筆者は，はじめから膜小胞（membrane vesicle; MV）を研究 対象にしたのではない．異分野の研究者との共同研究から得 られた意外な結果がこの解説を書くきっかけになった．私た ちは産業廃棄物であるトリ羽毛を強力に分解する好熱性細菌 を神戸・有馬温泉源から単離し，この細菌が生産するプロテ ア ー ゼ に つ い て 研 究 を 推 進 し て い た(1 〜 4)．オ ー ソ ド ッ ク ス な生化学的手法ではこのプロテアーゼの精製は進まず，異常 な 高 分 子 様 態 が 存 在 す る と 確 認 さ れ た た め，当 初 プ ロ テ ア ソーム様のタンパク質複合体と考え，それを捉えるために電 子顕微鏡解析の専門家と共同研究を始めた．意外にも，細胞 より小さい脂質二重膜状構造が見えるとの結果がもたらされ た こ と が，今 回 取 り 扱 う 膜 小 胞（MV） と の 出 会 い で あ っ た(5 〜 7)．
膜小胞の歴史と形状
ま ず 最 初 に 断 っ て お き た い が，membrane vesicle
（MV）に対して正式な用語は定まっておらず，「メンブ ランベジクル」と片仮名を使用する研究グループもある ことから(8)，ここではMVという呼称を暫定的に使うこ
ととする．その言葉どおり受け取れば「膜でできた袋」
という意味なので，いわゆる「リポソーム」と大差な い．しかし細菌などから精製してきた人工的な再構成膜 に対してもこのような呼称が用いられた経緯が過去にあ るため(9)，混乱を招く場合があるので注意を要する．本 解説では，外膜が，酵母に見られる出芽のような形式で 外側に隆起して，袋状の塊となって細胞外に放出される 自然の細胞機能由来のものを指す（図1）．したがって，
グラム陰性細菌の外膜から放出されるMVは外膜小胞
（outer membrane vesicle; OMV）と称される場合も多 い．歴史的に見ると，細菌からMVが放出されるという 現象の報告は，50年以上も前にある．最初の報告を特 定するのは難しいが，グラム陰性で偏性嫌気性非芽胞形 成桿菌として主要な腸内細菌であるバクテロイデスで類 似する構造が電顕写真で1963年に報告され(10)，モデル 生物である大腸菌でも1966年にはリジン要求性変異株 をリジン制限下で培養したときの異常形態として報告さ れている(11)．その後，さまざまな細菌，特にグラム陰 性細菌を中心に報告が続き，グラム陰性細菌ではほぼ共 通する現象として理解されている(12)．これに加え，グ ラム陽性細菌についても報告が続き(13)，常在菌や病原
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【解説】
Bacterial Membrane Vesicles: Their Functions, Biogenesis, and Application
Kunihiko WATANABE, 京都府立大学大学院生命環境科学研究科
細菌が放出する膜小胞（Membrane Vesicle）の機能と生合成機構そして
応用に向けた研究動向
渡部邦彦
菌 か ら (14),
(15), (16)な ど で もMVが 確 認 さ れ，
現在も研究が拡げられている．加えて，アーキアにも報 告例が出てきていることから(17, 18)，今では原核生物全 体に共通するものと解釈されている．論文数的には総じ て2000年ぐらいまではMVを産生する細菌の報告が少 しずつ出されてきたが，ゲノム解析，プロテオームなど の研究手法が普及・充実するとともに，今やMVの産生 機構や，病原性，細胞間シグナル，ストレスなどと関連 する報告が爆発的に増加してきて，次章で説明するMV が産生される目的の解明に向けた研究がさまざまな細菌 に対して行われている．
細菌が産生するMVのサイズは，これまでの報告例か らおおむね20〜300 nm（＝0.02〜0.3 µm）ぐらいの幅が あり，グラム陽性細菌でも同程度のサイズの報告があ
る(18, 19)．しかし，中心的サイズはいずれも100 nm（＝
0.1 µm）近傍が多く，細菌細胞がおおよそ1 µmレベル のサイズであることを考えると，「MVは細胞ではない」
