テクノロジーイノベーション
はじめに
われわれの生活になじみのある微生物のほとんどは，
常温，中性付近，豊富な栄養条件の下で活発に増殖でき る．しかし，これらは地球に存在する微生物のごく一部 であって，通常の培養設備で増殖可能な微生物は土壌中 の全微生物の約1〜10％に過ぎないことがわかってき た．そして，火山付近などの高温環境，深海などの高圧 環境，北極や南極域などの低温環境にも，その環境に見 事に適応した極限環境微生物が多数生息していることが 明らかになった．これらの極限環境微生物は，従来の微 生物に見られない特性を有し，基礎・応用両面で興味深 い研究対象になっている．
極限環境微生物の中でも，90 C以上で生育できるの が超好熱菌である．超好熱菌は生物の進化系統樹の源流 に位置しており，現存する生物の中で原始生命体に最も 近いと考えられている．その生育条件は，水素，硫化水 素，硫黄，2価鉄イオンなどをエネルギー源とし，二酸 化炭素を唯一の炭素源として化学独立栄養増殖を行うも のが多く，火山活動の盛んな原始地球環境（高温，嫌気 的，無機的）に近いと思われる．
東洋紡は1882年に繊維事業を創業し，1952年に生化 学関連研究に着手して，1970年に診断薬原料酵素事業，
1972年に臨床検査薬事業を開始した．そして，この原 料酵素の開発で培った微生物培養，酵素精製の技術を用
い，遺伝子工学研究用試薬の開発に着手して，1982年 に制限酵素の販売を開始している．東洋紡の遺伝子工学 研究用試薬事業は後発であり，特徴ある製品の開発に取 り組むことにより，存在感を発揮する必要があった．一 方，当時，大阪大学大学院工学研究科今中研究室ではさ まざまな極限環境から多種多様な微生物を採取して，こ れら微生物を用いた基礎および応用研究を進めていた．
超好熱菌 KOD1株由来の新
規耐熱性DNAポリメラーゼ（KOD DNAポリメラー ゼ）は，今中研究室で進めていた応用研究の一つであ り，産学の共同研究により製品開発されたものである．
PCR酵素としての耐熱性DNAポリメラーゼの産業 利用
特定のDNA断片だけを増幅するPCR法は，遺伝子の 研究分野のみならず，感染症や遺伝子検査といった診断 分野など，広く産業利用されている．このPCR法の酵素 として用いられるのが耐熱性DNAポリメラーゼである．
DNAの複製や修復を行うDNAポリメラーゼは生物に とって必須な酵素であり，そのアミノ酸配列をもとに5つの ファミリー（A, B, C, X, Y）に分類されている．近年，アー キアでは真正細菌，真核生物ともに類似配列が見られない 新規DNAポリメラーゼの配列が見いだされ，新しくファミ リー D DNAポリメラーゼとの分類も提唱されている．
PCR法にはDNA合成の伸長能力が高いという点か
超好熱菌由来の新規DNAポリメラーゼの発見とその 産業利用
北林雅夫 *1，小松原秀介 *
2，今中忠行 *
3
*1東洋紡株式会社バイオケミカル事業部，*2東洋紡株式会社ライフサイエンス事業部，*3立命館大学生命科学部
ら，通常， DNAポリメラーゼおよび DNAポ リメラーゼといった高度好熱性細菌 ,
由来のファミリー A DNAポリ メラーゼが使用されてきた．これらDNAポリメラーゼ の利用によりPCR法の簡便化，自動化への道が開け，
幅広く応用可能な手法として発展した．しかし，これら の酵素は，合成の間違いを校正するための3′→5′エキソ ヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を保有して いないため，PCR中に誤った塩基を連結してしまった 場合は，そこで反応を停止するか，あるいは，それを乗 り越えてDNA合成反応が進み，最終的に誤ったDNA 配列が増幅される可能性があった（図1）．
一方，ファミリー B DNAポリメラーゼは，その酵素 分子内にポリメラーゼ領域とエキソヌクレアーゼ領域を 保持しており，間違った塩基を連結してしまった場合に は，これをエキソヌクレアーゼ領域で除去し，正しい塩
