全自動1細胞解析単離装置 ̶開発経緯と応用事例̶ - J-Stage

生命科学分野での細胞解析，有用物質生産分野での高産生株 樹立，医療分野での細胞診断などにおいて，莫大な数の細胞 ライブラリーから目的細胞を生きたまま1細胞単離すること は 非 常 に 重 要 で あ る．従 来 は，本 目 的 の た め に セ ル ソ ー ターが主に用いられてきたが，目的細胞存在率が極めて低い サンプル，再利用が必要な貴重サンプル，各種ストレスに対 し脆弱なサンプルには不向きであり，また細胞性状の経時的 変化に基づく選抜は不可能であった．本稿では，われわれが 最 近 実 用 化 し た 全 自 動1細 胞 解 析 単 離 装 置（1細 胞 単 離 ロ ボ ッ ト） の 概 略 と と も に，同 ロ ボ ッ ト に よ り 初 め て 可 能 に なった「1細胞育種コンセプト」に基づく細胞スクリーニン グシステムについて紹介する．

従来の1細胞解析単離技術

細菌や酵母などの微生物の細胞ライブラリーから最良 の形質を有する株を選抜するには，コロニーを形成さ せ，各コロニーを単離培養してから各種評価を行う．動

物細胞の場合も同様に，細胞ライブラリーを限界希釈し てコロニーを形成させ，各コロニーを単離培養してから 評価を行う．このとき，1細胞から生じるコロニーに含 まれる細胞群は単クローン（遺伝子的に均一）であるた め，その表現型は均一であると長年信じられてきた．し かし，最近ではエピジェネティックな効果により遺伝子 発現の確率論的変動（stochastic fluctuation）が引き起 こされ，同じコロニー内の各細胞間の表現型のばらつき

（cellular heterogeneity） が 指 摘 さ れ て い る⁽¹⁾（図

1

_）

_．

これは，細胞を用いる研究や産業において，絶えず細胞 を維持・育種し続ける必要性を示している．一方，細胞 を用いる現場において，目的形質を長期間高度かつ安定 に維持する「エリート細胞」が活躍していることが知ら れている．そこで今後は，時間と手間を浪費するコロ ニー形成や大規模培養などを経ずに1細胞単位で迅速に エリート細胞を選抜できることが，細胞育種におけるハ イスループット化および効率化の観点から重要と考えら れている（「1コロニー育種」から「1細胞育種」への転 換）⁽²⁾

．たとえば，従来の1コロニー育種においてマス

ターセルバンクとなるコロニーには，エリート細胞以外 の細胞が混在する可能性が高いが，1細胞育種において

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

【解説】

Automated Single-Cell Analysis and Isolation System: Basics and  Applications̶A Paradigm Shift in the Cell Screening System by  Single-Cell Isolation Robot

Kenji TATEMATSU, Shunʼichi KURODA,  大阪大学産業科学研 究所生体分子反応科学研究分野

全自動1細胞解析単離装置 

̶開発経緯と応用事例̶

1細胞単離ロボットが拓く新しい細胞スクリーニング

立松健司，黒田俊一

は，エリート細胞のみからなるマスターセルバンクを短 期間で得ることも可能である（図1）

．

一方，莫大な細胞ライブラリーから目的細胞を選抜し て単離する装置としては，「セルソーター」がデファク トスタンダードとして長い間用いられてきた．同装置は 細胞懸濁液を液滴化して層流（ラミナフロー）に乗せ，

各細胞の形質（形状，大きさ，細胞表層マーカーなど）

を散乱光と蛍光で評価して，目的細胞を同定し，電荷を かけて1細胞単離する．同装置は1秒あたり数万細胞を

処理できるハイスループット性を有しているが，細胞に 対して化学的ストレス（シース液）や物理的ストレス

（高電圧，高水圧，超音波）を与えるために生存率が低 いことが課題である．また，同装置は目的細胞の存在率 が0.1％以下になると分光学的に同定が困難なこと，細 胞ライブラリー全体を解析した後の選抜が不可能なこ と，そして流路系のデッドスペースが大きく貴重な細胞 サンプルの再利用が困難なことも課題である．さらに，

