出芽酵母発現システムを利用した天然物の生物合成

(1)

近年，天然物の生合成遺伝子の情報をもとに，有用天然物を獲得する取り組みが行なわれるようになってきた．中でも植物および真菌といった真核生物から単離された生物活性物質の生物合成に関する報告がなされてきた．ここでは，特に真核生物由来の天然物生合成遺伝子を出芽酵母の異種発現系を用いて発現させ，有用物質の生産に挑戦する取り組みについて解説する．

1929年のフレミングによるペニシリンの発見を皮切りに，自然界に生息する微生物，植物，海産無脊椎動物などを対象にして，これまでに数多くの有機化合物，いわゆる天然有機化合物（天然物）が発見されてきた．天然物そのものはもちろん，その合成誘導体など天然物を基盤とした様々な有機化合物は，古くから医薬品や栄養補助食品として幅広く使用されており，多くの人々の健康的な生活の営みを支えていることから，天然物が人類に与えてきた恩恵は大きい．古くから新規天然物の発見が，化合物の構造決定法の開発，化学合成法の開発，生

物活性の作用機序解明や生合成機構の解明などと相まって，有機化学分野の学問発展における中心的な役割を担ってきた．そのため，現代においても新たな新規天然物を取得することの学術的，産業的な重要性は不変である．ましてや，ポストゲノム時代である昨今，低分子有機化合物を，生体内に存在するタンパク質など生体高分子の機能を制御する道具や解析する道具として使い，生命現象を紐解く「ケミカルゲノミクス」あるいは「ケミカルバイオロジー」と呼ばれる分野が勃興し，その創薬との深い関連性から低分子化合物の重要性が注目されている^（1）

．そして，コンビナトリアル化学由来合成化合物

にも決して劣らないほど化学構造的，生物活性的に幅広い多様性をもつ天然物はこれらの学問を強く推し進める力をもつ．有名な例ではあるが，Schreiberらによって行なわれた免疫抑制剤FK506の研究において，FK506 の直接の標的タンパク質としてFKBP （FK506 binding protein）が同定されたことで，カルシニューリン/

NFAT経路を介したサイトカイン産生阻害作用が明らかにされたことは記憶に新しい．このように，天然物を起爆剤として生命現象が分子レベルで紐解かれることは枚挙に暇がなく，今後も次々と新規有用天然物が発見さ Engineered Biosynthesis of Natural Products in

Yuta TSUNEMATSU, Hisao MORIYA, Kenji WATANABE,

*¹_{静岡県立大学薬学部，}*²岡山大学異分野融合先端研究コア

【解説】

【2006年農芸化学研究企画賞】

恒松雄太 * ¹ _{，守屋央朗} * ² _{，渡辺賢二} * ¹

(2)

れることに期待が寄せられている．

ところが，現状では新規天然物の獲得がますます難しくなってきている．その理由としては，①長い歴史の中で数多くの天然物が探索され，すでに発見されてしまったこと，②採集できる生物，培養できる微生物は限られた一部の種であることから，これらが化合物多様性の限界となっていること，などが挙げられる．①については，近代の天然物化学を築きあげた先人たちの長年の努力の賜物であり，特に誌を中心とした日本人研究者の貢献が大きい．②については，深海やアマゾンの奥地など，極地に生息する生物を研究対象にすることで地球の生物多様性を最大限に生かすことが可能となる．より人手の届きにくい場所には未だ発見されていない生物資源が数多く存在するだろう．また，培養困難な微生物を培養する技術も着々と向上しつつある．

ただし，新規天然物を獲得するためのこれらのアプローチは決して真新しいものではなく，どちらかと言えば伝統的な天然物化学の研究手法である．すなわち，斬新な新規天然物獲得方法が開発されることで，現代の天然物化学に革命をもたらし，次世代の天然物化学へと駒が進むことが期待される．近年，天然物の生合成遺伝子の情報をもとに，新規天然物を獲得する取り組みが行なわれるようになってきた．本稿では，そのなかでも特に，出芽酵母を用いたタンパク質発現系による新規天然物生産への取り組みについて解説する．

出芽酵母タンパク質発現系による化合物生産

出芽酵母は，酒造における

アルコール発酵や味噌作りでの発酵に利用されている古くから我々の食生活になじみ深い微生物である．一方，

真核細胞のモデル生物としても利用されており，細胞周期や細胞内シグナル伝達系，タンパク質分泌系など様々な研究領域で解析に用いられてきた．出芽酵母が研究材料として広く利用された理由として，優秀な宿主‒ベクター系の確立に成功したことがあげられる．形質転換方法，選択マーカー遺伝子，自律複製可能なプラスミド，

