地球温暖化による異常高温はヒトのみならずイネなど重要作 物の生産に大きな影響を及ぼしつつある．近年，わが国の夏 季は頻繁に各所で猛暑となり，高温被害米が多発し，一等米 比率を激減させている．このような高温被害米の多発は米生 産農家の収入に直接影響するだけでなく，産地のブランドイ メージを壊すことにもなりかねず，生産現場では極めて深刻 な問題となっている．高温登熟による玄米の白濁化はさまざ まな要因が複雑に絡み合って生ずるものと考えられるが，最 終的な現象としては胚乳細胞におけるデンプン顆粒の形成不 全である．本稿では，分子生理学的視点から玄米の白濁化メ カニズムを考察し，高温登熟耐性をもたらす因子ならびに高 温障害を軽減する戦略を探る．
高温登熟はデンプン合成と分解のバランス異常を引 き起こす
うるち玄米の整粒（完全粒）は豊満で左右・上下均整 の取れた形で，側面の縦溝が浅く全体が透明で表面に光 沢をもつ（図1右上）．整粒の胚乳細胞を走査電子顕微 鏡で観察するとデンプン顆粒は複粒構造を示し，デンプ ン顆粒間には空隙がほとんど見られない（図1右下）．
登熟期に高温ストレスを受けると白濁粒（図1左上）や 胴割れ粒といった不完全粒が多発することが知られてい
る(1〜3)．白濁粒のデンプン顆粒構造は丸みを帯びてい
て，顆粒表面には小孔が見られることもある（図1左 下）．一部にデンプン集積の不良な箇所をもつ玄米は，
デンプン顆粒間にできた隙間とその顆粒表面の小さな凹 みなどにより光が複雑に屈折そして乱反射することに よって，玄米のその部分が白く濁り不透明になる．玄米 の白濁部位，すなわち腹部（胚のある面），背部（胚の 反対側の面），基部（胚の隣接部），中心部の白濁化が見 られるものを，それぞれ腹白，背白，基白，心白粒など と呼んでいる．
高温登熟によるデンプン顆粒構造の形成異常はデンプ ン生合成酵素の機能低下によると考えるのはごく自然な 発想であり，そして実際に，高温登熟によるデンプン生 合成の変化が多くの研究グループによって捉えられてき
た(4〜7)．米粒デンプン鎖長分布の変化に関して，井ノ内
ら(4)は，登熟温度を25 Cから30 Cに上昇させることに よってアミロペクチンの単位鎖DP6, 11‒13が減少し，
DP8, 22‒24, 29が増加することを示した．さらに田中 ら(6)は，デンプン枝づけ酵素（BEIIb）遺伝子の発現量
高温登熟による米白濁化の 分子生理機構
三ツ井敏明
A Molecular Physiological Mechanism of Rice Grain Chalking by High Temperature Stress
Toshiaki MITSUI, 新潟大学自然科学系
日本農芸化学会
● 化学 と 生物
【解説】
が異なる一連のBEIIb遺伝子欠損変異体・形質転換体を 作成し，そのデンプン顆粒形成を調べ，デンプン顆粒形 成異常の主な原因はBEIIbの機能低下であることを報告 した．加えて，イネの枝づけ酵素活性の温度依存性が調 べられ，BEIIbの最適温度は25 Cであり，温度上昇に よる失活が最も著しいことが示された(7)．これらの結果 から，高温登熟による枝づけ酵素の活性低下がデンプン 顆粒構造の変化の原因であると結論された．
しかし，近年，デンプン顆粒の形成異常の発生にデン プン分解酵素がかかわっていることを示す報告がなされ た．浅妻ら(8)は，
α
