【解説】

微生物による有用物質生産を実現するには，代謝を効率よく 改良する必要がある．宿主の選定，異なる生物からの遺伝子 獲得および導入，不要な遺伝子や代謝経路の削除による生産 収率や生産性の変化などについて，予測するための計算機プ ラットフォームがあれば有意義であろう．また，デザイン指 針に基づいて構築した細胞が望みどおりのパフォーマンスを 示すかどうか，代謝の流れが達成さているかを実験的に評価 することも重要である．¹³C同位体を標識した化合物を炭素 源として細胞内に取り込ませ，¹³C標識の代謝物質中の濃縮 度を観測することで，どの代謝反応が実際に活性化している かを決定することが可能である．本稿では，このような代謝 デザインと¹³C代謝フラックス解析法の解説とその物質生産 への応用について述べる．

はじめに

微生物発酵で生産可能な物質の範囲を拡大し，収率や 生産速度を向上させていく重要性は論を俟たない．今ま で，どちらかというと優れた機能をもつ微生物を天然よ

り見いだし，理解し，応用することで多大な成果が積み 重ねられてきた．代謝工学分野では，細胞内の代謝を多 段階反応プロセスとして捉え，大腸菌や出芽酵母など知 識やノウハウが集積された工業有用微生物を合理的に改 良する方法論の開発とその応用を目指してきた．細胞内 の代謝の流れ（代謝フラックス：Metabolic flux）を統 一的に計算機で扱えるよう情報を整理し，目的物質を高 収率で生産可能な代謝経路をデザインできないか？ あ るいは，実際に細胞内で起こっている代謝フラックスを 精度よく捉えられないか？ というような問題設定を行 い，多くの成果が生まれている．今後，発見的手法と工 学研究の統合により，有用微生物の創製が，大きく発展 していくと考えられる．本稿では，われわれがこれまで フラックスレベルでの代謝の理解に向けて取り組んでき た代謝シミュレーション法および¹³C代謝フラックス解 析法の原理を概説し，代謝改変への応用例や，得られた 知見について紹介する．

代謝フラックス

代謝物質が細胞内で変換される速度をモル基準で，時

【解説】

 Metabolic Pathway Design and ¹³C-Based Metabolic  Flux Analysis for Bio-Production

Hiroshi SHIMIZU, Fumio MATSUDA, Yoshihiro TOYA, 大阪大 学大学院情報科学研究科

代謝デザインと ¹³ C同位体標識を用いた 代謝フラックス解析の物質生産への応用

清水 浩，松田史生，戸谷吉博

間当たり細胞当たりに表現したものを代謝フラックス

（mol/h/cell）という．栄養源からどれだけ高収率，高 速度で標的の物質を生産するかを議論するために，代謝 フラックスという量を用いれば便利である．代謝経路 は，複雑に入り組んでおり，同じ物質に到達するにも異 なる経路が存在したり，逆反応が存在し，生成したもの が反応物に戻されたりする．また，目的物質を生成する ために必要なエネルギー物質（ATP）や還元力（NADH,  NADPH）は生成や消費がうまくバランスされていない と定常的な細胞の生産能力につながらず，注意する必要 がある．これらのことを統一的，かつ，効果的に検討で きる計算プラットフォームの開発が望まれている．

化学量論による代謝の理解

化学量論とは，代謝マップに集約された反応式（たと えば，ヘキソキナーゼ：グルコース＋ATP→グルコース-6-  リン酸＋ADP）で反応物と生成物の量的な関係である．

生成したグルコース-6-リン酸は次の反応により直ちに フルクトース-6-リン酸に変換される．多段ステップの 反応からなる解糖系において，連続的に反応が起こるこ とを考えるとグルコースは2分子のピルビン酸に変換さ れ，次式のように2分子のATPとNADHを生成する． 