タンパク質発現を誘導するプロモーター配列などが次々と開発され，現在では大腸菌とほぼ同様なタンパク質発現が可能となっている．そのうえ，酵母は真核生物であるため，原核生物である大腸菌で発現が難しいタンパク質の発現が可能である．酵母を用いて外来タンパク質を発現させる際には2つの方法がある．目的遺伝子を組み込んだベクターを細胞内にプラスミドとして保持させるか，あるいは目的遺伝子をゲノムに挿入させる方法であ

る．それぞれの方法に利点があるが，これらを組み合わせれば数多くの外来遺伝子を発現させることが可能である．

さて，放線菌や糸状菌は多くの二次代謝産物を生産することが知られているが，その生合成に関与する遺伝子は染色体上でクラスターを形成している．化合物にもよるが，1つの二次代謝産物を生合成するためには1 〜20 個程度の遺伝子の発現が必要になる．これらの遺伝子を酵母内で活性のある形で発現させることができれば，酵母の代謝経路を利用して化合物の生産が可能となる．多くの種類のタンパク質を活性化型で，しかも複数の遺伝子を発現可能な酵母は，化合物生産の宿主として魅力的であると考えられる．そのうえ，酵母は多くの薬剤排出ポンプを有していることから，生産させた化合物に対する耐性が大腸菌に比較すると飛躍的に強いと考えられる．加えて，適切な遺伝子を導入することで薬剤耐性を強化することも可能である．その他にも，増殖速度が速いこと，相同組換えによる遺伝子破壊が可能なこと，培養や取り扱いが簡単なことなど，多くのメリットが存在する．以上の観点から，近年，出芽酵母を宿主とした外来遺伝子発現系で有用な化合物を生産させる試みがなされてきた．

植物由来テルペノイドアルテミシン酸の生物合成マラリアは属の原生動物が蚊の唾液腺を介して血液中に侵入することにより発症し，世界中で毎年100万人以上の死者を出すほどの重篤な感染症である．その治療薬としてはキニーネ，クロロキンなどが従来使用されていたが，強い副作用や薬剤耐性マラリア株の出現が問題となっていた．ところで，キク科ヨモギ属植物であるクソニンジン（）は中国の伝承薬として知られ，古くから解熱やマラリアの治療に用いられてきた．1972年にその抗マラリア活性成分としてアルテミシニンが単離され，テルペノイド骨格を基本骨格とした，分子内に珍しいエンドペルオキシド構造を有する特徴的な化学構造が明らかにされた．

アルテミシニンは前述した抗マラリア薬と比べて副作用や薬剤耐性が少ないとされ，今日では薬物代謝を改善した数種の誘導体がマラリア治療の第一選択薬として使用されている．本化合物の強力な生物活性発現には，分子内に存在するエンドペルオキシド部位が重要な役割を担っていることが知られている．その作用機序については，①小胞体Ca²⁺-ATPaseオルソログであるPfATP6 の阻害説，②ヘモグロビン分解物であるヘム鉄と結合

(3)

し，マラリア色素産生を阻害することに起因する活性酸素産生説，など諸説あり，現在でも活発な議論が重ねられているところである．

さて，このようにマラリア治療に有用なアルテミシニン類であるが，現在，本化合物の供給は主に生産植物の栽培と誘導化反応による半合成によって行なわれている．ところが，生産植物の生育速度は遅く，そのうえ生産量が十分でなく，精製に多くの時間が費やされることなどのいくつかの制約から，膨大な需要があるにもかかわらず十分な供給が達成されていない．本化合物について，いくつかの合成研究例があるものの，複数の不斉点を有するがうえに安価で簡便な合成法は生み出されておらず，化学合成による実用的な化合物供給にも今しばらくの検討が必要である．何より，マラリアを発症する亜熱帯から熱帯地方には発展途上国が多く，経済的な理由から満足した薬物投与が行なわれていないことが問題となっている．以上のことから，より安価に，大量に抗マラリア特効薬を供給することが必要である^（2）

．このよう

な背景のもと，Keaslingらは，出芽酵母を遺伝子改変することで，単純な炭素および窒素源からアルテミシニン前駆体を迅速かつ高収量にて生合成させることに成功した^（3）

．

セスキテルペノイド骨格からなるアルテミシニンは，

その生合成中間体アルテミシン酸から半合成によって得られる．このアルテミシン酸は，メバロン酸経路あるいは非メバロン酸経路にて生合成されたファルネシルピロリン酸（FPP）を基質とし，テルペン環化酵素であるアモルファジエン合成酵素（ADS）が働くことで，まずアルテミシニンの基本炭素骨格を有した生合成中間体アモルファジエンが生合成され，続く数段階の酸化反応を経て生合成されることが知られている（図