基に校正してDNA合成を継続することができる（図 1）．超好熱性アーキアに属する と 由来のファミリー B DNAポリ メラーゼ（ DNAポリメラーゼ， DNAポリメ ラーゼ）は，その3′→5′エキソヌクレアーゼ活性に基づ く高いPCR正確性（ DNAポリメラーゼの正確性は DNAポリメラーゼの32倍）を保持し，遺伝子のク ローニング用途などで使用されていた．
しかし，これらのファミリー B DNAポリメラーゼ は，DNA合成とDNA除去の2つの進行方向の反応を行 うために，ファミリー A DNAポリメラーゼと比べて DNA合成の伸長能力が低く（ DNAポリメラーゼの DNA合 成 速 度 は DNAポ リ メ ラ ー ゼ の 約1/2）， PCRの 増 幅 性 能 が 劣 る た め，PCR時 間 が 長 く な る，
PCRの成功率が低下するなどの問題点があった．
KOD DNAポリメラーゼの酵素特性
鹿児島県小宝島の硫気孔から分離した超好熱性アーキ ア KOD 1株は，65〜100 C で生育し，有機物をエネルギー源および炭素源として，
硫黄を電子受容体にした嫌気的従属栄養生育が確認され ている．その菌体の生理特性は，既報の ,
と極めて類似していた．しかし，このKOD1株 からクローニングした新規なファミリー B DNAポリメ ラーゼ（KOD DNAポリメラーゼ）は， DNAポリ メラーゼ， DNAポリメラーゼとアミノ酸レベルに おいて高い相同性（約80％）を有しているものの，そ の酵素特性は大きく異なっていた．
KOD DNAポ リ メ ラ ー ゼ のDNA合 成 速 度 は，
DNAポリメラーゼの約7倍， DNAポリメラーゼの 約2.5倍と，これまでに類のない高いものであった（表 1）．当時，ファミリー B DNAポリメラーゼはDNA合 成速度が低いことが定説であり，著しく異なる結果の確 証を得るため幾度もトレース実験を繰り返した．また，
別の角度からDNA合成の伸長能力を検討するため，各 図1■DNA合成モデル
表1■KOD DNAポリメラーゼの酵素特性比較
DNAポリメラーゼ KOD
起源 KOD1
分子量 90.0 kDa 93.9 kDa 90.1 kDa
3′→5′エキソヌクレアーゼ活性 ＋ ̶ ＋
熱安定性（半減期） 95℃, 12 h 95℃, 1.6 h 95℃, 6 h
DNA合成速度（塩基／秒） 100‒130 54 20
フ゜ロセッシビティー（塩基数／反応） ＞300 n.t. ＜20
変異導入率（PCR） 0.10％ 4.8％ 0.15％
種DNAポリメラーゼのプロセッシビティー（DNAポ リメラーゼが基質DNAに結合してから離れるまでに合 成できるヌクレオチドの数）を比較する実験も行った．
KOD DNAポリメラーゼは，プロセッシビティーにお いても著しく高い能力が見られ，高いDNA合成速度と 符合していた(1)．
また，KOD DNAポリメラーゼは，そのPCR産物が 表現型に変異を導入する頻度は， DNAポリメラー ゼのものと比べて約1.5倍， DNAポリメラーゼと 比べて約50倍低くなっており，PCRの正確性において も最高水準の性能が認められている（表1）．
KOD DNAポリメラーゼは，その特長を明らかにす るためにX線結晶構造解析が行われ，立体構造が明ら かにされている(2)．DNAポリメラーゼにはPalmとFin- gersと呼ばれる領域があり，基質となるdNTPの取り 込みに関与している．KOD DNAポリメラーゼのFin- gers領域にはリジン，アルギニンなどの塩基性アミノ 酸がPalm側に向かって数多く並んでおり，これが効率 的なdNTPの取り込みに関与していることが示唆されて いる（図2）．
KOD DNAポリメラーゼのPCRへの応用
KOD DNAポリメラーゼはDNA合成の伸長能力が高 く，かつPCRの正確性が高い，非常にユニークな酵素
であった．しかし，その高いDNA伸長能力や強力な 3′→5′エキソヌクレアーゼ活性のため，PCRに使用する には制御が難しく，使いづらいという欠点があった．