→

2ADP 2NAD 2 2ATP 2NADH グルコース＋ ＋ ＋

ピルビン酸＋ ＋

酵母はATPを増殖のエネルギー源として利用しつつ，

ピルビン酸を脱炭酸し，さらにNADHを用いてエタ ノールへと還元してから，菌体外へ排出している． 

→ 2

NADH NAD^＋

ピルビン酸＋ エタノール＋CO ＋

2つを合わせると，酵母における嫌気発酵を表す化学 量論式となる． 



₂

2ADP 2 ATP

グルコース＋ エタノール＋2CO ＋2

このように，酵母のエタノール発酵は基質レベルで も，酸化還元バランスのレベルでも全体として収支が合 い，かつ菌体維持のためのエネルギーも確保できるたい へん都合がよい状態である．グルコース消費フラックス の2倍のエタノールとCO2の排出フラックスをもってい ることがわかる．

ゲノムスケール代謝モデルと代謝デザイン

Flux Balance Analysis （FBA）は，上に述べたように，

化学量論だけに着目し，代謝全般にわたって解析する方 法である⁽¹⁾

．代謝モデルには酸素や栄養源の取り込みフ

ラックスや発酵産物の培地への排出フラックスも扱うこ とができるので，炭素源や窒素源の違い，通気条件，代 謝反応の有無が，目的化合物の生産収率に及ぼす影響を 解析できる．一方で，代謝の動的な解析や代謝物質濃度 と反応速度の関係などは扱えない．たとえば，フィード バック制御の影響，発酵の時間的変化などは予測できな い．このような制約はあるが，FBAができることを最 大限に生かすことで，さまざまな応用が行われている．

代謝反応を化学量論式で記述することで代謝フラック ス間の関係を線形代数方程式で記述することができる．

上の例では解糖経路とエタノール生成経路のみを考えた が，細胞内に存在する代謝反応を全般的に集めてくれ ば，ゲノムワイドな代謝モデルとなる．図

1

_{に代謝モデ} ルの構築についてイメージを示す．

このモデルでは，フラックスを決定するには情報が足 りないことが問題となるが，「細胞は，与えられた環境 下で細胞増殖を最大とするように代謝フラックスを調整 する」という大胆な仮定をおくことによって線形最適化 問題となって代謝フラックスを決定することができる．

ゲノムスケール代謝再構築とフラックス予測 われわれは，この方法の予測の有効性を検証するため に，コリネ型細菌のゲノムスケール代謝モデルを構築す るとともにグルコースの取り込みフラックスに対して酸 素の供給をさまざまに変化させた実験を行って，計算機 で予測された乳酸，酢酸，コハク酸などの有機酸の生成 フラックスが各実験データをよく説明することを見いだ した⁽²⁾

．すなわち，与えられた環境状態に対して細胞の

図1■ゲノム情報からの代謝モデルの構築の概要

代謝フラックスがどのようになるかを計算予測すること が可能となったと言える．図

2

に計算により求められた 炭素中心代謝の代謝フラックスを示す．グルコースを炭 素源とした場合，酸素供給が十分な場合は解糖経路や TCAサイクルが活性化され，細胞は盛んに増殖する．

これに比較して酸素供給がグルコース消費に対して小さ くなると，生成したNADHをNAD^＋に戻すための酸化 的リン酸化反応において酸素消費が十分でないため，有 機酸生成経路を使って細胞はNADH/NAD^＋バランスを 保とうとする．シミュレーションではこのようなことが 表現され，実験データを説明可能であることがわかる．

この方法を用いることにより，目的物質を最大生産する ための遺伝子削除について，計算機上でデザインするこ とが可能となる．ゲノムスケールの代謝モデルはゲノム が明らかになった生物数の上昇とともに多くなってお り，多くの生物のゲノムスケールの代謝モデルの利用が 可能である⁽³⁾