という大原則はサイズのうえからも証明される．真核細 胞である酵母は，出芽初期でも数µmあり大きく異なる ものの，同じ真核細胞由来のエクソソームでは100 nm ほどであることから(20)，このエクソソームと細菌由来 のMVは機能や構造のうえでかなりの共通点を有すると 考えられる（後述）．形については，MVは原則球状で あるが，産生する細菌によっては扁平あるいは棒状の異 常な形状(21)で報告されているほかに，超好熱菌の
属細菌がナノチューブ状もしくはナノポッド 状のMVを放出することも報告されている(22)．しかし，
形はMVの調製方法だけでなく，産生する細胞の生育段
階に大きく依存しているので，一概に括ることは困難で ある．また，集団の一部で誘導される細胞死でMV形成 されることも明らかになりつつある（豊福・野村ら，未 発表データ）．
膜小胞（MV）が産生される目的
MVはなぜ産生されるのかという目的に対し，大きく 分けて3つを考えている（図2）．共通する根本には，細 胞として有利に栄養を得たい，増殖して子孫を増やした い，その手段としてMVを産生するという単純な生命の 本質がある．そこに加わる因子として，病原性の有無が ある．
まず病原性のある細菌について見てみると，病原性因 子 で あ る 毒 素（た と え ば PAO1株での毒素タンパク質および酵素の
β
-ラクタマー ゼ，溶血性ホスホリパーゼC，アルカリホスファター ゼ，エステラーゼ，そしてタンパク質ヘモライシンなど も含む）をこのMVに包み込んで，ターゲットとする細 胞に接着し，送り込む（図2（A））というシステムがこ れまでの研究を主導してきた(23〜26)．同様に歯周病菌 では，外膜にある接着因子で あるアドヘシンなどの接着タンパク質が，MV外周にも 局在して特異的結合に役立つ高機能化が加わる(27)．大 腸菌でも類似するMVで輸送されるシステムが見つかっ ており，サイトライシンA（ClyA）や熱不安定性エン テロトキシン（LT）の例がある(28〜30)．つまり，相手細 胞を死に追いやるために毒素を送り込み，その後に起こ る細胞溶解などを通じて自分の栄養を獲得する目的でこ図1■細菌が作る膜小胞（MV）
透過型電顕解析によるグラム陰性好熱性細菌 ATCC25104Tと ATCC27634T（HB8） が 産 生 す る膜小胞（MV）．赤矢印がMVを指す．（産総 研関西センター川崎一則氏，同つくばセン ター小林恵美子氏撮影）
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のMVを用いるという狡猾な方法を取る．まとめると，
内膜を通過してペリプラズムまで分泌されたこれら病原 性因子を，外膜で包み込む形でMVとして放出し，ター ゲットとするほかの細胞に向かわせ，その宿主に病原性 毒素を送り込む．
病原性とは直接関係ないように見える細菌細胞間相互 作用が，MV産生のもう一つの目的である（図2（B））． 細菌細胞間相互作用で最も注目される事象はクオラムセ ンシング機構で，このシステムの誘導物質であるキノロ ン誘導体PQSがMVによって運ばれる(26, 31)．またアー キア は，sulfolobicinというバクテ リオシン様抗生物質ペプチドを作り，これをMVに入れ
て，近縁種 や
を殺す機能をもつ(17)．これらとは別に，細菌のバイオ フィルム形成にも，MVが重要性を担っている(31)．バイ オフィルムとは，フィルム状になった微生物の菌叢を指 すが，たとえばヒト口腔中や呼吸器系組織はもとより，
さまざまな環境中にあるマット状のものすべてを含む．
バイオフィルムの主成分は細菌の外膜表面にある細胞外 多糖（EPS）であるが，質的にも量的にも異なりながら も，そこにMVが放出されバイオフィルム形成に寄与し
ていることがわかっている．そのほかに輸送されるもの としてDNAなどの核酸も見られ(32)，バイオフィルムの 応用に向けたMVの利用の手掛かりになることが期待さ れ，今後さらに実例が増えると予想される．