そこで，PCR成功率を向上するため，3′→5′エキソヌ クレアーゼ活性を抑制したKOD DNAポリメラーゼ変 異体を取得してPCRの成功率を向上している(3)．
さ ら に，わ れ わ れ は，KOD DNAポ リ メ ラ ー ゼ を PCRで使いやすい酵素とするため，以下に示すさまざ まな工夫を行った．
1. KOD DNAポリメラーゼの使用法検討
われわれがKOD DNAポリメラーゼ関連製品を開発 した当初は，先達酵素である DNAポリメラーゼ，
DNAポリメラーゼを参考に反応系を組んでいた．
当時，DNAポリメラーゼ製品は2.5 U/
μ
L以上の酵素濃 度で，50μ
LのPCR反応系に2.5 UのDNAポリメラーゼ を用いるのが一般的であった．これに倣い，KOD DNA ポリメラーゼ製品も2.5 U/μ
Lの酵素濃度で，50μ
Lの PCR反 応 系 に2.5 Uを 使 用 し て い た．し か し，KOD DNAポリメラーゼのPCRの成功率は芳しくなく，研究 者の満足いく性能ではなかった．KOD DNAポリメラーゼの高いDNA伸長能力から 50
μ
LのPCR反応系で2.5 U使用することは過剰と考え，酵素量を減らす検討を試行した．1.0 Uの酵素量を使用 したときに穏やかな反応制御が可能となりPCRの成功 率を格段に向上することができた．また，KOD DNA ポリメラーゼと2種類のモノクローナル抗体を結合した 酵素抗体混合液（酵素濃度1.0 U/
μ
L）を製品形態として 検討した．本製品形態にて長期保存中にKOD DNAポ リメラーゼの酵素性能が損なわれないことを確認するこ とができた．さらに，ファミリー BタイプのDNAポリメラーゼは dUTPを取り込んだ際に酵素反応を停止する特性をもつ ためか，基質となるdNTPsのメーカー差によりPCR成 功率を著しく低下させる現象が見られた．そこで，東洋 紡のPCR酵素製品群においてKOD DNAポリメラーゼの みdNTPsメーカーを選定した．当時，制限酵素Bufferと 同じくdNTPsをPCR酵素により使い分ける概念がな かったため，研究者の利便性を考えて専用dNTPsの設 定 に 反 対 す る 意 見 が 大 勢 で あ っ た．各 メ ー カ ー の dNTPsを用いたKOD DNAポリメラーゼのPCR性能の 比較結果を示して，東洋紡ではKOD DNAポリメラー ゼで反応阻害が起こらないdNTPsをPCR全製品群で標 準使用することにした．
図2■KOD DNAポリメラーゼの立体構造
2. ホットスタートPCR技術の採用
PCRの成功率は，Primerダイマーなどの非特異的な 増幅により低下する傾向が見られる．なかでもPCRの 最初の昇温の際に起こる非特異的な酵素反応はPCRの 成功率を著しく低下させる．われわれは，DNAポリメ ラーゼ領域と3′→5′エキソヌクレアーゼ領域をそれぞれ 認識する2種類のモノクローナル抗体をKOD DNAポリ メラーゼに結合させて，常温での酵素活性を完全に封じ 込んだ．そして，高温でこれら抗体が変性してPCRサ イクル時のみ正確な酵素反応を行えるように改良したと ころ，高い成功率で，目的とするDNA断片のみを潤沢 に得ることに成功した(4)（図3）．
このホットスタートPCRで用いる2種類の抗体は，そ の抗体の調製方法，あるいはKOD DNAポリメラーゼ との結合方法により，PCR性能に微妙な影響を及ぼす ことがある．そこで，同じパフォーマンスを発揮する製 品を安定して製造するため，製品製造においては標準作 業操作を遵守して，厳しいPCR性能試験を経たものだ けが製品として提供されている．
3. アクセサリータンパク質の利用
生体内ではDNAポリメラーゼが連続的に効率良く DNA合成を行うため，さまざまなタンパク質と共同し て働いている．当時，このようなDNAポリメラーゼに 協力して働くアクセサリータンパク質をPCRに利用す る動きも見られていた．
アクセサリータンパク質には，ポリメラーゼの阻害を 抑制するものや伸長能力を向上させるものなどさまざま