同装置は各種刺激に対する細胞群の経時的変化（細胞内

図1^■1コロニー育種と1細胞育種の比較 つい最近までは，1細胞から分裂増殖して形成され

る細胞集団（コロニー）は，同一遺伝子（モノクロー ン）の細胞集団であるので均質と考えられてきまし た．しかし，最新の研究では，1コロニーに含まれる 各細胞の遺伝子群の発現プロファイルが確率論的変 動（stochastic fluctuation）によりばらつき，小さな 細胞集団であっても不均質性（heterogeneity）が生 じていることが明らかになっています．なお，真核 細胞における不均質性の誘導はエピジェネティクス 機構（epigenetics : DNA塩基配列の変化を伴わない 細胞分裂後も継承される遺伝子発現あるいは細胞表 現型の変化）が大きく関与すると考えられています が，原核生物にはエピジェネティクス機構が存在し ないので不均質性の誘導は突然変異などのほかの機 構によると考えられています．これまでわれわれは，

伝統的に何も疑うことなくコロニー単位で細胞を取 り扱ってきましたが，これらの細胞の諸現象（遺伝子 発現，細胞内シグナル伝達，物質生産，分化，がん

化，アポトーシスなど）は全体の平均値であり，各 細胞内で引き起こされる規模が小さくても重要な変 化や反応を考慮するどころか，気づいてすらいない 可能性が高いのです．たとえば，正常組織中にごく 微量含まれるがん幹細胞が発がんに関与したり，血 液中に極微量放出される循環型腫瘍細胞ががん転移 に関与したり，元来再生しないと考えられていた脳 神経系や心臓などにごく微量の幹細胞が存在して器 官再生に関与したりすることが判明しています．し かし，大量な細胞集団から目的の細胞を無傷かつ生 きたまま1細胞単位で回収し，さらにその内部の遺伝 子群，エピジェネティクス，転写物（mRNA）群，

タンパク質群，代謝物群などの状態を1細胞単位で網 羅的に解析する手段が確立していないのが現在の課 題です．本稿で紹介した「全自動1細胞解析単離装 置」は，その第1段階である「膨大な数の細胞集団か ら目的の細胞を無傷かつ生きたまま1細胞単位で回 収」することが可能な初めての装置であり，今後の 上記分野での活用が期待されています．

コ ラ ム

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

Caイオン変化）などを追跡するタイムラプス機能を付 与することも不可能である．そのため，上述の「1細胞 育種」を実現するにはセルソーターでは不十分と考えら れた（表

1

_）

_．

全自動1細胞解析単離装置の開発

われわれは約10年前に，1）培養液中での化学的・物 理的ストレスフリーな解析単離，2）目的細胞存在率 0.001％への対応，3）細胞ライブラリー全体の解析結果 に基づく回収，4）回収済サンプルの再利用，5）タイム ラプス機能を実現する全く新しいコンセプトの「全自動 1細胞解析単離装置（1細胞単離ロボット）」の開発に着

手した．2013年，直径10〜30 µmの1細胞チャンバーを 最大34万個搭載したセルアレイ部，蛍光顕微鏡とCCD カメラが連動した解析部，グラスキャピラリー装着マイ クロポンプを搭載するマニピュレーター（ 方向作動）

