化学と生物 Vol. 50, No. 8, 2012 567
今日の話題
「合成代謝工学」による化学品生産
発酵工学のための新たなパラダイム構築にむけて
代謝工学に基づく微生物ゲノムの改変は，発酵生産能 力の改良を目指すうえで今や最も重要な戦略の一つと なっている．その一方で代謝工学的手法により設計・導 入した改変が，期待どおりの生産性向上に結びつかない という事例も少なくない．これは，われわれが特定の代 謝産物の生産性増大を目論んで微生物ゲノムに人為的改 変を加えようとも，その改変が彼らの生存や増殖にとっ て不利に働くものであった場合，何らかのセーフティー ネットワークが発動し，改変の効果が打ち消されるため であるとされる．発展著しい各種の-omics技術を駆使 し，いわゆる「生命のロバスト性」と呼ばれるこれら一 連のネットワークをより深く理解し制御しようという試 みが，近年の代謝工学分野における潮流の一つとなって いる．
一方，筆者らのグループでは，これとは全く異なるア プローチで代謝工学が抱える諸問題を克服することを試 みている．すなわち，生きた細胞の代謝経路を改変する のではなく，あらかじめモジュール化した代謝酵素を任 意に組み合わせ，物質生産に特化した経路を で 再構築しようというものである．本法を用いれば，微生 物の生物活動に依存しない生産プロセスが構築可能であ るため，温度・pH等の単純な操作パラメーターの制御 のみで変換反応が実施可能となり，反応条件のフレキシ ビリティーも格段に向上する．上述した生命のロバスト 性に起因する問題も含め，従来の発酵生産につきまとっ てきた「生き物を取り扱う」がゆえの問題を回避するこ とが可能となる．
しかし，ここで問題となるのは複数の代謝酵素を副反 応を伴わないレベルにまで精製する作業の煩雑さであ る．筆者らはこの煩雑さを回避するため，（超）好熱菌に 由来する耐熱性酵素に着目した．まず，耐熱性酵素遺伝 子を大腸菌などの中温性宿主微生物内で過剰発現させ る．得られた組換え菌を70oC程度の熱処理に供した後，
触媒としてそのまま利用する．この結果，宿主由来酵素 の大部分が熱変性により不可逆的に失活し，精製酵素と 同レベルの高い選択性を有した生体触媒が容易に得られ る．本法は異種宿主内での機能的発現さえ可能であれ ば，あらゆる耐熱性酵素に対して適用可能である．した
がって代謝経路を構築する一連の酵素をモジュール化 し，これらを任意に組み合わせることによって，化学品 生産のための人工代謝経路をオンデマンドで構築できる
「合成代謝工学」なるアプローチが可能となる．
での代謝経路の再構築とこれを用いた物質生 産の例はこれまでにも多くの報告がなされており，古く は1985年にWelchとScopesによって報じられた酵母由 来の解糖系酵素群およびATPaseを用いたグルコースか らのエタノール生産が挙げられる（1）．本報告によれば，
1 Mのグルコースから8時間の反応で，理論収率である 2 Mに迫るエタノールが生産されており，反応速度と対 基質収率のみで比較すれば，通常の発酵法を凌駕する生 産性が得られている．また近年では，岩田と奥により耐 熱性酵素を用いたエタノール生産が報告されている（2）． 好熱菌を遺伝子ソースとすることで，酵素の安定性が格 段に増したことに加え，精製ステップを大幅に簡略化さ せることが可能となっており，このアイデアはわれわれ の研究立案にも欠かせないものであった．本系は余剰 ATPの再生反応を含まないため，高濃度基質の利用に は適さないが，5 mMのグルコースから9 mM程度のエ タノール生産が可能であり，対基質収率の高さはWelch とScopesのシステムと同等である．
ただし，これらの報告例で再構築された代謝経路は，
いずれも天然のエタノール発酵経路をそのまま模倣した ものである．代謝の生理的意義がATPやNAD（P）Hな どの補酵素を通貨としたエネルギーや還元力の獲得（異 化代謝）ならびに，ここで得られたエネルギーを利用し た細胞構成物質の合成（同化代謝）にある点を考慮すれ ば，天然の代謝経路の一部を無作為に「コピー＆ペース ト」しただけの合成経路では，補酵素の過不足による反 応停止が避けられない．適当な補酵素再生反応の導入も 一つの解決策ではあるが，微生物由来酵素の多様性を活 用すれば，これらの方法に頼らなくとも補酵素収支の問 題を克服することが可能となる．たとえばグルコースか らのエタノール生産経路の場合，真核・原核生物におけ るEmbden‒Meyerhof （EM） 経路を経ればグルコース1 分子当たり2分子のATPが生産される（すなわちADP 2分子が消費される）．一方，一部のアーキアにはADP
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依存型キナーゼなどのユニークな補酵素要求性を有した 酵素からなる変形EM経路の存在が知られている（3）．原 核・真核生物型EM経路においてグリセロアルデヒド-3- リン酸 （GAP） から3-ホスホグリセリン酸 （3-PG） への 変換は，GAPデヒドロゲナーゼ （GAPDH） によるリン 酸依存型の脱水素反応とホスホグリセリン酸キナーゼ
（PGK） による脱リン酸化反応の2段階から成り立って おり，この一連の反応でGAP 1分子当たり1分子の ATPが産生される．これに対し，変形EM経路中では，