3つめの目的は，MVを細胞外酵素のキャリヤーとし て用いることである．輸送先で酵素機能を駆使して反応 を進行させ，その結果，主として細胞外から栄養獲得す ることに寄与する．これは自然の酵素固定化法あるいは ナノリアクターとも言える（図2（C））．MVによる酵素 機能の安定化・保護効果も期待できる一方，上述の病原 性因子である酵素もこの場合に入るため，病原性との厳 密な区別は難しい．酵素のMV中での局在性について は，MVのまま酵素として機能する目的であればMV内 より表層への提示が合理的であると予想されるが，ター ゲット細胞と融合してMV内容物をターゲット細胞内に 放出するのであればMV内でも矛盾はない．
膜小胞（MV）の産生メカニズム
MVの生合成機構は，グラム陰性細菌だけについてみ ても異なるメカニズムが提案されており，グラム陽性細 菌のMVの報告とその生合成機構についても報告される なか，一つの機構に収束しない混沌とした状態が現状 である．単純な生合成機構ではなく，複雑な機構の組み 合わせがMVには必要というのが大方の見方でもあ る(18, 33〜35)．
グラム陰性細菌の細胞表層構造から，リポ多糖を含む 外膜，そしてペリプラズムの2つがMV生合成機構の議 論の中心である．まずリポ多糖については，特異なリポ 多糖分子との結合が知られている抗生物質ゲンタマイシ
ンの添加で， や ではそのリ
ポ多糖の減少に導かれるようにMVが増加する(36, 37)こ とが報告されている．さらにMg2＋イオン処理が細胞表 層に静電的変化を与えMV産生減少を導くことが知られ ている(31)．これらの現象においては，特定のリポ多糖 の減少により外膜とペプチドグリカン層の特異な相互作 用に欠損が生じてMV増加が起こると説明されている．
次にペリプラズムについては，ミスフォールドしたタン パク質の蓄積が，ストレスとなって外膜を押し出しMV 産生につながることも知られている(38, 39)．さらなる裏 づけとして，大腸菌ではペリプラズムに局在しプロテ アーゼとシャペロン機能をもつことが知られている の欠損が，ミスフォールドしたタンパク質の増 加・蓄積につながり，MV産生増加を引き起こした例が 報告されている(40)．
図2■膜小胞（MV）が産生される目的
（A）病原性毒素の送り込み；細菌細胞が産生する病原性毒素を MVに入れて，宿主細胞（多くは動物細胞）へ移送し，そこで毒 素として働かせ細胞死に至らしめる．（B）細菌細胞間相互作用物 質の送り込み；クオラムセンシング物質（QSシグナル）などを MVに入れて，細胞が増えて構築されたバイオフィルム中に放出 し，その物質による遺伝子発現を誘導する．（C）細胞外酵素の キャリヤーとしての利用；酵素タンパク質をMVに入れて細胞外 へ放出し，そこで主に高分子体を分解して低分子化し，栄養源と して利用できるようにする．
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細菌の生育環境にMVの産生も大きく依存している．
窒素分圧が低下すると， では莢
膜やバイオフィルムの素材となるアルギン酸生産の増加 とともにMVの産生が見られ(41)， でも嫌 気脱窒環境下でバクテリオシンの一つであるpyocin産 生とMVの産生がともに増加することが報告されてい る(42)．
未発表ながら，そのMV誘導機構には細菌間で保存性 の高い遺伝子が携わっていることが明らかにされつつあ る．これらを端緒にMV形成機構解明につながり，MV 生産がなぜ細菌間で一般的に起こるのかへの科学的証拠 の提示が今後急速に増えることは確実である．しかし，
MV産生制御が人為的に可能になることが本質の解明に は必要である．
膜小胞の応用に向けた研究動向
膜小胞の生合成機構が解明されていけば，微生物工学 的な応用での展開が期待され，すでにいくつか有望なも のが報告されている．まず取り上げたいのが，ターゲッ トタンパク質を抗原として載せた大腸菌MVを用いた簡 便なワクチン製造である(43)．確実にMVに搭載される タンパク質ClyAに緑色蛍光タンパク質（GFP）を融合 させ，この融合タンパク質を生産する遺伝子組換え大腸 菌培養液から超遠心沈殿画分を用いて得たMVを直接マ ウスに注射してGFPに対する抗体作製を可能にしてい る．これにより，組換え体タンパク質であっても，抗体 作製のための抗原タンパク質の精製操作は培地の超遠心 操作だけとなるため極めて簡単になり，また免疫賦活剤 であるアジュバントとの混合もあえて不要となることか ら，抗体作製の飛躍的な簡便化が期待される．
