第 6 回石橋雅義先生 記念講演会講演
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光ルミネッセンス分析法の 基礎的研究とその応用
ーポルフィリン金属錯体及びクロロフィル類 の発光特性とその分析化学への応用一
西
JI I
泰 ロ（近畿大学理工学部教授西川泰治先生は、
1984
年度日本分析化学会学会賞を標記の業績により授賞さ れ、それを記念いたしまして昭和61年4月26日に開催されました第6回石橋雅義先生記念講演会にて 御講演いただきました。ここにその内容をもとに、御寄稿いただきましたので、掲載いたします。1
・はじめにポルフィリンの金属錯体及びクロリン骨格を有 するクロロフィル類は生物に関与して酸素の運搬，
生体エネルギーの生産，物質代謝，光合成などに 重要な役割りを演じている 。例えば亜鉛プロトポ ルフィリンは酵母中に含まれ，金属酵素モデルと
してその生化学機作が検討されている 。また金属 ポルフィリン類は触媒やガン治療に有効とされ，
さらにある種の金属ポルフィリンはコラーゲンを 選択的に染色するのでラベリング試薬として役立 ち，化学の各分野で注目されている 。また水圏に おけるクロロフィル (chl.）類は主として植物プ ランクトンに依存するので，光合成に関与して水
H2C=HC R
C2H5 H2C=HC
b b
3
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‑ a
H o c o
0 H l
o o l C y l h
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c
R
CH3
CH3 R
CH3
ch
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C O O H COOCH3 R: C2H5‑‑c1,CH=CH2‑ ‑c2
Chlorophyll c
O H C
吼 c~H2. .` COOCH3 C02Phytol
CH3
Phytol‑‑‑C20H39
Chlorophyll d
Fig, 1 Structure of chlorophyl Is
※ 近畿大学理工学部教授
2, 2
(1987) (45) 81
中の有機物生産を支配する最も 重 要 な物質で ある 。一般にchi.類は生物活性の失活過程にお 釘 いて，中心金属M gを容易に脱離してフ ェオフィ
チン (pheo.）となる 。 さらに側鎖の分解により
多種多様な分解物へ と変化する 。従ってchi. な hv
らびにpheo. をはじめ初期分解物の分離定量 は水
圏における生物活性の消長を示唆する指標として
地球化学的，生物化学的に重要である 。現在，こ S
。
れらポルフィリン金属錯体及びク ロロ フィル類の 定量には吸光度法（ソ ー レ帯あるいはQ帯）が汎 用されている。しかし ，一般にこれらの化合物の ある種のものは蛍光 ・りん光を発し，またポルフィ
リン金属錯体の中には熱活性化遅延蛍光を発する ものがあるので吸光度法よりは特異的，高感度な 分析が可能である 。そこでポルフィリン金属錯体
及びchi．類の発光特性とその分析化学への応用
について概説する 。
2.
