemudian diinkubasi selama 2x24 jam dengan seri temperatur 10°C, 37°C, dan 45°C. Adanya pertumbuhan diamati dengan adanya kekeruhan dalam tabung (Anastiawan, 2014).

d) Untuk pertumbuhan pada konsentrasi garam 4% dan 6.5%, satu ose kultur dimasukkan ke dalam MRS broth yang tersuplementasi NaCl masing-masing berkonsentrasi 4% dan 6.5%. Lalu diinkubasi pada temperatur 37°C selama 24 jam. Kekeruhan menandakan adanya pertumbuhan (Thakkar, et al., 2015).

3.3.5. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat

Isolat BAL diuji keamanannya dengan blood agar yang mengandung 5%

darah domba. Isolat dari agar miring diambil satu ose lalu diinokulasi ke media blood agar. Media tersebut kemudian diinkubasi secara anaerob pada suhu 37°C selama 48 jam. Pengamatan dilakukan terhadap koloni yang tumbuh, jika terdapat zona jernih disekitar koloni maka menunjukkan reaksi positif beta hemolisis. Pada uji ini, Staphylococcus aureus digunakan sebagai kontrol positif (Thakkar, et al., 2015).

(37)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 Isolasi Bakteri Asam Laktat

Pada tahap awal isolasi, sampel berupa air rendaman kacang kedelai dilakukan inokulasi ke dalam media MRSA tersuplementasi CaCO3 1%.

Didapatkan data total plate count (TPC) keseluruhan bakteri yang tumbuh sebanyak koloni/mL sedangkan TPC BAL sebanyak koloni/mL. Dari keseluruhan kultur bakteri yang tumbuh terpilih delapan isolat BAL yang memiliki karakteristik secara makroskopik berbeda, yaitu:

Tabel 4.1 Morfologi Koloni Isolat

Isolat Morfologi Koloni

Bentuk Warna Elevasi Tepian Diameter Koloni

ARK 5.1.a Bulat Krem Konveks Halus 3 mm

ARK 5.3.b Bulat Krem Konveks Halus 1 mm

ARK 6.1.c Bulat Putih pudar Rata Halus 4 mm

ARK 6.1.d Bulat Putih pucat Rata Halus 3 mm

ARK 6.2.e Bulat Putih pudar Rata Halus 3 mm

ARK 6.3.f Bulat Putih tulang Rata Halus 3 mm

ARK 7.2.g Bulat Krem Rata Halus 3 mm

ARK 7.3.h Bulat Putih Rata Halus 4 mm

4.1.2 Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat

Dalam mengkarakterisasi suatu mikroorganisme perlu mengetahui terlebih dahulu ciri utamanya yang meliputi ciri morfologi, susunan kimiawi dari sel, sifat biakan, metabolisme, sifat genetik dan patogenisitas. Untuk menentukan ciri tersebut, maka diperlukan beberapa uji morfologi, fisiologi, serta aktivitas biokimia (Lay dan Hastowo, 1992 dalam Candra, 2006). Pada pengujian ini digunakan Lactobacillus casei ATCC 393 sebagai strain acuan.

(38)

4.1.2.1 Morfologi Isolat Bakteri Asam Laktat

Kedelapan isolat yang diuji, memiliki karakteristik morfologi sel yang serupa yaitu berbentuk sel batang, tidak membentuk spora, dan tidak motil.

Namun, hasil pewarnaan Gram menunjukan isolat ARK 6.2.e adalah Gram negatif, sedangkan tujuh isolat lainnya adalah Gram positif. Persyaratan BAL adalah bakteri Gram positif sehingga isolat ARK 6.2.e tidak dilakukan uji selanjutnya. Untuk strain acuan, memiliki morfologi yang serupa yakni berbentuk sel batang, Gram positif, tidak membentuk spora, serta tidak motil.

4.1.2.2 Fisiologi dan Biokimia Isolat Bakteri Asam Laktat

Uji katalase yang dilakukan menunjukkan kedelapan isolat tidak menghasilkan enzim katalase dengan tidak terbentuknya gelembung setelah diteteskan H₂O₂. Untuk menentukan tipe fermentasi bakteri maka dilakukan uji produksi gas, tabung durham yang terbalik di dalam tabung berisi media akan menangkap gas yang dihasilkan. Dari uji produksi gas didapatkan hasil tujuh isolat yaitu ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan ARK 7.3.h menghasilkan gas, sedangkan Lactobacillus casei tidak menghasilkan gas. Uji fisiologis meliputi ketahanan pada suhu dan konsentrasi NaCl berbeda-beda menunjukkan hasil yang seragam, baik ketujuh isolat maupun Lactobacillus casei tumbuh pada suhu 37° C dan 45° C serta konsentrasi NaCl 4%

dan 6,5%. Namun, pada suhu 10°C ketujuh isolat serta Lactobacillus casei tidak terdapat pertumbuhan.