1

_）

_．

そこで，まずはアモルファジエンの生産を目指し，

プロモーターの制御下に遺伝子を配置した高コピー型プラスミドを構築し，これを出芽酵母に導入した．すると，出芽酵母内在性のFPPおよび導入した ADS酵素の働きにより，確かにアモルファジエンが生図1■アルテミシン酸の生物合成

代謝経路のうち，遺伝子組換えによって活性化させた経路を太矢印で，抑制させた経路を点線矢印で示した．HMG-CoA : ヒドロキシメチルグルタリルCoA，IPP : イソペンテニル二リン酸，DMAPP : ジメチルアリル二リン酸，FPP : ファルネシル二リン酸，Met :l-メチオニン

(4)

産されたが，その生産量は4.4 mg/ と低収量であった．

このとき，高コピープラスミドのガラクトース誘導発現によりは過剰発現されており，細胞内に十分ADS 酵素が存在していると考えられたことから，基質である FPPの供給量の不足が疑われた．そこで，出芽酵母の FPP産生能を向上すべく，遺伝子導入ならびに破壊実験による代謝経路の改変を行なった．最終的に，①出芽酵母ゲノム上のプロモーター領域を相同組換えにてプロモーターに置換すること，②ガラクトース誘導による強制発現が可能な , ,

遺伝子を染色体上に挿入することによって，アモルファジエンの生産量を153 mg/ にまで向上させた出芽酵母株EPY224株を創出することに成功した．

①については，FPPをスクアレンに変換する酵素をコードするのプロモーター領域をメチオニンの存在にて転写活性が抑制されるのプロモーターへと置換することで，の発現量を低下させ，FPP がエルゴステロール生合成の経路にて消費されることを妨げている．ところで，FPPはメバロン酸経路の律速酵素であるHMG-CoA還元酵素（HMGR）の分解を誘導するシグナル分子であることが知られており，過剰な FPPの蓄積によってメバロン酸経路に負の制御がもたらされる．ところが，小胞体膜貫通ドメインであるN 末端領域を削ったtHMGRはFPPによる分解を受けず，

遊離型のタンパク質として酵素活性を示すことから，この遺伝子を出芽酵母内に導入した．なお，このとき同時にメバロン酸の生合成経路全般の活性化を目的とし，転写因子（本来はメバロン酸を含めたエルゴステロール生合成の活性化を担う）とFPP合成酵素であるERG20についても，強制発現可能な形として酵母染色体上に導入した．このように，出芽酵母が本来もち合わせている代謝経路を利用し，かつ適切に改変することで目的化合物の収量を大幅に上昇させることが可能となった．

続いて筆者らは，アモルファジエンからアルテミシン酸への変換を行なう酵母株の作製を目指し，まずはその変換反応を司る酵素の同定を行なった．アルテミシン酸をはじめとし，セスキテルペンラクトン骨格を有する化合物はキク科植物に特徴的であり，またその初めの反応はシトクロムP450酵素によって触媒されることが示されていた．そこで，バイオインフォマティクスによりキク科植物においてのみ高く保存されているシトクロム P450酵素の遺伝子配列をもとに縮重プライマーを設計し，クソニンジン由来cDNAプールから目的の遺伝子を増幅し，495アミノ酸残基数からなるシトクロムP450

酵素（）を同定した．当初の予測通り，本酵素のアミノ酸配列はキク科植物でのみ高く保存されており（identify : 約85%）

，また各種テルペノイドを水酸

化するシトクロムP450酵素群と近い系統であることも明らかとなった．

続いて，異種宿主発現によるでの酵素活性評価を行なった．まず，の完全長cDNAを取得し，これをプロモーター制御下に配置したプラスミドを構築した後に，先に作製した出芽酵母EPY 224株に遺伝子導入した．また，このときシトクロム P450酵素活性の再生に必要であるNADPH-シトクロム P450還元酵素遺伝子（）も同時に導入した．これら導入した遺伝子群の発現をガラクトースによって誘導すると，驚くべきことにアモルファジエンから3段階の酸化反応が一挙に進行し，目的のアルテミシン酸が 32 mg/ の収量で生産されることが明らかとなった．なお，これら3段階の酸化反応はでの実験においても確かめられている．

以上の成果により，これまでに栽培に数ヵ月を要し，

わずかな量しか得られなかったアルテミシン酸が，遺伝子組換え出芽酵母を用いることによって短時間で，なおかつ大量に得られるようになった．なお，Keaslingらのさらなる検討（プラスミドコピー数の上昇，薬剤耐性遺伝子の導入，ファーメンターの使用など）により，現在ではアルテミシン酸の収量は1 g/ と報告されており^（4）