ポルフィリン及びクロロフィル類の熱活性 化遅延蛍光特性とその分析化学への応用 プロ トクロ ロフィルa ,プロ トポルフィリンジ メチルエステルの金属錯体 (Mg‑, Zn‑, Cd‑, Sn‑P P D E ) やchl.cなど多くのポルフィリン化合物
(Fig. 3参照）はFig. 2に示したように三重項状
態T1にある分子が熱的に励起され（△E)，系間交
差 (k'isc) により励起一重状態におしあげられ，
これより蛍光放射する所謂，熱活性化遅延蛍光 (Thermally activation delayed fluorescence ; T A D F ) を発する1)2)3)。 これら化合物の発光特性 をTable 1に示す。一般にT A D F強度はりん光強 度と同様に三重項の励起子濃度 [T』に比例し，
一重項 (S) と三重項 (T) 間の混ざり合いの程 度が [T』を支配すると考えることができる 。 そ の混ざりあいの程度（ 入）は次式で示される 。
入＝Vso/
I
Et ‑ EsI
この式はSとTの混ざり合 い（入）が大きく ，かつSとTのエネルギー差(Et82 (46)
k f
K! l S C
S
。
+ hII→ & MS1~T1M
S,X‑ >S
。
+ h v,F ig . 2
AE
=
吸 収 系間交差 熱励起 T A D F T A D F
Tl
‑ Es) すなわち △Es‑t に逆比例することを示し
ている 。Table 1よりわかるように，ポルフィリ ン 類では△Eの大きさはchl.a>Mg‑PPDE, chl.b>
Zn‑TPPS3> chl.c> プロ トク ロロ フィルa> Cd‑P P D E> Zn‑PPDE'.:::: Sn‑PPDE>Zn‑pheo .c の順で あ り 最 も 大 き い△E値をしめすchl.a はT A D F を示さない。すなわち，△E < 46kJ/ mol のポル フィリン類，特に△E= 34 42kJ / molの化合物
ではT A D F及び常温りん光 (RTP) 双方の発光が
濾紙に固定した状態で簡単に測定できる 。従って これらの化合物はペ ーパ ークロマトグラフィ ーに より分離後， T A D Fにより定量できる点で優れて おり，各種の分析化学的応用面を展開してくれる。
プランクトンの中のchi. c及びpheo.cのT A D F法2)
濾紙上に固定したchl.c はFig.4 に示したよう に特異的なT A D F （励起：430nm/ T A D F : 604nm) を発するが， chl. a, bはT A D Fを示さない 。pheo.
cはT A D Fを示すが，その強度はchl.cの大約1 / 120で極めて低値を示し， chl.cのT A D F測定には 殆ど影響しない。 しかし，遠紙に保持したpheo.c に亜鉛を貫入させZ n‑pheo.cとすれば， Zn‑pheo.c
海洋化学研究 2 , 2 (1987)
のT A D F強度はpheo.cの約200倍， chl.cの約2倍 に増加する 。この特性を利用して水中プランクト
ンのchl.c及びpheo.cを精度よく定量できる 。天
然水中のchl.c及びpheo .cを本法により測定した
結果の一例をTable 2に示す 。本T A D F法の検出 限界はO.lng (C.V.; 6 %）であり，吸光度法では 検出できなかったpheo.c及びchl.cを精度よく定 量できる 。また本法によりプランクトンの生産及
び死滅によるpheo.cへの変換を追跡することも できる (Fig. 5参照）。
プロトクロロフィルのT A D F法4)
chl. 類はその前駆体であるプロトクロロフィ
ル(protochl.）の光作用により生産される (Flg.
6 )。protochl.a はTable 1に示したようにT A D F発光するので， T A D F法でそのchl. 類への光合 成過程を定量的に追跡することができる。
言 ／
HJ悶臼
JRHJ H:／ 言
RCHH／ 言
Hc Hl:H35R C2Hs‑c1. CH• CH2・・C2 Chlorophy II c
R, CHJ・・・a, CHO・・・b Pheophytin c Zn‑pheophytin c Protochlorophyll
口
： ： 言 ：
c： 2 H:
H:2:：言口賣謹ロニ戸
CH2 は/OCHJ HJCOC 、H2￠ や So,.J夕 尺/CH2mCOOH HOOC/ CHJ 出CH?co b
R• CHJ‑‑‑a 'CH0‑‑0‑b
Protochlorophyllide Mg‑PPDE Zn・TPPSi Hernatoporphyrin Fig. 3 Structure of porphyrins
Table 1. Luminescence properties of porphyrins Fluorescence TAOF △Es‑T Compounds
入em/nmて(Ins Ex /nm Em/nm 1 /ms R I. {k」mo1"1) P P O E 634 11 ム15 630 ‑ 0.007 lv1g‑PPDE 597 81 ム22 595 1.,5 0.065 t..3.1 Zn・ P P DE 5 8 8 5.2 ムI7 567 29 0.14 3 7. 2