海洋性病原性細菌 の非タンパク質性 small RNA分子とMVの関係も注目すべきである(44)． VrrA（ regulatory RNA of ）と呼ばれる small RNAが，外膜タンパク質OmpAを減少させるこ とでMV産生を増強する．これはsmall RNA分子がMV で直接輸送されることを示すものではないが，このMV と構造や機能で共通点を有する真核生物におけるエクソ ソームでは，エクソソームで直接輸送されるsmall RNA ががん転移の原因物質として突き止められている(45)． エクソソームとsmall RNA分子によるがん転移関係を 逆手にとって，たとえば腸内細菌を用いて，small RNA と機能的に拮抗する物質（つまりは抗がん剤的機能をも つ物質）をエクソソームではなくMVに搭載できるよう に操作し，大腸を中心としたがん化（または転移）の予
防あるいはがん治療への応用が期待される．
筆者らは，最初に紹介した研究成果に基づき(1〜6)， MVを酵素のキャリヤーにした系の構築を進めることを 考えている．現在は羽毛分解などに有用なプロテアーゼ を主な対象として研究を進めているが，有用酵素タンパ ク質すべてが対象になる（図3（a））．このような系の構 築に有用なシステムとして，大腸菌の外膜タンパク質 OmpAを足場にしてMVに目的酵素を提示させた例が 最近報告されている（図3（b））(46)．OmpAにあらかじめ タグタンパク質（SpyTag）を融合させておき，別途タ グタンパク質を捕まえるタンパク質（SpyCatcher）と 機能させたい酵素（ホスホトリエステラーゼ）を融合・
発現させると，目的酵素がMV上へ提示される．今後 は，OmpA-Spyタンパク質の組み合わせだけでなく，
異なる細菌MVに適したタンパク質の組み合わせで，
図3■膜小胞（MV）の応用
（a）有用物質移送のキャリヤーとしての応用．細菌細胞が作る生 理活性物質や有用酵素タンパク質を，膜小胞（MV）を用いて細 胞外へ放出する．たとえばプロテアーゼであれば，細胞外の難分 解性タンパク質などの分解反応に応用可能である．（b）外膜に局 在するOmpAタンパク質を用いた目的タンパク質の膜小胞（MV）
への提示．大腸菌内で2つのプラスミド（プラスミドAとB）に それぞれ，外膜に局在するタンパク質OmpAとSpyTag（SpyT）
の融合遺伝子，そしてSpyCatcher（SpyC）とホスホトリエステ ラーゼ（Pte）の融合遺伝子が載っている．SpyTとSpyCは，互 いに結合性タンパク質の関係であるため，それぞれが別の融合遺 伝子として発現された場合，まず外膜タンパク質OmpAがMV内 に足場を作り，結合するSpyC/SpyTを介してPteタンパク質が MVの外膜の外側または内側に提示される．報告されている実施 例では，内側を向いていることが確認されている（46）．
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MVによるナノリアクターとも言える装置を作っていく ことがバイオテクノロジーの可能性を広げることになる と期待する．
おわりに
MVに関する日本の研究者は現状ではさほど多くな い．筑波大学の野村暢彦先生と一緒に世話人として企画 した日本農芸化学会（2015年3月岡山大会）のシンポジ ウム「細菌が放出する膜小胞（membrane vesicle）を 知っていますか？」が，国内では初めてMVに焦点を 絞った集まりではなかっただろうか．未解明の内容が多 いだけに，今回の解説でもまだ貧弱な知見を提示するに 過ぎなかったことは否めないが，細菌の病原性という根 源に迫る一方，エキソソームとがん転移，あるいはウイ ルスとの進化ともかかわる可能性があり，酵素タンパク 質のキャリヤーやバイオリアクターとしての応用だけで なく，細胞が自然にもつMVによるドラッグデリバリー システムを応用して有効な薬剤を送り届けるなど，疾病 を治療するという異なる視点からの方策を含め，今後の 展開が期待される内容であることを感じていただければ 幸いである．MVの国内研究者は確実に増えてきてい る．