，

アルテミシンが安価にマラリア患者のもとに届けられる日もそう遠くはないと期待できる．

植物由来ベンジルイソキノリンアルカロイドの生物合成

ベンジルイソキノリンアルカロイドは，植物アルカロイドのなかでも特に生物活性，化学構造の多様性に富む化合物群である．鎮痛剤モルヒネ，筋弛緩剤ツボクラリン，抗菌剤でもあり止瀉薬でもあるベルベリンなど，医薬品や漢方薬として使用されているものが数多い．商業的価値が高く，市場にも多く出回る有名なこれらの化合物もまた，天然物特有の化学構造の複雑さのために，有機合成による供給が難しく，現在でも天然からの採集に頼る場合が多い．生合成遺伝子と微生物を用いた発酵法によりこれらの化合物を大量に生産することが可能になれば，より安価に，安定的な市場への供給が期待できる．近年，2つの研究グループによって別々に，ベンジルイソキノリンアルカロイドの生物合成が達成された．

佐藤らは，大腸菌を用いてベンジルイソキノリンアルカロイドの重要な生合成中間体である（）-レ

(5)

図2^■ベンジルイソキノリンアルカロイドの生物合成

それぞれ大腸菌に遺伝子導入した部分を黒矢印，出芽酵母に遺伝子導入した部分をコバルト色矢印で示した．（A）ドーパミンからの（）- スコウレリンおよびマグノフロリンの生物合成，（B）（ , ）-ノルラウダノソリンを原料とした（）-テトラヒドロコルンバミン，（）-テトラヒドロベルベリンおよびサルタリジンの生物合成

(6)

チクリンの生産を検討した^（5）

．大腸菌にモノアミン酸化

酵素（MAO）

，ノルコクラウリン合成酵素（NCS），ノ

ルコクラウリン6- -メチル基転移酵素（6OMT）

，コク

ラウリン4- -メチル基転移酵素（CNMT）および3′-ヒドロキシ- -メチルコクラウリン-4′- -メチル基転移酵素（4′OMT）の各遺伝子を3種類のベクターを用いて導入し，基質であるドーパミンを外部供給にて取り込ませることで，（）-レチクリンを55 mg/ の収量で得ることに成功した．さらには，本大腸菌の培養液中に適切な修飾酵素〔シトクロムP450酵素（CYP80G2）あるいはベルベリンブリッジ酵素（BBE）〕遺伝子を導入した出芽酵母を加えて共培養することで，（）-レチクリンがさらに変換された化合物マグノフロリンを7.2 mg/

，スコウ

レリンを8.3 mg/ の収量で生合成させた（図

2

_-A）

_．シ

トクロムP450など大腸菌での発現が難しいタンパク質も，出芽酵母を用いて発現させ，大腸菌と混合培養することで十分に化合物生産が可能であることが示された．

一方，Smolkeらは，6OMT, CNMT, 4′OMTの遺伝子を導入した出芽酵母を宿主とし，（ , ）-ノルラウダノソリンを外部供給基質として（ , ）-レチクリンを生合成させることに成功している^（6）

．さらには，BBE，ス

コウレリン9- -メチル基転移酵素（SMT）

，カナジン合

成酵素（CYP719A）

，シトクロムP450酵素（CYP2D6）

遺伝子を適宜，単独あるいは組み合わせて導入することで，（）-スコウレリン，（）-テトラヒドロコルンバミン，（）-テトラヒドロベルベリン，サルタリジンの生産にも成功した（図2-B）

．これらの修飾酵素遺伝子はい

ずれもプラスミド上で構築しており，遺伝子導入するプラスミドを選択するだけで望みの化合物が得られることが示された．今後，さらに適当な生合成遺伝子を導入することで，モルヒネなど商用価値の高い化合物の効率的な生産が期待される．

糸状菌由来PKS-NRPSハイブリッド化合物の生物合成

我々の生活とも馴染み深い糸状菌は，強力な生物活性を示す数多くの二次代謝産物を生産することが知られており，皮膚病や呼吸器系疾患など感染症の直接の原因物質となっている．これらの天然物の多くは，ポリケタイド系骨格あるいはペプチド系骨格を有し，それぞれポリケタイド合成酵素（PKS）および非リボソームペプチド合成酵素（NRPS）によって生合成されることが知られている．一般的に，PKSならびにNRPSタンパク質は多くのドメインからなる巨大な酵素であり，特に大きなものではその分子量が1,000 kDaを越えるものも存在す