Cd‑PPDE 597 600 ‑ v.w 3 7.し
Sn‑PP D E 588 5.2 ム16 587 9ム．1.0 3 7. 2
TPPSJ t..65 659 ‑ 0016
Zn‑TPPSi ム30 607 25 0.40 ム23
Chlorophyll a 666 non TAOF 5B.5
Chlorophyll b 6 5 0 ム60 635 ‑ v.w. 43.l Chlorophyll c 635 ム30 601, 36.8 0 5 t..0.2 Pheophytin c 657 ム18 638 ‑ 0013 Zn‑pheophylin c t.2 2 595 221 1.0 3 A. 7 Protochlorophyll a 629 4 2 8 605 25 0.25 38.5
Table 2 Results of analysis using delayed fluorometry and absorption spectro‑
scopy for phytoplankton in natural water
Locaton of T A D F m ethod Spectrophotmetry S a m plinq C hl.c Pheo.c Chl.c C hi.a C hl.b
(uq/ 1 ) (uq/ 1 ) Pond in Hiqashi
Osaka C ity lse Bay Osaka Bay Yodo River
1.5 2.5 4.3 0.0091
0.9 1.6 9.2 0.43
none 53 1.5 13.4
4.6 18 55 32
21 2.9 none
Optic.;I micror;rJph of Ast('rionl'lla 1orrnosa
( X 500)
賣，， 骨心
(lnduct;on phase)
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Wa,‑1,nglh(nm)Fig. 4 Zn‑pheophytin c (3.7ng/ 5 m m中spot), 31°C、Chlorophyll c (10ng/spot), 32°C, Phe vphytinc (9.6ng/spot), 67°C ; 1 M ‑N a O H 1
μ for Chl.c and Pheo.c, 1 M ‑ N a O H 5μ s for Nn•pheophytin c.
Fig. 5 Relationship betwenn number of pla‑
nkton per milliter and cultivation days.
‑ ‑ C
←
: Total concentration of chl.c and phe.c (ug/1)● :Number of Plankton per ml.
―
―←
:Chl.c % ‑‑@‑‑‑‑：Phe.c %H
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Fig. 6 Chlorophyll degradation process in sediment samples.
84 (48) 海洋化学研究 2 , 2 (1987)
3 .ポ ル フ ィ リ ン 及 び クロロフィル類の蛍 光特性とその分析化学への応用 1) クロロフィルa,b 及びフェオフィチンa,b
の蛍光特性とその天然水への適用：
chi.a, b及びpheo.a,b の蛍光特性をFig. 7に示 す。
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Fig. 7 Fluorescence spectra of chlorophylls a, b and pheophytius, a, b in acetone ( A) : chlorophyll a (430/ 670nm) (B ) : pheophytin a (410/ 670nm) (C) : chlorophyll b (460/ 650nm) (D ) : pheophytin b (440/ 655nm)
互いに酷似した蛍光ス ペク トルを示すが，ペーパー クロマ トグラ フィーで容易に分離可能である こと を利用し， chl. a,b 及びpheo.a! b の迅速，簡便な 定量法を組立る こと ができる 。 しか し，これら相 互の含有比が著しく異なったり，超微量の定量に
は励起微分スペク トル法が有効であり，
hi. 高次分解物の影響 を除去するために ペーパ ー さらにc
クロマ トグラフィ ーが有効である (Fig.8 参照）。
環境試料中のchl. a,b 及びpheo .a,b は他の 3 成分がそれぞれ単独で20倍量共存する場合につい ても，相対標準偏差4％以下で，定量限界O.lppm の超微星定量が可能である 。
2) プロポトルフィリンジメチルエステル (P P
D E ) 金属錯体の蛍光特性 ：
P P D Eの金属錯体は金属酵素モデルとして生化
学の基礎的研究が盛んに行われている 。また，分 析化学的には金属 ポルフィリン化合物の代表と し てその分離 ・定量に対関する研究が行われている 。 代表的な金属P P D E錯体の蛍光特性をTable 3 に 示した 。 いずれの錯体も蛍光の 感 度 指 数F.S.I.