謝辞：本稿の作成にあたり，日本農芸化学会2015年岡山大会で開催され たシンポジウムでのシンポジストの先生方には，本稿の推敲などでたい へんお世話になりました．加えて，原稿作成に協力してくれた京都府立 大学の微生物機能化学研究室の学生諸君にも感謝します．
文献
1) T. Matsui, Y. Yamada, H. Mitsuya, Y. Shigeri, Y. Yoshi- da, Y. Saito, H. Matsui & K. Watanabe:
, 82, 941 (2009).
2) Y. Shigeri, T. Matsui & K. Watanabe:
, 73, 2519 (2009).
3) 渡部邦彦：化学と生物，48, 751 (2010).
4) M. Kataoka, A. Yamaoka, K. Kawasaki, Y. Shigeri & K.
Watanabe: , 98, 2973 (2014).
5) 渡部邦彦：バイオサイエンスとインダストリー，72, 34 (2014).
6) A. Yamaoka, M. Kataoka, K. Kawasaki, E. Kobayashi, Y.
Shigeri & K. Watanabe: , 78,
1623 (2014).
7) 渡部邦彦：日本生物工学会誌，93, 412 (2015).
8) 豊福雅典，田代陽介，野村暢彦：バイオサイエンスとイ ンダストリー，70, 263 (2012).
9) 金沢 徹，二井将光，山登一郎，安楽泰宏： 生化学実験
講座14 生体膜，東京化学同人，1977, p. 361.
10) H. A. Bladen & J. F. Waters: , 86, 1339 (1963).
11) K. W. Knox, M. Vesk & E. Work: , 92, 1206 (1966).
12) T. J. Beveridge: , 181, 4725 (1998).
13) D. W. Dorward & C. F. Garon: ,
56, 1960 (1990).
14) L. Marsollier, P. Brodin, M. Jackson, J. Korduláková, P.
Tafelmeyer, E. Carbonnelle, J. Aubry, G. Milon, P. Le- gras, J. Saint André : , 3, e62 (2007).
15) E. Lee, D. Choi, D. Kim, J. Kim, J. Park, S. Kim, S. Kim, D.
M. Desiderio, Y. Kim, K. Kim : , 9, 5425 (2009).
16) J. Rivera, R. J. B. Cordero, A. S. Nakouzi, S. Frases, A.
Nicola & A. Casadevall: , 107,
19002 (2010).
17) D. Prangishvili, I. Holz, E. Stieger, S. Nickell, J. K. Krist- jansson & W. Zillig: , 182, 2985 (2000).
18) B. L. Deatheragea & B. T. Cookson: , 80, 1948 (2012).
19) T. N. Ellis & M. J. Kuehn: , 74, 81 (2010).
20) 吉岡祐亮，落谷孝広：バイオインダストリー，32, 5
(2015).
21) W. D. McCaiga, A. Kollerb & D. G. Thanassi:
, 195, 1120 (2013).
22) E. Marguet, M. Gaudin, E. Gauliard, I. Fourquauc, S.
Olouy, I. Matsui & P. Forterre: , 41, 436 (2013).
23) J. L. Kadurugamuwa & T. J. Beveridge: , 177, 3998 (1995).