．

遺伝子削除については，計算機プラットフォーム上で は，その遺伝子が関与する代謝のフラックスを強制的に ゼロにすることで設定が可能である．このような制約を 設定したうえで同じように計算を行うことにより遺伝子 削除がもたらす代謝状態を知ることができる．すべての 遺伝子を対象に削除を行うこと，多重に遺伝子の削除を 行うことなど，実験では多くの労力や時間がかかる多く のケースについて計算することが可能となる．また，代 謝データベースを探索して宿主には本来ない遺伝子を獲 得・導入することも，反応を計算機プラットフォーム上 に加えることで容易に実現され，細胞が元来作れない物 質の生産可能性を考えてみることも可能である．

3ヒドロキシプロピオン酸（3HP）の生産性向上の 代謝デザイン

この方法を利用して，大腸菌による3ヒドロキシプロ ピオン酸（3HP）の生産性向上のデザインを試みた例に ついて述べる．  MG1655 （DE3）株を宿

主とし， の と の導入

と，大腸菌の を過剰発現することで，グリセロー ルを基質とした大腸菌3HP生産株を構築した．M9合成 培地にて培養を行った結果，3HP生産収率は5％となっ た．次に，大腸菌の代謝モデルに対し，FBAを用いた 遺伝子破壊シミュレーションを行い，生産収率の向上が 期待できる遺伝子破壊を探索した．図

3

_{に示すように探} 索結果に基づいて と の二重遺伝子破壊を行った 結果，収率は20％に増加した．さらに，主な副生産物 である1,3-プロパンジオールの生合成にかかわる を破壊すると収率を34％に向上させることに成功し た⁽⁴⁾

．このように，

プラットフォーム上の遺伝 子破壊シミュレーションによる標的化合物の生産性の向 上が実際の遺伝子破壊によって有効であることが確認さ れた．

この方法は，さらに，10を超える多重遺伝子削除の 高速探索法（FastPros）の開発⁽⁵⁾やさまざまな異種生物 の生合成経路を探索，獲得し，本来，宿主が生産し得な い物質の生産を新規にデザインする方法（ArtPathDe- sign）⁽⁶⁾の開発へと発展し，その応用範囲を拡大している．

13C代謝フラックス解析

次に，実際に遺伝子改変された細胞の代謝状態がどの ようになったかを評価する方法について述べる．代謝反

NADP NADPH

Cit/ IsoCIT

SUC MAL/ FUM

OXA

AcCoA G6P

PEP GLC

Pyr LAC

ACE GAP

NADNADH NADH NAD NADHNAD

NAD

Re_Mq Ox_Mq

NAD NADH

R5P

αKG NADP

ATPADP

Extra Cellular

Extra Cellular NADPH

NADH Cit/ IsoCIT

SUC MAL/ FUM

OXA

AcCoA G6P

PEP GLC

Pyr LAC

ACE GAP

NADNADH NADH NAD NADHNAD

NAD

Re_Mq Ox_Mq

NAD NADH

R5P

αKG NADP

NADP

ATPADP

NADPH

Extra Cellular

Extra Cellular NADPH

NADH

酸素供給が高い場合 酸素供給が低い場合

図2^■コリネ型細菌における異なる酸 素条件下の代謝フラックスのシミュ レーション

太い矢印は大きいフラックスをもつ代謝 反応であることを示している．

応は複雑であり，可逆反応が存在したり，同じ代謝物質 に到達するにもいろいろな経路が存在したりする．たと えば，グルコースが解糖経路を通ってグリセルアルデヒ ド-3-リン酸（GAP）になったのか，ペントースリン酸 経路を経由して同じ物質に到達したのかは細胞が細胞の 外から消費したり，外へ排出したりする代謝物質の増減 や変化を観察しているだけではわからない．しかし，1 位に安定同位体¹³Cで標識されたグルコース（［1-¹³C］

グルコース）を細胞に取り込ませ，その¹³C標識がどの ような代謝物にどの程度濃縮されているかを測定するこ とで，どの経路が活性化されているかを知ることができ る．