る．そのため，遺伝子クローニングや異種宿主での発現が比較的難しく，通常とは異なる工夫が必要となる．

近年，糸状菌のゲノム配列が次々と解読され，1つの種の糸状菌について10数個のPKSやNRPS生合成遺伝子が存在することが明らかになってきた．PKS-NRPSハイブリッド生合成遺伝子はそれらと比較すると稀な存在であるが，本生合成遺伝子から生合成される化合物はポリケタイド系とペプチド系の両方の特性をもつため，化学構造的に複雑で興味深い分子が生合成されていることが多い．また，その生物活性も様々であり，たとえば属糸状菌が産生するミトコンドリア呼吸鎖複合体III阻害剤フニクロシンや，属糸状菌が産生するアクチン重合阻害剤サイトカラシンなど，生化学研究に欠かせないツールとして活用されているものも数多い．ここでは，Tangらによって達成された NRPS-PKSハイブリッド生合成遺伝子の出芽酵母を宿主としたならびに発現による化合物生産^（7）

を解説する．

アスピリドンAは糸状菌の培養

液から発見された，ポリケタイドとフェニルアラニンに由来するPKS-NRPSハイブリッド型化合物である（図

3

_-A）

_{．その発見の経緯}

^（8）が非常に興味深いので，ここで少し紹介する．Hertweckらは糸状菌ゲノム中に多くのPKS，NRPS遺伝子が含まれていることに着目し，これらの遺伝子の発現量を調べたところ，というアミノ酸配列上PKS-NRPSハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子がまったく発現していないことを見いだした．遺伝子の近傍にはシトクロムP450, FAD 結合型モノオキシゲナーゼ（FMO）

，デヒドロゲナー

ゼ，トランスポーターなど，PKS-NRPS酵素によって構築された主骨格を修飾する酵素や薬剤耐性に関わる酵素と推測される遺伝子が含まれていたが，一方でジンクフィンガードメインを有する転写因子様タンパク質をコードする遺伝子も見つかり，これがの転写を調節することが推測された（図3-B）

．

そこで，

をクローニングし，を形質転換することで遺伝子導入したところ，興味深いことにの転写量が著しく増大し，その培養液中からはこれまでに生産されていなかった数種類の化合物の存在が認められるようになった．そのうちの1つがアスピリドンAであり，その化学構造を解析したところ，新規化合物であることが明らかになった．このように，アスピリドンA は通常の培養条件下では生産されないが，転写因子の発現に依存して生産が誘導される興味深い化合物である．自身の発現がどのように制御されてい

(7)

るかについても興味深い．

さて，話をもとに戻すと，アスピリドンAのその基本骨格はおよびによって生合成されると推測されていた．ApdAはそのN末端領域にケト合成酵素

（KS）

，マロニルCoA : ACP転移酵素（MAT），脱水酵

素（DH）

，メチル基転移酵素（MT），

ケト還元酵素

（KR）

，アシルキャリアプロテイン（ACP）というポリ

ケタイドに特徴的なドメインを有し，C末端領域には縮合（C）

，アデニル化（A），チオエステル（T），還元

（R）のNRPSに特徴的なドメインを含んでいる．一方で ApdCはエノイル還元酵素（ER）ドメインのみから成

り，相同性の高いタンパク質（たとえばロバスタチン生合成遺伝子の一つ，など）の機能から，ApdAによって形成された骨格を修飾する役割を担うことが予測された．そこで，まずはならびにの両遺伝子を出芽酵母で発現させることによって各酵素を獲得し，反応によるアスピリドンAの基本骨格の構築を検討した．

ところで，ApdAは439 kDaの超巨大タンパク質であることから，その完全長cDNAの取得は困難であると考えられた．そこで，Tangらはゲノムから予測されたエキソン配列をPCRよって増幅し，これ図3^■PKS-NRPSハイブリッド分子の生物合成

（A）アスピリドンAの化学構造，（B）アスピリドンA生合成遺伝子クラスター，（C）アスピリドンAの推定生合成経路．FMO : フラビン依存型モノオキシゲナーゼ，NRPS : 非リボソーム系ペプチド合成酵素，KS : ケト合成酵素，MAT : マロニルCoA:ACP転移酵素，DH : 脱水酵素，MT : メチル基転移酵素，ER : エノイル還元酵素，ER⁰: 機能をもたないERドメイン，KR : ケト還元酵素，ACP : アシルキャリアプロテイン，C : 縮合ドメイン，A : アデニル化ドメイン，T : チオエステルドメイン，R : 還元ドメイン

(8)

らを直列につなげることで人工的にイントロンを除去した遺伝子を作製し，これをプロモーター下に配置した出芽酵母発現用ベクター pXW58を構築した．目的遺伝子の増幅にcDNAではなくゲノムDNAを利用した本手法では，イントロンの位置を適切に予想する必要があり，仮に予測が外れてしまった場合にはフレームシフトなどにより酵素活性の消失を招く可能性が高い．彼らはApdAと相同性が高い数種のタンパク質とのアミノ酸配列を比較し，保存された領域を適切に選び出すことで適切なイントロンの位置を選び出している．構築したpXW58は化合物生産用出芽酵母株BJ 5464-NpgAに導入して遺伝子を過剰発現させ，抗 FLAG抗体による精製を行なうことによってApdAタンパク質を1.2 mg/ の収量で得た．