，

電動ステージ（ 方向作動）と細胞回収用プレートか ら構成される単離部から構成された同ロボットが完成し た⁽³⁾（図

2

_）

．特に1細胞チャンバーアレイは，後述する

さまざまな細胞スクリーニング法のために，親水化処理 や各種官能基導入を可能にした（立松ら，投稿中）

．

図2^■全自動1細胞解析単離装置（A）と1細 胞チャンバーアレイ（B）

表1^■代表的セルソーターと全自動1細胞解析単離装置の比較

各種特性 セルソーター 全自動1細胞解析単離装置

細胞試料：

単離可能な目的細胞存在率 ＞0.1％ 〜0.001％

最適細胞濃度 10⁶〜10⁷ cells/mL 〜3×10⁵ cells/mL

最大解析細胞数 ∞ 〜4×10⁵ cells（ϕ10 µmウェル）

細胞懸濁液 緩衝液，シース液 培地

細胞塊単離 不可 可

機器：

作動原理 1）層流形成

2）超音波振動による液滴形成と荷電 3）荷電液滴の静電単離

1）1細胞チャンバーアレイへの導入 2）ガラスキャピラリーによる単離 解析速度 〜70,000 cells/s 〜340,000 cells/20 min

ソーティング速度 〜30,000 cells/s 96 cells/30 min

流路系ディスポーザビリティ 困難 可

ゲート設定 一部細胞のプレラン解析に基づく（細胞ロス

あり，順位付け不可，細胞再利用不可） 全細胞解析結果に基づく（細胞ロスなし，順位付 け可，細胞再利用可能）

同時検出可能蛍光色素 ＞8色 〜3色

タイムラプス解析 不可 可

細胞形態（透過像）観察 不可 可

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

全自動1細胞解析単離装置を用いた細胞スクリーニ ング

1. 抗体産生細胞

抗体医薬生産現場において，最も抗体を分泌する細胞 株（ハイブリドーマ，CHO細胞など）を選抜し樹立す ることは重要である．従来は，細胞ライブラリーを限界 希釈してコロニー形成させ，全コロニーをそれぞれ培養 した後にELISAなどにより選抜を行っていた．しかし ながら，本プロセスは所要時間および同時培養細胞数に おいてハイスループット性を欠いていた．そこでわれわ れは，脂質標識抗IgG Fc抗体（捕捉分子）を候補細胞 の表面に均一に提示させ，分泌された新生抗体を直ちに 捕捉し，蛍光標識抗IgG F（ ′）2F（ ′）2（検出分子）を 用いるサンドイッチ蛍光抗体法で新生抗体を1細胞単位 で定量する方法を開発した（cell surface-fluorescence  immunosorbent assay（CS-FIA）

，図 3

_A）

_{．同法は1細}

胞あたりfg（femtogram, 10⁻¹⁵ g）単位のごく微量の新 生抗体をリアルタイム定量できた⁽⁴⁾

．そして本ロボット

を併用すると，約5万個の抗体産生ハイブリドーマから 数時間で，親株の10倍以上の抗体産生量を1カ月以上も 維持するエリート細胞を得ることができた⁽³⁾

．このと

き，同じ細胞ライブラリーを用いてCS-FIA法とセル ソーターでスクリーニングを行ったところ，細胞の生存 率は本ロボットでは95％以上であったのに対し，セル ソーターでは30％未満であった（良元ら，未発表デー タ）

．以上の結果は，CS-FIA法と本ロボットとの組み合

わせにより，1細胞育種コンセプトに基づいた非侵襲的 な抗体産生細胞の迅速樹立が可能であることを示してい る．また，CS-FIA法は抗体以外の分泌される各種生体 分子にも幅広く応用可能である．最近では，製薬会社を 中心に細胞表層を捕捉分子で修飾することを敬遠する傾 向があるため，1細胞チャンバーにアミノ基を導入して

捕捉分子を固定したイムノチャンバー法も開発している

（立松ら，投稿中；図3B）

．この方法により，隣接する1

細胞チャンバーに分泌された各種生体分子を拡散させる ことなくリアルタイム定量することができる．

2. 幹細胞

胚性幹細胞（ES細胞）などの各種幹細胞における多 分化能マーカーは再生医療において重要であるが，その 発現量も確率論的変動を示すことが多い．われわれは，

高度な多分化能を安定的に保持する幹細胞株の樹立を目 指して，同マーカー Rex1遺伝子をEGFP（緑色蛍光タ ンパク質）遺伝子と融合してマウスES細胞に導入した．

次に，本ロボットにより約10万個の細胞ライブラリー から最も高いEGFP由来蛍光を示す23細胞を1時間未満 で得た．その後，これらの細胞から約2カ月間培養して もRex1-EGFP発現量が高度に維持されているマウスES 細胞（エリート細胞）を3株得ることができた⁽²⁾

．以上

の結果は，幹細胞株の樹立においても本ロボットによる 1細胞育種が有効であることを示している．

3. ヒト受容体アゴニスト発現酵母

各種受容体に作動する化合物群は，近年の分子創薬に おいて非常に重要である．従来は，膨大な数の化合物 セットを用意し，各種受容体を発現する動物細胞を用い て多大な労力と時間をかけてスクリーニングを行ってき た（スクリーニングロボットの登場は省力化を進めたが 作業内容は変わらなかった）

．しかし，動物細胞の内在

性シグナルカスケードとのクロストークにより，しばし ば各受容体の活性化を定量的に取り扱うことが困難で あった．そこでわれわれは，取り扱い容易でヒト受容体 由来シグナルとクロストークしない出芽酵母に各種ヒト 受容体（上皮成長因子受容体（EGFR）

，インターロイキ

ン5受容体（IL5R）

，ソマトスタチン受容体（SSTR5））

を リ ガ ン ド 依 存 的 に 活 性 化 で き る 状 態 で 発 現 さ せ

た^(5〜7)

．このとき，酵母に最適化したシグナルペプチド

を付加し，さらに形質転換効率が高くかつ受容体分子が 安定に存在できる酵母株を選抜して使用した．次に，ロ イシンジッパーを形成する

α

ヘリックス側面の5アミノ 酸残基をランダマイズ化したペプチドライブラリーで，

上記化合物セットを代替することにした（図

4

_左）

_．本

ライブラリーは立体構造が固定されており，一般的なペ プチドが引き起こすinduced fitによる偽陽性出現の可能 性が低く，さらに受容体結合残基の空間情報（ファーマ コフォア）の同定が容易である⁽⁸⁾