-アミラーゼ遺伝子 （ ） および （ ）を強発現プロモーターを用い て発現させ，非高温ストレス下で栽培，収穫した玄米の 外観品質を調べたところ，白濁粒の多発が見られた．山 川ら(9)は，高温ストレスが米のデンプン粒形成に及ぼす 影響を遺伝子レベルで包括的に解明するためにトランス クリプトーム解析を行った．高温ストレス処理（33/28 C：昼／夜温）した登熟途中の胚乳と無処理（25/20 C）の ものについてmRNAの発現を比較したところ，デンプ ン代謝，種子貯蔵タンパク質の合成およびストレス応答 に関与する遺伝子において違いが見られた．デンプン生 合成にかかわる遺伝子については，高温登熟によってデ ンプン顆粒結合型のデンプン合成酵素 や枝づけ 酵素 のmRNA発現が半減していた．また，デン プン合成酵素の基質となるADP-グルコースを生成する ADP-グルコースピロホスホリラーゼ やADP-グル
コースをデンプン合成・蓄積の場となるアミロプラスト へ運び入れる輸送体 の発現も減少した．しかし 注目すべきことに，種々の
α
-アミラーゼ遺伝子（ ,, , , ）は逆に高温によっ て発現が上昇していた(10)．これらの結果は，玄米の白 濁化における
α
-アミラーゼの関与を強く示唆した．しか し石丸ら(11)は，登熟種子胚乳の中心部分ではα
-アミラー ゼmRNAを検出することはできなかったと報じ，玄米 中心部の白濁化とα
-アミラーゼとのかかわりを疑問視し た．一方で，食品化学的な観点から玄米のデンプン分解 酵素についての解析が行われている．特異抗体を用いた ウェスタンブロット実験で得られた結果から，玄米の精 米過程における90〜80％画分にAmyI-1とAmyII-4が見 いだされ，加えて80〜0％画分に抗AmyE（AmyII-3）抗体(12)によって認識される
α
-アミラーゼが検出された(13)． mRNA発現とタンパク質発現の間に若干食い違いが見 られるが，専らデンプンを合成，蓄積している胚乳組織 細胞においてα
-アミラーゼが発現していることは間違い ない．イネ
α
-アミラーゼの中で最も主要なアイソフォームで あるAmyI-1は -結合型糖鎖をもつ分泌性糖タンパク質 であり，その糖鎖構造や糖鎖結合部位そして結晶構造も 解かれている(14, 15)．分泌性酵素であるα
-アミラーゼが どのようにして胚乳細胞のデンプン分解，そして玄米白 濁化にかかわりうるのか疑問であった．そこで，生化 学・細胞生物学的手法を駆使してAmyI-1の細胞内局在 性が調べられ，分泌性糖タンパク質AmyI-1が葉緑体や アミロプラストに局在することがわかった(8)．さらに，のプラスチド局在化が小胞体‒ゴルジ体間 の小胞輸送にかかわるGタンパク質である および のドミナント変異体によって抑えられることか ら，AmyI-1は小胞体‒ゴルジ体系を経由してプラスチド に局在することが明らかになった(16)．
α
-アミラーゼは，胚乳細胞などの生細胞においてプラスチドに局在化し機 能することが示されたのである．プラスチドと分泌経路 である細胞内膜系との間のタンパク質輸送については依 然として不明な点が多い．しかし，糖タンパク質のプラ スチドへの局在化はイネヌクレオチドピロホスファター ゼ／ホスホジエステラーゼ（NPP）(17, 18)，Mnスーパー オキシドジスムターゼ1（MSD1）(19)ならびにシロイヌナ ズナのカーボニックアンヒドラーゼ(20, 21)でも確認され ており，その存在は植物細胞分子生物学の分野で受け入 れられつつある．
筒井ら(22)は，新潟県三条市で2009年度（登熟平均温 度：24.4 C）と2010年度（28.0 C）に収穫されたコシヒ 図1■高温登熟によって生じた白濁粒（左上）と整粒（右上）
白濁部位（左下）と整粒中央部位（右下）の走査電子顕微鏡画像．
倍率1,000倍．
日本農芸化学会
● 化学 と 生物
