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化学と生物 Vol. 53, No. 3, 2015
細胞の大きさを規程する分子基盤
脊椎動物特異的細胞サイズ調節因子 Largen の同定
われわれの身体はさまざまに分化した細胞から成り 立っている．その大きさは，長く突起を伸ばした神経細 胞から微小なリンパ球まで多岐にわたる．しかしながら 分化した細胞集団それぞれについて調べると，多くの場 合，細胞の大きさはその集団固有の一定の分布を示すこ とがわかる．一方で，免疫系で働くB細胞は分化の過程 で一時的に大きくなりまた元に戻ることが知られてい る．さらに一般的に，組織が傷害を受けると周囲の細胞 が損傷を治癒するために増殖を始めるが，この際にも細 胞は一時的に大きくなる．これらの事実は，「細胞は自 身の大きさを恒常的に保ち，必要に応じて別の定常状態 に遷移することが可能な調節機構をもつ」ということを 示す．ではその制御の実体は何か？ それは遺伝子レベ ルで記述できるのだろうか？
細胞サイズの変異体の分離は1970年代に酵母で始ま り，近年ではRNA干渉を使った体系的なスクリーニン グがショウジョウバエでも行われ，細胞サイズの調節に お け るmTOR経 路 の 重 要 性 が 明 ら か に な っ た(1, 2)． mTORは細胞の増殖や代謝調節において中心的な役割 を果たすセリン／スレオニンキナーゼで，増殖関連シグ ナルはおしなべてこのキナーゼに集約され，mTOR複 合体1もしくは複合体2を介して下流に伝達される(3, 4)． 興味深いことに，mTORの活性を特異的に阻害する抗 生物質ラパマイシン（RAP）を作用させると，多くの 細胞が小さくなることが知られている(5)．われわれはこ の現象を利用して，RAPによる細胞サイズ縮小作用に 拮抗する遺伝子を探り出す方法を開発した(6)．
まず，enhanced retroviral mutagen （ERM）法でJur- kat細胞の変異体プールを作る．ERM法とは，テトラサ イクリン感受性転写活性化因子によって制御されるプロ モーターの下流にHAタグとスプライス供与配列（以上 合わせてERMタグとする）を挿入したレトロウイルス ベクターを感染させることにより，標的細胞の遺伝子を ランダムに活性化するシステムである(7)．これにより，
ウイルスが挿入されたゲノム部位近傍の遺伝子が常時活 性化され，テトラサイクリン［あるいはその安定誘導体 ドキシサイクリン（DOX）］でその発現がオフになる変 異細胞が作出される．もしRAPによる細胞サイズ縮小
作用に拮抗する遺伝子があるとすれば，それをERM法 により過剰発現している細胞はRAPで処理しても小さ くならずほかの細胞と区別できるはずであり，フローサ イトメトリー上で単純に「大きい細胞」をソートするこ とで濃縮されると考えられる．ソートを繰り返して目的 とする変異細胞を十分に濃縮したのち限定希釈法で細胞 をクローン化し，各細胞クローンのRAPに対するサイ ズ応答性がDOXの有無で変化するかを検討して擬陽性 を排除する．この原理に従い，ERMで動かされている 遺伝子の作用によってのみRAPによる細胞サイズ縮小 作用に拮抗する表現型を示す変異細胞を200個以上単離 した．その後，ERMタグを指標にして増幅したRT- PCR産物の塩基配列をゲノム情報と照会することで各 クローンにおける原因遺伝子を同定し，細胞サイズに影 響すると考えられる数十個の遺伝子を明らかにした(6)．
その中のある機能未知遺伝子のcDNAを発現ベク ターに挿入してJurkat, 293T, HeLa細胞に過剰発現させ たところ，実際にそれらの細胞が大きくなり，RAPで 処理してもコントロールの親株細胞より大きいままであ ることがわかった．反対に，その遺伝子の内在性発現を siRNAによって阻害すると細胞が小さくなり一部で細 胞死が誘導された．以上の観察結果から，データバンク 上でProline-rich protein 16 （ ）として分類されて いたこの遺伝子産物を「Largen」と名づけ，さらに解 析を進めた．Largen過剰発現細胞内には正常な細胞と 比較してより多くのタンパク質が蓄えられていたことか ら，標識アミノ酸の取り込みやレポーターアッセイ系を 用いた実験を行い，Largenの過剰発現でmRNAの翻訳 効率が上がることを確認した．次に，翻訳開始因子との 相互作用を想定して免疫沈降実験を行ったが，一部の開 始因子（eIF4A, 4B, 4E）が緩く会合するほかはLargen と結合している因子は見いだせなかった．同様に，
mTORやHippo経路(8) の各因子についても調べたが，