なお，この際に用いたBJ5464-NpgA株は出芽酵母液胞プロテアーゼ遺伝子ならびにが欠損し，

由来ホスホパンテテニルトランスフェラーゼがゲノム上に挿入されている．これにより，過剰発現させたタンパク質の精製途中でのプロテアーゼによる分解を防ぐとともに，NpgAによりApdAのACP ドメイン，Tドメインの効率的なホスホパンテテニル化が起こることで，ホロ化したApdAタンパク質の増加が期待された．

一方，ApdCについては，大腸菌BL21 （DE3）を宿主とした異種宿主発現系により，シャペロンタンパク質であるGroELおよびGroESとともに発現させることに成功した．

続いて，これらのタンパク質の活性を確認した．それぞれ25

μ

^mのApdAとApdCに対し，添加剤として NADPH， -アデノシルメチオニン（SAM）

，

l-チロシン，MgCl2, ATP, マロニルCoAを加え，反応をLC/MS にてモニタリングしたところ，UVスペクトルにて 279 nmに極大吸収を示す新たなピークが出現し，そのマススペクトルは / 332 ［M＋H］⁺を示した．これにより，本化合物がアスピリドンAの前駆体であると推測されたことから，で本化合物を大量生産させ，

NMRなどの各種機器分析にて構造決定することを試みた．

はじめに，の大腸菌発現用ベクターを出芽酵母用へと変換したpXW51を得た．続いて，pXW51と pXW58を出芽酵母BJ5464-NpgAに同時に導入し，その代謝産物をLC/MSで分析したところ，で得られた化合物と同一の保持時間，UVスペクトル，マススペクトルを示す化合物が4 mg/ の収量で得られた．本化合物を各種クロマトグラフィーで精製し，NMRスペク

トルでその化学構造を解析したところ，マロニルCoA 4 分子とフェニルアラニン1分子からなるテトラミン酸構造を有する新規化合物プレアスピリドンであることが明らかになった（図3-C）

．

以上の結果より，とがアスピリドンAの骨格を有するプレアスピリドンの生合成遺伝子であることが証明されるとともに，プレアスピリドンの

合成に成功した．今回の収量は4 mg/ と中程度であるが，今後の生産条件の検討により，さらなる収量の向上が期待される．また，アスピリドンAの生合成に関与すると推測されるシトクロムP450酵素などの修飾酵素遺伝子を併せて導入することで，異種宿主においてアスピリドンA生合成経路を再構築することが期待される．

スピロトリプロスタチン類の生物合成

最後に，糸状菌が産生する超微

量成分スピロトリプロスタチンの生物全合成を目指した筆者らの研究を紹介する．

スピロトリプロスタチン類は，静岡県大井沖海底土壌より分離された糸状菌 BM939株より発見された化合物である^（9）

．同糸状菌をはじめとした

属や近種である属糸状菌からは，スピロトリプロスタチンと同様にトリプロファンとプロリンからなるジケトピペラジン骨格を有する数多くの類縁化合物が発見されており，これらの化合物は5員環もしくは6員環が4ないし5つ連続した共通骨格を有している．

その生物活性としては，動物細胞に対する細胞周期阻害活性などが知られており，特に近年では，フミトレモルジンCが乳癌細胞に特異的に過剰発現している薬剤耐性膜タンパク質BCRPを阻害することが明らかとなり，新たな抗癌化学療法剤の候補として注目されている^（10）

．

スピロトリプロスタチンAおよびBは，

の約400 もの培養液中からそれぞれ，1.2 mgおよび 11 mg程度しか得られない超微量成分である．有望な薬剤リード化合物の候補であるにもかかわらず，さらなる詳細な生物活性の評価を行なうには化合物量が絶対的に不足している．その興味深い生物活性と特徴的なスピロ環構造から，多くの合成化学者の興味を引き，それぞれの研究グループにおいて各種独創的な方法論に基づく全合成が達成されてきた^（11）

．しかし，効率的な化合物供

給に関していえば，合成にかかる労力と時間，費用の観点から十分といえる合成ルートが開発されたとは言い難い．そこで筆者らは，スピロトリプロスタチン生合成に関与する遺伝子を取得し，出芽酵母を用いた異種宿主に

(9)

よる発現系でスピロトリプロスタチン生合成経路を再構築することによって生物による全合成を行ない，本化合物の効率的な供給を目指すとともに，その特徴的なスピロ環構造の形成機構を解明することを目的とした．