リン酸非依存的にGAPを脱水素するGAPフェレドキシ ン 酸 化 還 元 酵 素 （GAPOR） や non-phosphorylating GAPDH （GAPN） により，GAPは1段階の反応で直接 3-PGへと変換される．GAPNが触媒する反応ではATP 生産は伴わないため，原核・真核生物型EM経路中の GAPDHおよびPGKをアーキア由来のGAPNに置換す ることでATP収支の合致したキメラ型EM経路を構築 することが可能となる（図1）．
筆 者 ら は， 由 来 の
GAPN（4）ならびに 由来の原核生 物型EM経路酵素群を組み合わせたキメラ型EM経路を
で構築し，これを用いたグルコースからの乳酸 生産に取り組んだ．なお，本経路の最終ステップとなる ピルビン酸から乳酸へのNADH依存的還元反応は通常，
乳酸デヒドロゲナーゼ （LDH） によって触媒されるが，
由 来LDHは，比 較 的 低 濃 度
（0.5 mM以上）のNAD＋存在下で阻害を受け，同経路内 ではほとんど機能しないことが明らかとなった．そこで われわれは，同細菌より，LDHと同様の反応を触媒可 能な別の酵素を探索し，リンゴ酸/乳酸デヒドロゲナー ゼ （MLDH） を選抜した．生きた細胞を用いない合成代 謝工学では，転写・翻訳レベルでの調節作用に束縛され ない物質生産が可能であることは言うまでもないが，こ のように異なる代謝経路（もしくは異なる微生物）に由 来する酵素をアッセンブルすることによりタンパク質レ ベルで作用するアロステリック調節をも回避できる点に は着目すべきだろう．こうして構築されたキメラ型EM 経路を用い，現在のところ6 mMのグルコースから理論 収率どおりの乳酸（すなわち12 mM）を生産させるこ とに成功している．最終生産物濃度という点からは，ま だまだ満足する値には程遠いものの，合成代謝工学の魅 図1■ 原 核/真 核 生 物 型EM経 路
（左），アーキアにおける変形EM経 路（中），および筆者らが構築した キメラ型EM経路（右）
変形EM経路で特徴的に見られる反 応を白抜き矢印で示した．
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力の一つは反応条件のフレキシビリティーの高さにあ り，酵素濃度を高めることで生産速度ならびに生産物濃 度を向上させることは十分に可能であると考えられる．
あるいは，固定化処理などにより一連の代謝酵素を空間 的に近接させる「spacial organization」も，合成代謝工 学による化学品生産のフィージビリティー向上を目指す うえでの魅力的な技術的課題となろう．
1） P. Welch & R. K. Scopes : , 2, 257 （1985）.
2） 奥 崇，岩田英之： セルロース系バイオエタノール製造
技術 ，エヌ・ティー・エス，2010, p. 291.
3） 大島敏久，櫻庭春彦：蛋白質 核酸 酵素，54, 134 （2009）.
4） K. Matsubara, Y. Yokooji, H. Atomi & T. Imanaka : , 81, 1300 （2011）.
（本田孝祐，岡野憲司，大竹久夫，大阪大学大学院工 学研究科生命先端工学専攻）
大 西 利 幸（Toshiyuki Ohnishi） ＜略 歴＞2000年大阪大学理学部化学科卒業／
2003年京都大学大学院農学研究科応用生 命科学専攻博士前期課程修了／ 2004年日 本 学 術 振 興 会 特 別 研 究 員DC2（京 都 大 学）／2006年京都大学大学院農学研究科応 用 生 命 科 学 専 攻 博 士 後 期 課 程 修 了（農 学）／同年同大学化学研究所博士研究員／
2007年カナダ・ブリティッシュコロンビ ア大学博士研究員／ 2008年日本学術振興 会海外特別研究員（ブリティッシュコロン ビア大学）／2009年静岡大学若手グローバ ル育成拠点特任助教（テニュアトラック）， 現在に至る＜研究テーマと抱負＞化学的視 点から植物の生存戦略＝生命現象を物質レ ベルで解き明かすこと＜趣味＞阪神タイ ガース，書店めぐり，スポーツ観戦
小笠原 渉（Wataru Ogasawara） ＜略 歴＞平成9年長岡技術科学大学大学院工学 研究科博士後期課程情報・制御工学専攻修 了・博士（工学）／同年岩手大学工学部応 用分子科学科・助手／平成10年連合王国 ブリストル大学化学科・客員研究員／平成 12年長岡技術科学大学・生物系・助手／
平成19年長岡技術科学大学・生物系・助 教／平成20年長岡技術科学大学・産学融 合トップランナー養成センター・産学融合 特任准教授／平成22年長岡技術科学大学・
生物系・准教授，現在に至る＜研究テーマ と抱負＞糸状菌トリコデルマ・リーセイに おけるセルラーゼ誘導生産メカニズムの解 明，糸状菌トリコデルマ・リーセイ日本型 系統樹の進化因子の解明，比較ゲノムを用 いた菌体内進化分子工学系の確立，糸状菌 トリコデルマ・リーセイの形態とセルラー
ゼ生産能の関係について，オリゴペプチド 特異的タンパク質分解システムの解明／カ ビの生き方と生存戦略を研究し，学ぶこと で，謙虚に地球環境に共存できる人類社会 は形成することについて＜趣味＞大学の近 くの温泉で，ボーっとしながらカビの生き 方を考えること
岡 野 憲 司（Kenji Okano） ＜略 歴＞ 2004年神戸大学工学部応用化学科卒業／
2009年同大学大学院自然科学研究科分子 物質科学専攻博士後期課程修了（工博）／
同年日本水産（株）中央研究所研究員／
2011年大阪大学大学院工学研究科生命先 端工学専攻特任助教／同年同研究科助教，
現在に至る＜研究テーマと抱負＞ビジネス として成立しうるバイオプロセスの構築を 実現したい＜趣味＞散歩