は10 ‑ 2 1 0 ‑ 3の値を有し，極めて強い蛍光性錯 体であり，その蛍光シグナルは蛍光検知高速液体
クロマ トグラフ ィーに利用できる ％
ヽ
贔 ＾﹀
員
(1) : p h e o p h y t i n (2 ) : p!:e:::>phyt i n a
b
( R f ) (0. 9 7) (0. fl 2 )
(3 ) :c h l o r o p h y l l (4) : c h l o ro p h y l l
Fig. 8
a
(0. 4 6) b (0 . 2 6) o r i g i n
paper chromatogram
3) 堆積物中のクロロフィル初期分解物の高速 液体クロマトグラフィーによる解析：
chi 類は前述のように光合成に関与す る璽要 な 色素であり，植物やプランクトンの枯死により
Fig. 6に示 したように多種多様なchi. 分解物 に
変化すると共に堆積物中に取り込まれる 。 これら の初期分解物はそ れぞれ の 蛍 光 検 知H P L C法 (ZORl3AX O D S 4.6 m m X 25cm, アセトニ トリ ル：アセ トン＝45: 55v / v ) で迅速，簡便，高感 度に分析できる 鬼 H P L Cの定量化にはNarrow
baseline 法の導入によりさらに高精度の定量が できる 。一例をFig.9に示す。
Table. 3 Fluorescence properties of metal ls‑PPDE complexes
Fluoresctnc• %・ • ~I~• f. S . (I• .1● 0•9 9) T I n •"
悶
CompolX1d
Ex.pIenamk I IsI AEm. .Lnpcauk
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￨l伍̲̲l.L2 nd E m Q!llleak l 5)0‑000 Isl peak 5)0‑000 Isl ptak 99on I om 1 icmi de,．, 0 9 q ● 9 0 9,．,.CQanJ ̲b!; ぷI UQ/I I
P P D E 403 633 633 702 701 12.5 0.0 3
。
0 0 1 7 0.0 t. 6 0.0 2 6 16.7 25.8 19. 2 1..1 6 3し） G9 (11)595 59ム 652 648 10
Mg‑PPDE 417 57 0.0 8 8 0.0 J 8 0.11, 0.0 49 83.1 106.7 10.ム 9.1
(597) (8.1)
590 589 645 6 55 5.8 ？ 1.1
Zn‑PPDE ム18 (5 8 6) (5.2) 0.0 2 7 0.0 1, 0.0 2 8 0.0;1 ‑2 9.0 9.7 6.3
599 597 654 652 k
C:d‑PPDE 424 55 6.3 0.00 3 0.0 0 1 0.0 0 3 0.0 0 I 2.8 2.8 6,3 0.O3 5 586 586 641 640 5.6
Sn‑PPDE ム13 (5 0 0) 55 (5.2) 0.0 1 5 0.0 0 7 0.0 1 6 0 0 0 7 3.5 3.8 5,6 1. L
) 1 In Chloroform FSI: Fluorescenc, senslllvlly hdex D入）111,calculaled from Isl puk
•:Ex..
知：Non‑degassed fluorrscrnct quantum yield, ~1. Otgassed lluortsctnct quantum yield
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‑O
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Retention time (min) 20 30Separation of chlorophyl I derivatives
10 40
Fig. 9
弓
I
用 文 献in core sample.
l) 尾上義明平木敬三，西川泰治 ：分析化学， 31, 169 (1982).
2 ) Y.Onoue, K.Morishige, K .Hiraki, Y.Nishikawa: B U N S E K I K A G A K U : 32, E115 (1983).
3) 尾上義明平木敬三，西川泰治：分析化学，
31, 169 (1982).
4 ) 尾上義明：博士学位論文（近畿大学）
P38 (1982) .
芳本良彰：備士学位論文（近畿大学）
P118 (1985).
5 ) 田村隆之，瀧澤伸幸，森重清利，西川泰治 ： 日化第52春季年会議演予稿集I, P550 (1986) 6 ) 芳竹良彰，垣内喜久子，合田四郎，森重清利，
重松恒信，西川泰治：日化， 1987, No.4, P678.
86 (50) 海洋化学研究 2, 2 (1987)