超微量成分の生合成機構の解明は非常に挑戦的な課題となる．これまでの生合成研究で用いられた手法は，化合物生産を司ると推定された生合成遺伝子を欠損させ，

得られた変異体の培養液から単離された生合成中間体の化学構造に基づいてその生合成経路を解析するというものがほとんどであった．ところが，超微量成分を研究対象とした場合，目的化合物が微量成分であるがゆえ，遺伝子変異体から生合成中間体を単離することが格段に困難となる．したがって，その生合成経路を証明するためには，生合成遺伝子の発現による物質生産確認が最適であると考えられる．また，異種発現による天然物生合成経路の特定は，欠損株の作製により得られた実験結果と比較して明確であり，学術的に意義深い成果となる可能性が高い．つまり，二次代謝産物に関して言えば，異種発現では宿主となる菌株には多くの場合存在しない生合成遺伝子の導入を試みることになる．したがって，そこで得られる化合物は，導入された遺伝子による合成産物

であることが直接的に証明される．さらに，異種発現ではいったん目的の生合成遺伝子をクローニングして発現系を構築するための分子生物学的操作が必要不可欠となる．そこで得られた発現系を活用し，化合物の合理的な設計に基づき生合成遺伝子を改変した後，望む誘導体を合成するための実験を効率的かつ迅速に行なうことができる．

スピロトリプロスタチンの類縁化合物であるトリプロスタチン類，フミトレモルジン類，ベルクローゲンの生合成については，いくつかのグループにより多くの遺伝子の機能が明らかにされている^（12）

．それによると，こ

れらの化合物のトリプトファンとプロリンからなるジケトピペラジン骨格はNRPS酵素（FtmA）により構築されてブレビアナミドFを生合成し，さらにプレニル基転移酵素（FtmB）によりトリプロスタチンBが，続いてシトクロムP450酵素（FtmC）およびメチル基転移酵素

（FtmD）が働くことでトリプロスタチンAが生成する

（図

4

_）

．続いて，シトクロムP450酵素（FtmE）により

インドール環とジケトピペラジン環が縮環してフミトレモルジンCを生成し，もう1つ別のシトクロムP450酵素（FtmG）が働くことで12

α

,13

α

-ジヒドロキシフミトレモルジンCが，さらにプレニル基転移酵素（FtmH）

図4■スピロトリプロスタチン類の予想生合成経路

筆者らの研究において出芽酵母内に再構築した生合成経路をコバルト色で示した．

(10)

が働くことでフミトレモルジンBが生成する．最後に，

α

-ケトグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ（FtmF）が働くことでベルクローゲンが生成する．

このように，主骨格を形成する1つのNRPS酵素と多くの種類の修飾酵素が働くことによって，数多くの関連化合物が生産されているトリプロスタチン類であるが，

ほぼすべての生合成遺伝子の機能解析が行なわれているにもかかわらず，スピロトリプロスタチン類に至る生合成経路やスピロ環形成に関与する生合成遺伝子については同定されていなかった．そこで，まずは出芽酵母によりスピロトリプロスタチン類の推定前駆体を生産させるシステムを構築することとし，その候補化合物としてデメトキシフミトレモルジンCの生産を検討した．

デメトキシフミトレモルジンCを生合成する遺伝子は， IFO4057株のゲノムDNAからクローニングし，自律複製可能な出芽酵母用シャトルベクターへ導入して目的の発現ベクターを構築した．導入した生合成遺伝子群は， , , （遺伝子名は長田らによる BM939株の命名^（13）に準拠した）であり，それぞれ酵素の機能はNRPS，プレニル基転移酵素およびシトクロムP450である．また，生合成遺伝子群に含まれるシトクロムP450酵素活性の効率的な再生のため，出芽酵母由来NADPH-シトクロムP450還元酵素遺伝子（）を併せて導入した．

次に，上記プラスミドを用いて目的化合物を出芽酵母発現系で高収量に合成するために，宿主染色体中に基質供給系遺伝子群を導入することとした．まずは，NRPS が適切にホロ化されるよう，由来ホスホパンテテニル基転移酵素遺伝子（）を導入し，一方でプレニル基を大量に供給するため，メバロン酸経路の初期段階であるマロン酸を基質としてマロニルCoAを生合成する酵素遺伝子（）およびアセトアセチル CoA合成酵素遺伝子（）を酵母染色体へ挿入した出芽酵母株SCKW14を作製した．上記で示したベクターおよび染色体に導入された遺伝子は，ウエスタンブロッティングによってそれぞれ酵母細胞内で発現することが確認された．