4.1.3 Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat

Untuk melihat keamanan dari isolat dilakukan uji aktivitas hemolisis dengan Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif, ketujuh isolat serta Lactobacillus casei tidak menghasilkan zona disekitar koloni atau dapat dikatakan γ (gamma) hemolisis.

(39)

24

Tabel 4.2 Karakteristik Isolat BAL dan Strain Acuan Pengamatan

Isolat L. casei ARK

5.1.a

ARK 5.3.b

ARK 6.1.c

ARK 6.1.d

ARK 6.3.f

ARK 7.2.g

ARK 7.3.h Morfologi Sel

Pewarnaan Gram + + + + + + + +

Bentuk Sel B B B B B B B B

Pewarnaan Endospora - - - -

Motilitas - - - -

Biokimia

Katalase - - - -

Tipe Fermentasi Ho He He He He He He He

Fisiologis Suhu:

- 10°C - - - -

- 37°C + + + + + + + +

- 45°C + + + + + + + +

NaCl:

- 4% + + + + + + + +

- 6,5% + + + + + + + +

Keterangan:

+ : menunjukkan hasil pewarnaan positif/motil/adanya pertumbuhan bakteri

- : menunjukkan hasil pewarnaan negatif/non motil/tidak adanya pertumbuhan bakteri B: Batang

Ho: Homofermentatif He: Heterofermentatif

4.2 Pembahasan

Tahap awal penelitian adalah dengan pengambilan sampel, dimana sampel yang diambil adalah air rendaman kacang kedelai selama semalaman. Sampel berupa cairan berwarna kekuningan dengan tekstur lengket dan bau asam. Sampel diencerkan beberapa kali untuk mengurangi populasi mikroba sehingga didapatkan koloni terpisah pada cawan yang memudahkan dalam proses penghitungan koloni (Harley, 2005). Jumlah koloni yang digunakan yaitu 30-30 koloni (Khedid, et al., 2006).

Pengenceran dilakukan sampai 10^-7 dengan menggunakan pepton water 0,1% yang berfungsi untuk menjaga mikroba tetap hidup dengan nutrisi tetap tersedia. Tiga tingkat pengenceran terakhir yakni 10^-5, 10^-6, dan 10^-7 diinokulasikan ke dalam media MRSA yang tersuplementasi CaCO3 1%

(40)

menggunakan metode spread plate, metode ini dipilih untuk memudahkan baik dalam penghitungan jumlah koloni, pengamatan, serta pengambilan koloni.

Metode yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni pada penelitian ini mempunyai prinsip jika sel bakteri hidup ditumbuhkan pada media yang cocok, maka sel bakteri akan berkembang dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata sehingga bisa langsung dihitung (Collin, et al., 2004).

Jumlah koloni yang tumbuh terbanyak terdapat pada pengenceran 10^-5 dan pada pengenceran 10^-7 jumlah koloni yang tumbuh semakin sedikit. Setelah diamati secara makroskopik, dipilihlah delapan isolat yang memiliki karakteristik berbeda baik bentuk, ukuran, maupun warna yaitu isolat dengan kode ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.2.e, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan ARK 7.3.h.

Isolat yang dipilih merupakan isolat yang memiliki zona bening disekitar koloni seperti ditunjukkan pada Gambar 4.1, zona tersebut terbentuk karena produksi asam organik dari bakteri sehingga CaCO₃ pada media MRSA terhidrolisis (Sun, et al., 2014; Pisol, et al., 2015). Kedelapan isolat ini dimurnikan terlebih dahulu dengan goresan kuadran untuk mendapatkan koloni murni yang terpisah sebanyak dua kali pemurnian. Koloni murni yang terpisah kemudian diinokulasi ke dalam media MRSA agar miring dengan luas permukaan yang lebih kecil sehingga kemungkinan kontaminasi lebih rendah untuk disimpan sebagai stok kultur.

Koloni Bakteri

Zona bening

Gambar 4.1 Hasil Isolasi BAL (Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)

(41)

26

Setelah didapatkan stok kultur, kedelapan isolat serta strain acuan dikarakterisasi dimana BAL memiliki ciri-ciri katalase negatif, Gram positif, non motil, dan tidak membentuk spora (Bulut, 2003; Surono, 2004; Sun, et al., 2014).