図

4

に原理を示す．ゲノムスケール代謝モデルの項で 示したようにグルコース-6-リン酸（G6P）

，グリセルア

ルデヒド-3-リン酸（GAP）分子を考え，G6P分岐で解 糖経路への代謝フラックスとペントースリン酸経路への フラックスの比が求まるかを考えてみる．取り込まれた グルコースの1位にある炭素原子は，ペントースリン酸 経路を通って代謝された場合は6炭糖から5炭糖に変換 される際に，CO2として分子の炭素骨格から離脱するこ とがわかっている．したがって，［1-¹³C］グルコースを 細胞に取り込ませながら培養した後，GAPに含まれる

13C標識割合を観測すれば，その値から解糖系とペン トースリン酸系に流れたフラックス割合を決定すること ができる．定量性の良さからタンパク質中に取り込まれ たアミノ酸の¹³C標識割合を測定することで代謝フラッ クスを決定することが多く行われてきた．最近では，さ まざまな代謝物質の¹³C標識割合に基づいて代謝フラッ クスの分布を決定することが可能になってきている．

この方法の概要を示したものが図

5

_である．¹³_C標識 された化合物を取り込ませて培養を行い，濃縮度が定常 に落ち着いたところで，細胞から代謝物質を抽出し，そ の¹³C標識濃縮度をガスクロマトグラフ質量分析計（GC- MS）

，キャピラリー電気泳動質量分析計（CE-MS） ，液

体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）など，分離装 置と質量分析装置を用いて定量する．得られた¹³C標識 割合のデータを最もよく説明する代謝フラックス量をコ ンピュータで決定する⁽⁷⁾

．

この方法を中心炭素代謝全体で行うためには，各反応 における反応物と生成物の原子の移動を表すモデルが必 要である．代謝物質の質量分析においては，¹³C同位体 を含む分子の標識割合が測定できる．代謝フラックスの 決定においては，代謝フラックスを仮定し，そこから得 られる各代謝分子の濃縮度を計算して実測値と比較して 仮定が正しかったかを検証する．実測と計算がずれてい る場合は代謝フラックスを仮定し直し，ずれが十分小さ くなるまで計算を繰り返す．このようにして観測値と計 算値の残差が小さく質量分析データをよく説明するフ ラックス分布を決定することが可能となる．このような 実験データを説明する代謝モデルの手動での構築や代謝 フラックスの決定は，繰り返し計算も含めていろいろな 図3■大腸菌による3HP生産性向上のた めの遺伝子削除デザイン

ペントース リン酸経路 フラックス 解糖経路

フラックス [1-¹³C ]Glucose

GAP

13CO₂

グルコース消費 G6P

G6P

分岐におけるフラックス比

は

GAP

の¹³

C

濃縮割合に等しい

標識の無い分子が 到達する 標識が入った 分子が到達す る

図4^■解糖経路とペントースリン酸経路の代謝フラックス量比 の実験的決定の原理

作業が必要となる．われわれは，¹³C代謝フラックス解 析のためのオープンソフトウェアOpenMebiusを開発し た⁽⁸⁾

．このOpenMebiusの主な機能を示すと以下のよう

になる．

1）代謝反応における分子間の原子移動などの情報から の解析用モデルの自動構築

2）シミュレーションによる代謝フラックスからの質量 分析データを計算する仮想実験

3）精度の高いフラックス解析結果を得るための実験の デザイン（¹³C標識化合物の取り込ませ方など）

4）実験データを用いた代謝フラックス解析

5）得られた代謝フラックスの統計的な信頼区間の推定 6）¹³C濃縮度の時間変化（動的）データを用いた代謝フ

ラックス解析

大腸菌，枯草菌，コリネ型細菌，出芽酵母，シアノバク テリアなどの微生物に利用可能であることを確認してい る．最近では，医学分野の研究者にも注目され，がん細 胞の代謝フラックス解析の研究も行われるようになって きており，さまざまな細胞への応用展開が今後，期待さ れる．