24) J. L. Kadurugamuwa & T. J. Beveridge: , 178, 2767 (1996).
25) M. J. Kuehn & N. C. Kesty: , 19, 2645 (2005).
26) L. M. Mashburn & M. Whiteley: , 437, 422 (2005).
27) Y. Tashiro, H. Uchiyama & N. Nomura:
, 14, 1349 (2012).
28) S. N. Wai, B. Lindmark, T. Söderblom, A. Takade, M.
Westermark, J. Oscarsson, J. Jass, A. Richter-Dahlfors, Y.
Mizunoe & B. E. Uhlin: , 115, 25 (2003).
29) M. J. Kuehn & N. C. Kesty: , 279, 2069 (2004).
30) N. C. Kesty, K. M. Mason, M. Reedy, S. E. Miller & M. J.
Kuehn: , 23, 4538 (2004).
31) Y. Tashiro, S. Ichikawa, T. Nakajima-Kambe, H. Uchiya- ma & N. Nomura: , 25, 120 (2010).
32) S. R. Schooling & T. J. Beveridge: , 188, 5945 (2006).
33) S. R. Schooling, A. Hubley & T. J. Beveridge:
, 191, 4097 (2009).
34) A. Kulp & M. J. Kuehn: , 64, 163 (2010).
35) M. Toyofuku, Y. Tashiro, Y. Hasegaw, M. Kurosawa &
N. Nomura: , 226, 65 (2015).
36) T. T. Nguyen, A. Saxena & T. J. Beveridge:
(Tokyo), 52, 465 (2003).
37) M. F. Haurat, J. Aduse-Opoku, M. Rangarajan, L. Doro- bantu, M. R. Gray, M. A. Curtis & M. F. Feldman:
, 286, 1269 (2011).
38) A. J. McBroom & M. J. Kuehn: , 63, 545 (2007).
39) Y. Tashiro, R. Sakai, M. Toyofuku, I. Sawada, T. Naka- jima-Kambe, H. Uchiyama & N. Nomura: , 191, 7509 (2009).
40) C. Schwechheimer & M. J. Kuehn: , 195, 4161 (2013).
41) W. Hashimoto, Y. Miyamoto, M. Yamamoto, F. Yone- yama & K. Murata: , 16, 35 (2013).
日本農芸化学会
● 化学 と 生物
42) M. Toyofuku, S. Zhou, I. Sawada, N. Takaya, H. Uchi- yama & N. Nomura: , 16, 2927 (2014).
43) D. J. Chen, N. Osterrieder, S. M. Metzger, E. Buckles, A.
M. Doody, M. P. DeLisa & D. Putnam:
, 107, 3099 (2010).
44) T. Song, F. Mika, B. Lindmark, Z. Liu, S. Schild, A. Bish- op, J. Zhu, A. Camilli, J. Johansson, J. Vogel :
, 70, 100 (2008).
45) N. Kosaka, F. Takeshita, Y. Yoshioka, K. Hagiwara, T.
Katsuda, M. Ono & T. Ochiya: , 65, 376 (2013).
46) N. J. Alves, K. B. Turner, M. A. Daniele, E. Oh, I. L. Med- intz & S. A. Walper: , 7, 24963 (2015).
プロフィール
渡部 邦彦（Kunihiko WATANABE）
＜略歴＞1980年京都大学工学部工業化学 科卒業／1983年同大学院工学研究科修士 課程修了／1987年同農学研究科博士後期 課程修了／同年京都府立大学農学部助手，
その後講師，助教授，教授を経て，2008 年同大学院生命環境科学研究科教授／2014 年同研究科長，現在に至る．この間，オハ イオ州立大学生化学科（1981年），マサ チューセッツ工科大学生物学科（1994年）
留学＜研究テーマと抱負＞有用な微生物や 微生物酵素の探索とそれらの新機能の解 析・応用に関する複合的研究＜趣味＞西洋 芝の芝生作り
Copyright © 2016 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.54.720
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