．また，本ライブラ

リーを自己分泌形式により1細胞単位で作動させるた 図3^■CS-FIA法（A）とイムノチャンバー法（B）

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

め，ペプチドライブラリーのN末端側にシグナルペプチ ド，C末端側に細胞壁結合タンパク質FLO42を融合し た⁽⁹⁾

．そこで，EGFRおよびペプチドライブラリーを共

発現する酵母（約20万細胞）を固定化した後，抗リン 酸化EGFR抗体により蛍光免疫染色を行い1細胞単離ロ ボットに供した．このとき，ペプチドライブラリーが EGFRアゴニストとして作動した場合，EGFRの自己リ ン酸化が誘導され，酵母細胞が蛍光を呈する（図4左）

．

蛍光強度順に上位8細胞を15分程度で単離し，1細胞 PCRにより当該ペプチド遺伝子を回収し，大腸菌を用 いて当該ペプチドを発現精製した後，EGFRを過剰発現 するA431細胞に作用させた．その結果，全く新しい構 造のペプチド6種類がEGFRアゴニストとして作動する ことが判明した⁽⁵⁾

．以上の結果は，目的細胞存在率が極

めて低い細胞スクリーニングにおいて，本ロボットは有 効であることを示している．

上記のホモ複合体型受容体EGFRと同様に，ヘテロ複 合 体 型 受 容 体IL5Rを 構 成 す るIL5R

α

鎖，共 通

β

鎖，

JAK2チロシンキナーゼ，およびその基質である転写因 子STAT5aを酵母に共発現させた．FLO42を介してIL5 を細胞壁に同時発現させたとき，JAK2の自己リン酸化 に 続 きSTAT5aの リ ン 酸 化 が 誘 導 さ れ た こ と か ら，

IL5Rアゴニスト活性を有するペプチドスクリーニング も本ロボットで可能であることが示唆された（図4 中）⁽⁶⁾

．さらに，7回膜貫通型ソマトスタチン受容体

SSTR5およびヒトG

α

i3と酵母Gpa1のキメラGタンパク 質Gi3tpを共発現すると，ソマトスタチンに反応して酵

母内FIG1プロモーター下流に結合したEGFPが発現し た（図4右）⁽⁷⁾

．これらの結果は，酵母は広範なヒト受容

体をリガンド依存的に活性化可能な状態で発現できるこ と，また本ロボットと細胞壁結合型ペプチドライブラ リーを組み合わせると，新規な構造を有する同受容体作 動薬の （新生）スクリーニングが可能になるこ とを示している．

4. 嗅神経細胞

哺乳動物は数十万種類の匂い分子を嗅ぎ分ける能力を 有しているが，嗅覚受容体（OR）はヒトで約400種類，

マウスで約1,100種類と限られている．現在は，匂い分 子1種類が複数種類のORを異なる強度で作動させ，中 枢神経がその活性化パターン（ORレパートリー）を認 識することにより，膨大な数の匂い分子を認識できると 考えられている⁽¹⁰⁾

．しかしながら，膨大な匂い分子と

担当OR群との関係解析は遅々として進んでいない．こ れは各ORを任意の細胞において機能を完全に保持して 発現することが，現時点では非常に困難なためである．

そこでわれわれは，マウス初代嗅神経細胞にカルシウム 指示薬を導入してセルアレイ化し，任意の匂い分子で刺 激を行い，細胞内カルシウム濃度が一過性に上昇した細 胞を，網羅的に本ロボットを用いて単離した⁽¹¹⁾（図

5

_）

_．

これは，セルソーターでは不可能であった細胞形質の経 時的変化に基づく1細胞単離が本ロボットで初めて可能 になったため実現した（タイムラプス1細胞アレイサイ トメトリーと命名）

．得られた各嗅神経細胞は1種類の

図4^■ヒト受容体発現酵母による アゴニストスクリーニング

図5^■任意の匂い分子に応答するOR分子 のクローニング

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

ORのみを発現するため，1細胞RT-PCR（逆転写反応 産物のPCR）により各OR分子を同定した．得られた各 OR分子を発現する細胞は，スクリーニングに使用した 匂い分子により活性化された．以上の結果は，本ロボッ トを用いれば，ゲノム解析により同定されたさまざまな オーファンリガンドおよびオーファン受容体の網羅的解 析が可能となることを示している．