続いて，酵母宿主SCKW14を上記で構築した適切な発現ベクターで形質転換した後，液体培養によって2%

ガラクトースを加え30˚Cで発現誘導し，得られた培養液から各種クロマトグラフィーによって目的化合物を分離精製した．その結果，ブレビアナミドFを25 mg/

，

トリプロスタチンBを1 mg/

，デメトキシフミトレモ

ルジンCを0.1 mg/ の収量で得ることに成功した．スピロトリプロスタチン類を高収量で得るためには，今後さらなる遺伝子導入や培養条件の検討が必要である．

一方，スピロ環化に関与する酵素の同定を検討した．

Ganesanらはスピロトリプロスタチン類の全合成研究に

図5^■スピロオキシインドール環形成メカニズム

（A）有機合成による立体選択的，あるいは（B）立体非選択的なスピロオキシインドール環形成．（C）生体酵素によるスピロトリプロスタチンの推定生合成機構

(11)

おいて， -ブロモスクシンイミド（NBS）によるインドール環の酸化反応によって立体選択的に天然型の立体化学を有したスピロ環の構築を達成している^（14）（図

5

_-A）

．すなわち，インドール環の立体選択的な酸化反

応の後，セミピナコール型の転位反応が進行することによってスピロオキシインドール環が形成されると考えられた．興味深いことに，ジケトピペラジン環を形成している基質に対してNBSを作用させると，その立体選択性が失われ，スピロ炭素が体および体の2種類のジアステレオマーが生成する（図5-B）

．一方，天然から

はスピロ炭素の立体が体の化合物のみが得られていることから，生合成経路においてはインドール環の酸化反応が立体選択的に進行していると推測された（図5-C）

．

そこで，まずはインドール環の酸化反応を司る酵素を同定することを目指した．

ところで，近年，金沢県産のイガイから分離された sp.より単離されたノトアミド類はトリプロスタチン類と同様に，トリプトファンとプロリンから成るジケトピペラジン骨格を有しており，そのうちいくつかの化合物はスピロオキシインドール環を有している^（15）

．ノトアミド類の生合成に関与すると推測されて

いる遺伝子クラスターがすでに報告されており，

およびがコードする2つのFAD結合型モノオキシゲナーゼ（FMO）がインドール環の酸化に関与すると

推測されていた^（16）

．そこで，これら2つの遺伝子の配

列情報をもとに，これらと高い相同性を示す遺伝子をゲノム解読株 Af293株から検索したところ，

遺伝子を見いだすことに成功した．

遺伝子産物については，すでにWalshらによってその機能が解析されており，フミキナゾリンF のインドール環を酸化する酵素であることが明らかにされていた^（17）（図

6

_-A）

_{．そこで，}

_A1159株由来cDNAからをクローニングし，大腸菌による大量発現，そしてヒスチジンタグを用いた精製に供することでAfu6g12060タンパク質を得ることに成功した．続いて，その酵素活性を確認したところ，基質としてブレビアナミドFやデメトキシフミトレモルジンC を用いた場合，反応がまったく進行しないのに対し，基質としてトリプロスタチンBを用いると，分子量が16 増加した化合物への変換が認められた（図6-B）

．現在，

本生成物の化学構造を決定するため，前述の出芽酵母での異種宿主発現を検討中である．

まとめ

以上，出芽酵母を宿主とした外来遺伝子発現系によって化合物を生物合成することに挑戦する取り組みを紹介した．これらの研究は生物を利用したモノづくりであ図6■酸化酵素Afu6g12060とNRPS酵素Afu6g12050によるフミキナゾリンA生合成機構（A）とトリプロスタチンBを基質とした酸化酵素Afu6g12060の酵素反応物のHPLCにおけるクロマトグラム（検出波長：210 nm）（B）

(12)

り，まだまだ有機合成による精密なモノづくりには至らない部分も多いが，場合によっては有機合成で必須な煩雑な反応操作や極度の強酸・塩基性，酸化・還元条件，

高価な基質や金属触媒などのレアメタルを必要とすることなく，単純な糖類を加えた培養液を震盪培養するだけで目的の化合物を得ることが可能である．ただし，一般的に生体酵素は基質認識が厳密であることが多いことから，その基質特異性を拡大するような変異を導入するなどして，より柔軟に変換反応が達成されるように進化させることが必要だろう．それにより，新たな化合物を創製することも期待できる．

今回は紹介しなかったが，ブタノールなど石油燃料となりうる化合物の生産についても酵母を用いて大量に生産させる研究も報告されており^（18）

，いずれは酵母がエ

ネルギー問題を解決するようになる時代が到来するかも知れない．低分子化合物についても同様に，様々な医薬品や栄養食品が大量に安価に供給されることにより，世界中の消費者が差別なく，より健康的な生活を営めるようになることが期待される．

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出芽酵母発現システムを 利用した天然物の生物合成 - J-Stage

．そして，コンビナトリアル化学由来合成化合物

【解説】

【2006年農芸化学研究企画賞】