相互作用は検出できなかった．そこでリボゾームをショ 糖密度勾配遠心により分画し，ポリゾームに含まれる翻 訳途中のmRNAの種類をマイクロアレイで解析したと ころ，Largen過剰発現細胞では特にヒストンやミトコ ンドリアタンパク質などの翻訳が著しく促進されている
今日の話題
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ことが明らかになった．
この結果に基づき，Mitotracker染色やミトコンドリ アゲノムの定量によって細胞内のミトコンドリア量を調 べたところ，実際にLargen過剰発現細胞ではミトコン ドリアが増えていることが判明した．これに対応して Largen過剰発現細胞では酸素消費率が上昇し，より多 くのATPが生産されていることが確認された．そこで，
細胞サイズとミトコンドリアの活性の相関を見るために 正常細胞をミトコンドリア呼吸鎖の阻害剤であるFCCP で処理したところ，細胞の縮小が見られた．Largen過 剰発現細胞でもFCCPによる細胞サイズの縮小は起こる が，その度合いは正常細胞よりも小さい．この差は，
Largen過剰発現細胞におけるミトコンドリアの活性化 によるものと考えられる．
Largenの過剰発現で誘導されるこれらの現象が でも再現されるかどうかを調べるために，Largen のトランスジェニックマウスを作製した．まず，Lar- genを全身で過剰発現するマウスは胎生致死となった．
このことはLargenの発現量は発生過程において厳密に 制御される必要があることを示唆する．これに対し，肝 臓または筋特異的にLargenを過剰発現するトランス ジェニックマウスは正常なメンデル比で生まれ，その成 体において心筋や肝臓の細胞が大きくなることが確認さ れた．したがって，Largenは生体内においても細胞の 大きさを制御していることが証明された．
以上の結果から，細胞がその大きさを制御する仕組み として，ミトコンドリアを介したタンパク質合成の寄与 という側面が明らかになった．その重要な調節因子とし てLargenが同定されたが，その分子機作についてはま だ不明である．しかしながらLargenは，ミトコンドリ ア機能の制御という点から細胞の代謝調節に関与してい ると考えられ，今後その機能が解明されれば，代謝異常
によって引き起こされるがんやメタボリックシンドロー ムなどの理解を深めるとともに，これら複合的な疾患に 対する新規な創薬へとつながることが期待される．
1) P. Jorgensen & M. Tyers: , 14, R1014 (2004).
2) M. Cook & M. Tyers: , 18, 341 (2007).
3) M. Laplante & D. M. Sabatini: , 149, 274 (2012).
4) M. Shimobayashi & M. N. Hall: ,
15, 155 (2014).
5) D. C. Fingar, S. Salama, C. Tsou, E. Harlow & J. Blenis:
, 16, 1472 (2002).
6) K. Yamamoto, V. Gandin, M. Sasaki, S. McCracken, W.
Li, J. L. Silvester, A. J. Elia, F. Wang, Y. Wakutani, R. Al- exandrova : , 53, 904 (2014).
7) D. Liu & Z. Songyang: , 446, 409 (2008).
8) K. Tumaneng, R. C. Russell & K.-L. Guan: , 22, R368 (2012).
（山本一男，長崎大学医学部共同利用研究センター細胞 機能解析支援部門）
プロフィル
山本 一男（Kazuo YAMAMOTO）
＜略歴＞1992年大阪大学大学院理学研究 科単位取得退学（1994年理学博士）／同年 埼玉医科大学医学部第二生化学教室助手／
1997年長崎大学医学部腫瘍医学教室講 師／2000年同大学大学院医学系研究科新 興感染症病態制御学系講師／2002年同大 学大学院医歯薬学総合研究科感染分子病態 学 講 座 講 師／2003年 同 助 教 授／2007年 キャンベルファミリー癌研究所上席研究 員／2012年長崎大学医学部共同利用研究 センター准教授，現在に至る＜研究テーマ と抱負＞細胞の大きさを規定する分子基盤 の解明から，組織・個体サイズとのかかわ りまでさまざまな生命現象を「大きさ」と いう観点から俯瞰してみたい＜趣味＞ジャ ズ演奏・鑑賞
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