今後の展開

全自動1細胞解析単離装置は，従来のセルソーターに ハイスループット性では劣るものの，セルソーターには 困難もしくは不可能な能力を多数有することを紹介し た．その結果，従来では考えられなかった細胞スクリー ニングが容易に行えるようになった．さて，今後の本ロ ボットの用途展開は無限であり各研究者の想像力に委ね られていると言っても過言ではない．現在，われわれは 本ロボットを用いて，がん診断において注目されている が存在比率が極めて低い循環がん細胞の生きたままでの 1細胞単離，細菌叢に含まれる遺伝子資源として注目さ れている難培養性細菌の1細胞解析，そして，極めて貴 重な犯罪捜査用細胞サンプルの1細胞解析などに挑戦し ており，近い将来，これらの成果について紹介したいと 考えている．

謝辞：本研究成果の一部は，文部科学省科学研究費補助金・基盤研究

（S）（16H06314） お よ び 国 立 研 究 開 発 法 人 日 本 医 療 研 究 開 発 機 構

（15fk0310006h0004, 16cn0106214h0001）によるものです．全自動1細胞 解析単離装置の用途開発は，古河電工株式会社，アズワン株式会社，ス ターライト工業株式会社，パナソニック株式会社，良元伸男博士（大阪 大学産業科学研究所）と共同で行いました．

文献

  1)  U. Ben-David & N. Benvenisty:  , 11, 268  (2011).

  2)  N.  Yoshimoto  &  S.  Kuroda:  , 117,  394  (2014).

  3)  N. Yoshimoto, A. Kida, X. Jie, M. Kurokawa, M. Iijima, T. 

Niimi,  A.  D.  Maturana,  I.  Nikaido,  H.  R.  Ueda,  K.  Tate- matsu  :  , 3, 1191 (2013).

  4)  A.  Kida,  M.  Iijima,  T.  Niimi,  A.  D.  Maturana,  N.  Yoshi- moto & S. Kuroda:  , 85, 1753 (2013).

  5)  N.  Yoshimoto,  K.  Tatematsu,  M.  Iijima,  T.  Niimi,  A.  D. 

Maturana, I. Fujii, A. Kondo, K. Tanizawa & S. Kuroda: 

, 4, 4242 (2014).

  6)  N.  Yoshimoto,  Y.  Ikeda,  K.  Tatematsu,  M.  Iijima,  T. 

Nakai, T. Okajima, K. Tanizawa & S. Kuroda: 

, 113, 1796 (2016).

  7)  J. Ishii, M. Moriguchi, K. Y. Hara, S. Shibasaki, H. Fukuda 

& A. Kondo:  , 426, 129 (2012).

  8)  R. El-Haggar, K. Kamikawa, K. Machi, Z. Ye, Y. Ishino, T. 

Tsumuraya & I. Fujii:  , 20, 1169  (2010).

  9)  N. Sato, T. Matsumoto, M. Ueda, A. Tanaka, H. Fukuda 

& A. Kondo:  , 60, 469 (2002).

10)  B. Malnic, J. Hirono, T. Sato & L. B. Buck:  , 96, 713  (1999).

11)  M. Suzuki, N. Yoshimoto, K. Shimono & S. Kuroda: 

, 6, 19934 (2016).

プロフィール

立松 健司（Kenji TATEMATSU）

＜略歴＞1995年九州工業大学工学部物質 工学科卒業／1998年同大学大学院工学研 究科博士前期課程修了／同年日本学術振興 会特別研究生（DC1）／1999年大阪大学大 学院理学研究科博士後期課程退学／2000 年同大学産業科学研究所助教，現在に至  る＜研究テーマと抱負＞バイオ医薬創製  関連技術（分子標的医薬，嗅覚受容体， 

1細胞解析）＜趣味＞デジタルガジェット 

＜所属研究室ホームページ＞http://www.

sanken.osaka-u.ac.jp/labs/smb/

黒田 俊一（Shunʼichi KURODA）

＜略歴＞1984年京都大学農学部農芸化学 科卒業／1986年同大学大学院農学研究科 修士課程修了／同年武田薬品工業㈱研究 員／1994年神戸大学バイオシグナル研究 センター助教／1996年同助教授／1998年 大阪大学産業科学研究所助教授／2003年 ジュネーブ大学医学部客員教授／2009年 名古屋大学大学院生命農学研究科教授／

2015年大阪大学産業科学研究所教授，現 在に至る＜研究テーマと抱負＞バイオ医薬 創製関連技術（DDS, バイオセンサー，嗅 覚受容体，1細胞育種，醗酵）＜趣味＞映 画，旅行，起業＜所属研究室ホームペー ジ＞http://www.sanken.osaka-u.ac.jp/

labs/smb/

Copyright © 2017 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.55.684

日本農芸化学会

● 化学 と 生物