カリを用いて玄米白濁部位とそれと同じ整粒の部位のデ ンプン鎖長分布を蛍光標識／HPSEC分子ふるいクロマ トグラフィーを用いて調べた．高温登熟で生じた玄米白 濁部位のアミロース含量は整粒に比べて若干の減少が見 られたが，アミロペクチンの鎖長分布には顕著な違いを 見いだすことができなかった．この結果は，正常なデン プン分子構造を作り出しうる状態であってもデンプン顆 粒の形成異常が発生することを示している．加えて，遊 離グルコース量を定量したところ，整粒と比較して白濁 部 位 の 遊 離 グ ル コ ー ス の 顕 著 な 増 加 が 見 ら れ た．
iTRAQ標識を用いたショットガンプロテオミクス解 析(23)では，高温登熟で生じた白濁部位において約1,000 個のタンパク質が同定され，その数％のタンパク質が整 粒と比較して2倍以上の発現変動を示した．特に，低分 子熱ショックタンパク質や
α
-アミラーゼの顕著な増加が 観察された．白濁部位におけるα
-アミラーゼタンパク質 の増加は特異抗体を用いたイムノブロッティングによっ ても確認された．興味深いことに，平温登熟と高温登熟 で生じた白濁部位のα
-アミラーゼアイソフォームの発現 パターンは異なっていた(24)．したがって，平温登熟と 高温登熟における玄米の白濁化には異なるα
-アミラーゼ アイソフォームが関与するものと思われる．高温登熟による米白濁化に
α
-アミラーゼの働きがかか わっているか否かをさらに検証するため，α
-アミラーゼ 発現抑制体を用いた解析が行われた．イネには活性が確 認されていないものも含めると10種類のα
-アミラーゼ 遺伝子が存在する．これらの遺伝子間で塩基配列が高度 に保存されている部分によるRNA干渉法を用いて大部 分のα
-アミラーゼ遺伝子の発現を抑制した遺伝子組換え イネが作出された．いくつかのα
-アミラーゼ発現抑制系 統を解析したところ，α
-アミラーゼ遺伝子群の発現抑制 の程度に応じて，高温登熟による白濁粒の発生が減少す ることが認められた(25)．さらに，この白濁粒発生が抑 えられる性質は次の世代に受け継がれることも確認され た(26)．種々の解析結果から，イネ登熟期に高温ストレスを受 けると登熟種子中の
α
-アミラーゼの働きが強まることに よって玄米の白濁化が助長されると考えられる．一方 で，高温登熟によるデンプン生合成能の低下がデンプン 分子構造そして顆粒形成に影響することも間違いない．しかし，デンプン分子の鎖長構造に顕著な変化が見られ ない温度条件でもデンプン顆粒の形成異常が観察され る．おそらくデンプン合成と分解のバランスが重要であ り，相対的にデンプン分解方向に傾くことによってデン プン顆粒の形成異常が起こるものと推察される．玄米の
白濁化は，腹部，背部，基部，中心部などに局所的に発 生する．背白粒の発生については効果の大きな量的形質 遺伝子座（ , ）が検出されている(27)が，そ れぞれの局所発生のメカニズムはまだよくわかっていな い．やはりそれぞれの胚乳組織部位におけるデンプン合 成と分解の機能のバランス異常によるものであろう．イ ネ登熟種子胚乳組織のデンプン集積は中心部から始ま り，周辺部へと広がる．登熟初期のデンプン代謝酵素の 発現制御によって効率的に玄米中心部の白濁化を軽減で きるかもしれない．
デンプン代謝以外の因子も玄米白濁化に 関与する
玄米の白濁化はデンプン代謝系ではない酵素・タンパ ク質の発現異常によって平温条件下でも起こる．たとえ
ば， （ ）(28)，
（ ）(29)や
（ ）(30) などが挙げられる．FLO2は後期胚発生に関与するタン パク質，またGLUP6やGAP3はゴルジ体から液胞への 貯蔵タンパク質の輸送にかかわる因子である．このよう
図2■MSD1強発現体（MSD1OE）の整粒（上図）とMSD1発現 抑制体（MSD1KD）の白濁粒（下図）の走査電子顕微鏡画像 スケール：10 µm.