定量メタボロームや定量プロテオミクスと代謝フ ラックス解析の統合

上述のように細胞内の代謝フラックスを定量的に得る 技術が開発されてきた一方，代謝物質濃度やタンパク質 濃度の定量が行えれば，従来は，試験管の中で酵素反応 として見ていた現象を細胞内の情報に基づいて解析でき るようになることが期待される．最近，液体クロマトグ

ラフィー・タンデム質量分析計（LC-MS/MS）を用い たメタボローム分析手法が発展し，代謝物質の定量的分 析の精度が向上している．LC-MSでは，異なる溶離時 間の分析機器内におけるイオン化状態が異なるイオンサ プレッション効果があり，絶対定量が難しいとされてき た．最近，非標識，または，すべての炭素を標識したユ ニフォーム標識炭素源（［U-¹³C］炭素源）を含む培地で 細胞を培養し，LC-MS/MSの多種の代謝物を同時測定 可能なMultiple reactions monitoring （MRM）モードで 各代謝物質の非標識体と［U-¹³C］標識体を別個に測定 し，そのピーク面積比から代謝物濃度を求めることに よって中心代謝物の絶対定量法を構築する試みが行われ ている．この方法では，絶対定量に必要な内部標準物質 として，［U-¹³C］標識炭素源で培養した細胞から抽出し た同位体標識化合物を利用することで，各代謝物質の絶 対濃度定量が可能となる⁽⁹⁾

．

また，ナノLC-MS分析を用いることにより，また，

上記と同様に，非標識，または，［U-¹³C］炭素源を含む 培地で細胞を培養し，中心代謝のタンパク質のトリプシ ン消化物の非標識体と［U-¹³C］標識体を別個に測定し，

そのピーク面積比を求めることで定量プロテオーム解析 を行うことができる．われわれは，出芽酵母の中心代謝 の野生株と一遺伝子破壊株において定量プロテオーム解 析を行い，酵素の発現変動と代謝状態，増殖活性などを 定量的に解析しようと試みている⁽¹⁰⁾（図

6

_）

_．

図5■13C代謝フラックス解析方法の概要

代謝フラックス解析の応用例

最後に¹³C代謝フラックス解析の一例を示す．シアノ バクテリアは，CO2と光エネルギーから有用物質生産を 行うことができ，将来の物質生産に有望な微生物であ る．昼夜のサイクルにおいて，光独立的にCO2を固定 し，夜間は貯蔵したグリコーゲンなどを使って活動する ため，異なる栄養条件における代謝状態を詳細に解析す ることは物質生産にとって非常に重要な情報基盤とな る．われわれは，  sp. PCC6803の異なる栄 養条件における精密な代謝フラックス解析を決定するこ とを目標に研究を行った．図

7

_{に，混合栄養条件（左} 図）と従属条件（右図）下における代謝フラックスの解 析結果を示す．従属栄養条件は，光化学系IIに競合的に 結合することで光合成電子伝達を阻害するアトラジンを 添加することで人為的に作成した．図7左図のように混 合栄養条件では，炭素源としてCO2のみならず，グル コースを資化するので，¹³C標識グルコースを用いて代

図6^■酵母中心代謝の定量プロテオーム 解析の例

 S288C 株，

破壊株（Δ ）， 破壊株（Δ ）， 破壊株（Δ ）株の解糖経路，ペントー スリン酸経路，グリセロール合成経路，エ タノール合成経路，TCAサイクル，グリオ キシル酸経路，補充経路のタンパク質量の 比較⁽¹⁰⁾．

図7^■  sp. PCC6803における混合栄養条件（左）

と従属栄養条件（右）における代謝フラックス解析の結果 数字はフラックスの大きさを示す．

謝解析を行っている．RuBisCO反応が中心代謝系で最 も大きなフラックスをもっており，ペントースリン酸経 路が還元的な方向に流れをもってカルビンサイクルとし て機能していることがわかる．一方，図7右図のように 従属栄養条件では，光合成を阻害されているので主にグ ルコースを炭素源として利用しているが，この条件で は，酸化的ペントースリン酸経路が顕著に活性化してお り，混合条件下では光合成で得られていたNADPH生成 がこの経路によって補われることがわかった⁽¹¹⁾