Pengamatan secara mikroskopik dilakukan terhadap bentuk dan struktur sel, salah satunya dengan pewarnaan Gram. Dalam hal ini, bakteri Gram positif ditandai dengan warna ungu pada sel bakteri karena mempunyai kandungan lipid yang lebih rendah, sehingga dinding sel bakteri akan lebih mudah terdehidrasi akibat perlakuan dengan alkohol 96%. Dinding sel yang terdehidrasi menyebabkan ukuran pori-pori sel menjadi kecil dan daya permeabilitasnya berkurang, sehingga zat warna ungu kristal yang merupakan zat warna utama tidak dapat keluar dari sel dan sel akan tetap berwarna ungu (Pelczar dan Chan, 2008).

ARK 6.1.d ARK 6.2.e

Lactobacillus casei

Keterangan:

ARK 6.1.d dan Lactobacillus casei: Gram positif berbentuk batang ARK 6.2.e: Gram negatif berbentuk batang

Isolat yang digunakan berumur 24 jam dan diamati dengan perbesaran (100x10)

Gambar 4.2 Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel Bakteri (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)

(42)

Bakteri Gram negatif terlihat berwarna merah karena kehilangan pewarna kristal violet pada waktu pembilasan dengan alkohol 96%, namun mampu menyerap pewarna tandingan yaitu safranin. Bakteri Gram negatif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase lebih tinggi dari pada yang dikandung bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram negatif juga lebih tipis dari pada dinding sel bakteri Gram positif (Pelczar dan Chan, 2008).

Berdasarkan hasil dari pewarnaan Gram kedelapan isolat beserta strain acuan menunjukkan karakteristik bakteri bentuk sel batang. Tujuh isolat serta strain acuan merupakan Gram positif dan satu isolat, ARK 6.2.e, merupakan Gram negatif.

Hasil uji pewarnaan spora menunjukkan ketujuh isolat bakteri serta strain acuan tidak membentuk spora. Spora bersifat tahan terhadap kondisi lingkungan ekstrim dan adanya bahan kimia beracun. Spora dibentuk oleh spesies bakteri yang termasuk dalam genera Clostridium dan Bacillus untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan bagi bakteri.

ARK 6.1.d Lactobacillus casei

Keterangan:

ARK 6.1.d dan Lactobacillus casei: tidak membentuk spora

Isolat yang digunakan berumur 24 jam dan diamati dengan perbesaran (100x10)

Gambar 4.3 Hasil Pewarnaan Endospora (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)

Spora terbentuk dalam sel sehingga seringkali disebut sebagi endospora dan dalam sel bakteri hanya terdapat satu spora. Jika sel semakin tua, maka sel vegetatif akan pecah sehingga endospora akan terlepas dari sel dan membentuk

(43)

28

spora bebas. Spora juga lebih tahan terhadap pewarnaan, akan tetapi sulit untuk melepaskan zat warna yang telah terserap ke dalamnya, sehingga tidak dapat mengikat zat warna lain yang diberikan berikutnya (counterstain). Prinsip pewarnaan ini digunakan untuk membedakan spora dari sel vegetatif (Fardiaz, 1987 dalam Candra, 2006).

Endospora memiliki selubung yang kompak sehingga menyebabkan zat warna sulit untuk berpenetrasi ke dalam dinding endospora, maka diperlukan pemanasan pada saat dilakukan pewarnaan. Metode pewarnaan yang umum untuk mewarnai endospora bakteri adalah pewarnaan Schaeffer-Fulton, dengan malakit hijau sebagai pewarna utama dan setelah dilakukan pembilasan dengan air digunakan safranin sebagai counterstain (Pratiwi, 2008). Dimana akan menghasilkan warna hijau pada bakteri dengan endospora dan akan berwarna merah untuk sel vegetatif.

Ketujuh isolat dan strain acuan memberikan hasil uji motilitas yaitu non motil, yang berarti bakteri tidak memiliki flagela. Hasil ini dapat dilihat dari tidak menyebarnya pertumbuhan bakteri pada media SIM, melainkan hanya tumbuh pada bekas tusukan jarum inokulum saja. Flagela merupakan filamen yang mencuat dari sel bakteri dan berfungsi untuk pergerakan bakteri. Flagela berbentuk panjang dan ramping. Gerakan flagela ini memungkinkan bakteri mendekati atau menjauhi rangsang (Pratiwi, 2008).

Gambar 4.4 Hasil Uji Motilitas (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)

Katalase merupakan enzim yang dapat mengkatalisasi penguraian hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O) dan oksigen (O2) dan pada reaksi ini

Bakteri tumbuh di bekas tusukan jarum

inokulum

ARK 6.1.d Lactobacillus casei