なものが存在する．ポリメラーゼの阻害を抑制するもの の一例としては，dUTPaseが挙げられる．ファミリー B DNAポリメラーゼは，その酵素特性としてdTTPの 代わりにdUTPを取り込んだ場合，その塩基でDNA合 成反応が停止する現象が見られる．PCR反応中には dCTPが熱分解して微量のdUTPが産生されるため，
dUTPの取り込みがPCRの成功率を悪化させる原因と なっていた．そこで，反応系に耐熱性dUTPaseを添加 してdUTPを除去することにより，DNAポリメラーゼ の反応停止を防ぎ，伸長能力が改善することが報告され ている(5)．
また，伸長能力を向上させるものの例として増殖細胞 核抗原（proliferating cell nuclear antigen; PCNA）が 挙げられる．真核生物ではPCNAがDNAポリメラーゼ をDNA鎖状にとどめておくクランプ分子として働いて おり，DNAポリメラーゼと結合して，ポリメラーゼの DNA鎖上のスムーズな移動を助けている．実際，われ われはKOD DNAポリメラーゼにこれらの因子を添加 することで，DNA伸長速度が増大することを見いだし ている(6)．
このようなPCRに利用されるアクセサリータンパク 質はほかにも数多く報告されており，DNAポリメラー ゼ単独でのPCRよりも効率の良いDNA増幅を可能とし ている．われわれも，DNA合成の反応効率を促進する アクセサリータンパク質である伸長エンハンサーを開発 し，その添加によりPCRの成功率を向上している．
図3■ホットスタートPCR技術の採用
4. PCR反応Buffer組成の最適化検討
KOD DNAポリメラーゼは，その高いDNA伸長能力 から，水素結合の多いGCリッチな鋳型DNA配列でも，
比較的よくDNA増幅することができる．しかし，その 高い伸長能力のため，誤って結合したPrimerからも遺 伝子を増幅してしまう非特異的な増幅がまれに見られ た．
このような非特異的な増幅を防ぐには，PCRの反応 組成が最も重要になる．一般的には，核酸と相互作用す る陽イオンの検討が行われ，Primerの結合状態を安定 化するイオンと不安定化するイオンのバランスや組み合 わせにより特異性を向上している．
そのほか，標的核酸とともにPCRに持ち込まれる阻 害物質がPCRの成功率に悪影響を及ぼすことが知られ ている．阻害物質はDNAポリメラーゼの失活や，核酸 に結合しポリメラーゼ伸長反応の阻害を引き起こす．
BSA，トレハロースなどの添加物は，阻害物質から核 酸やDNAポリメラーゼを保護し，PCRの阻害物質を吸 着してその影響を緩和することが報告されている(7, 8)．
KOD DNAポリメラーゼの反応液組成もさまざまな 化合物の組み合わせ検討を行い，特に陰イオンのシュウ
酸イオンがPCR酵素全般で特異性向上に効果があるこ とを見いだしている．また，われわれはグリコール類が 酵素を不安定化させることなく，特異的な増幅のみを促 進させることも見いだしている．KOD DNAポリメ ラーゼの高い安定性と伸長能力を活かす，これらPCR 反応Bufferの最適化により，今までは増幅が不可能で あった阻害物質を多く含むクルードなサンプルからも PCR増幅を可能とした．
われわれは先入観を払拭して，KOD DNAポリメ ラーゼの高性能PCR製品を創り上げるまでに10年以上 の歳月を要している．
KOD DNAポリメラーゼのPCR製品事例
1995年に「KOD DNAポリメラーゼ」をPCR用酵素 として開発以来，上記の技術開発を重ね，最近，「KOD DNAポリメラーゼ」をベースに，用途別に2種類の PCR用酵素を開発した．一つは，反応Buffer組成の見 直しによりKOD DNAポリメラーゼの高い正確性をさ ら に 向 上 し て，PCRの 成 功 率 を 上 げ た「KOD‒Plus‒
Neo」（正確性は DNAポリメラーゼの約80倍）で 図4■KOD FX NeoのPCR事例