．この

ように細胞の代謝フラックスをさまざまな条件で解析す ることが可能となってきており，今後，代謝物質濃度，

タンパク質濃度，代謝フラックスの詳細なデータをセッ トで得られることとなり，よりシステム的な解析を可能 とする土台が整いつつあると考えている．

文献

  1)  B.  Ø.  Palsson:  Systems  Biology:  Properties  of  Recon- structed Networks,  Cambridge University Press, 2006.

  2)  Y.  Shinfuku,  N.  Sorpitiporn,  M.  Sono,  C.  Furusawa,  T. 

Hira sawa & H. Shimizu:  , 8, 43 (2009).

  3)  A.  M.  Feist  &  B.  Ø.  Palsson:  , 26,  659  (2008).

  4)  K.  Tokuyama,  S.  Ohno,  K.  Yoshikawa,  T.  Hirasawa,  S. 

Tanaka, C. Furusawa & H. Shimizu:  ,  13, 64 (2014).

  5)  S. Ohno, H. Shimizu & C. Furusawa:  , 30,  981 (2014).

  6)  S. Chatsurachai, C. Furusawa & H. Shimizu: 

, 13, 93 (2012).

  7)  Y. Toya & H. Shimizu:  , 31, 818 (2013).

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, 2014, 627014 (2014).

  9)  S.  Nishino,  N.  Okahashi,  F.  Matsuda  &  H.  Shimizu: 

, in press (2015).

10)  F. Matsuda, T. Ogura, A. Tomita, I. Hirano & H. Shimizu: 

, 119, 117 (2015).

11)  T.  Nakajima,  S. Kajihata, K.  Yoshikawa,  F. Matsuda,  C. 

Furusawa, T. Hirasawa & H. Shimizu: 

, 55, 1605 (2014).

プロフィル

清 水  浩（Hiroshi SHIMIZU）

＜略歴＞1990年京都大学大学院工学研究 科博士後期課程化学工学専攻修了／同年大 阪大学工学部醗酵工学科助手／1995年同 大学大学院工学研究科応用生物工学専攻助 教授／1996〜1997年MIT化学工学専攻客員 研究員（Gregory Stephanopoulos教授）／

2003年大阪大学大学院情報科学研究科バイ オ情報工学専攻教授＜研究テーマと抱負＞

代謝工学・生命システム解析・生物化学工 学・バイオインフォマティクス，代謝工学 による物質生産を進めたいと思っている

＜趣味＞読書・スポーツ観戦・散歩＜所属 研究室ホームページ＞http://www-shimizu.

ist.osaka-u.ac.jp/hp/

松田 史生（Fumio MATSUDA）

＜略歴＞1997年京都大学農学部農芸化学 科卒業／1999年同大学大学院農学研究科 修士課程修了／2002年同大学大学院農学 研究科博士課程修了，CREST研究員，理 化学研究所植物科学研究センター研究員を 経て，2009年神戸大学大学院自然科学系 先端融合研究環准教授／2012年大阪大学 大学院情報科学研究科准教授，理化学研究 所環境資源科学研究センター客員研究員兼 務＜研究テーマと抱負＞植物，微生物のメ タボロミクスと代謝工学への応用，酵母を 用いた有用物質生産

戸谷 吉博（Yoshihiro TOYA）

＜略歴＞2010年慶應義塾大学大学院政策・

メディア研究科博士後期課程修了／同年同 大学大学院政策・メディア研究科特任助 教／2011年大阪大学大学院情報科学研究 科特任助教を経て，2015年同助教＜研究 テーマと抱負＞代謝工学・代謝フラックス 解析・代謝シミュレーション，増殖停止期 の微生物細胞を利用した有用物質生産＜趣 味＞読書

Copyright © 2015 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.53.455