ある．もう一つが，反応Buffer組成の改良と伸長エン ハンサーの添加により，KOD DNAポリメラーゼの伸 長能力を最大源に活かして，マウステールや植物葉など からDNAを精製することなく，直接PCRに持ち込むこ とを可能にした「KOD FX Neo」（正確性は DNA ポリメラーゼの約20倍）である．「KOD‒Plus‒Neo」は ヒトゲノムから24 kb，「KOD FX Neo」はヒトゲノム から40 kbの目的産物を増幅することができる（図4）．
さらに，2013年には，これまでのリアルタイムPCR用 酵素の常識を覆し，KOD FX Neoで培ったPCR技術を 用いて，難配列，ロングターゲット，クルードサンプル で高効率リアルタイムPCRを可能にした「KOD SYBRⓇ qPCR Mix」を開発している．また，KOD DNAポリメ ラーゼは研究用途のみならず，遺伝子診断でも優れてい る（東洋紡（株）全自動遺伝子解析装置GENECUBEⓇの 反応試薬として販売）．その優れた伸長速度を活かし，
素早く正確な判定が必要な診断の用途でも大いに活躍す ることが期待されている．
今後の展望
耐熱性DNAポリメラーゼを用いたPCR基本技術は，
その発表から四半世紀以上の歳月を経た．その用途は多 岐にわたり，DNAのクローニングやシーケンシングに始 まり，遺伝子組換え作物などの品質管理，SNP（Single nucleotide polymorphism）の遺伝子診断など，さまざ まな局面で利用されるようになった．
われわれがはじめに提供したKOD DNAポリメラーゼ 製品はPCR性能が芳しくなく，多くの研究者から叱咤激 励をいただいた．そのようなご助言が製品改良の糧とな り，信頼される製品を届けたいとの一心が，現在のKOD DNAポリメラーゼ関連製品群の開発につながっている．
私たちは最初の約10年間のKOD DNAポリメラーゼ 関連製品の開発に携わり，多くの可能性を感じながら同 僚諸氏に開発を委ねた．KOD DNAポリメラーゼ関連 製品は長きに渡り幾人もの優秀な開発者の手により，少 なからず研究者のお役に立てる製品に成長することがで きた．東洋紡では，「KOD DNAポリメラーゼがPCR酵 素の一つの理想形である」と信じて研究開発を継続して いる．
謝辞：本研究を行うにあたり，北陸先端科学技術大学院大学・高木昌宏 先生，関西学院大学理工学部・藤原伸介先生に，多くのご指導，ご支援 を賜りました．ここに深く感謝の意を表します．また，本研究開発に携 わった，東洋紡関係者の皆様に深謝申し上げます．
文献
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プロフィル
北林 雅夫（Masao KITABAYASHI）
＜略歴＞1993年広島大学大学院生物圏科 学研究科博士前期課程修了／同年東洋紡
（株）敦賀バイオ研究所入社／2004年広島 大学大学院生物圏科学研究科生物資源開発 学専攻博士後期課程卒業，農学博士／2015 年東洋紡（株）バイオケミカル事業部主幹，
現在に至る＜研究テーマと抱負＞酵素の産 業利用，多くの人に喜ばれる製品の開発
＜趣味＞スポーツ観戦
小松原 秀介（Hideyuki KOMATSUBARA）
＜略歴＞1987年東京農工大学工学部高分 子工学科卒業／同年東洋紡（株）敦賀バイオ 研究所入社／2012年同社ライフサイエン ス事業部マネジャー，現在に至る＜研究 テーマと抱負＞遺伝子検査＜趣味＞スポー ツ観戦
今中 忠行（Tadayuki IMANAKA）
＜略歴＞1969年大阪大学大学院工学研究 科醗酵工学専攻修士課程修了，工学博士／
1970年同大学工学部助手／1981年同助教 授／1989年同教授／1996年京都大学大学 院工学研究科教授／2008年立命館大学生 命科学部教授／2015年同大学上席研究員，
現在に至る＜研究テーマと抱負＞エネル ギー生産（超好熱菌による水素生産，炭酸 ガスと水からの化学的石油生成など）＜趣 味＞囲碁（五段），犬の散歩，クラシック 音楽鑑賞
Copyright © 2015 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.53.866