日本農芸化学会
● 化学 と 生物
に玄米の白濁化は極めて複雑であり，今後，さまざまな 視点での詳細解析が必要である．
われわれは，高温登熟性が異なる品種の登熟種子のプ ロテオーム解析を行った．イネ品種としては，早生品種 である ゆきん子舞 と トドロキワセ を用いて，高 温処理は平成16年夏季に新潟県農業総合研究所（長岡 市）の温水掛け流し圃場（温水35 C，水深15 cm，水量 80 L/min）(31)において行った．温水掛け流し処理によ り，登熟期の平均気温は一般圃場（24.5 C）に比べて1.9 C上昇した．高温登熟性耐性品種のゆきん子舞(32)は温 水掛け流し処理では全く高温障害は発生しなかった．一 方，トドロキワセは高温登熟性が悪く，温水掛け流し処 理により整粒率の顕著な低下が見られた．高温区および 対照区から採取した開花後4日目の果皮を取り除いた種 子より抽出したタンパク質を2次元ゲル電気泳動法を用 いて分離し，品種特異的に変動するタンパク質を探索し た．トドロキワセでは高温ストレスによってスーパーオ キシドジスムターゼ（SOD）の発現が誘導されたが，
一方，高温登熟性の良いゆきん子舞においてはSODが 恒常的に強く発現していることが見いだされた．この SODの詳細が調べられ，ゴルジ体やプラスチドなど，
多様な細胞内局在性を示すMn型SOD（MSD1）である
ことがわかった(19)．SODは，スーパーオキシドアニオ ン（O−2）から酸素と過酸化水素（H2O2）に分解する酵 素で，タバコ，ジャガイモ，サトウダイコン，プラム，
ワタ，アルファルファをはじめさまざまな植物において ストレス抵抗性に関与することが報告されている．イネ においては，酵母やエンドウマメのミトコンドリアMn 型SODを葉緑体に発現・局在化させると塩ストレス耐 性や酸化ストレス耐性の改善が観察された(33, 34)．この ような知見から， が高温登熟耐性にかかわる因子 であると推測した．この推測は的中し， の発現を 恒常的に強めると高温登熟耐性が向上し，登熟種子胚乳 特異的に 発現を弱めると高温ストレスの感受性 が増すことが確認された(19)（図2）． を強発現す るイネでは野生型に比べて高温ストレスによって数多く の活性酸素消去系の酵素タンパク質やストレス応答タン パク質の誘導が格段に高まっており，このことが高温登 熟耐性をもたらしていると考えられた．なぜ， の 高い発現によってこのような誘導が活発になるのか．お そらく，MSD1によって生成されるH2O2がシグナル分 子として働いているのであろう．われわれは，予備的な 実験結果ではあるが，H2O2プライミング処理によって 高温登熟耐性が誘導されることを確認している．無論，
図3■高温登熟における玄米白濁化の作業仮説 開花・登熟期の異常高温によってデンプンの合成 と分解のバランスが崩れ，正常なデンプン集積と 顆粒形成に支障をきたす．一方，スーパーオキシ ドジスムターゼ（MSD1）によって生成される H2O2は高温応答シグナルとして働き，早期にスト レス応答タンパク質を誘導し，デンプンの合成と 分解のバランス異常を回避する．
日本農芸化学会
● 化学 と 生物
高温登熟性に対するMSD1の詳細な作用機作について はさらなる研究が必要であることは言うまでもない．
おわりに
高温登熟は胚乳組織細胞におけるデンプンの合成・分 解バランスを崩し，デンプン集積と顆粒形成に不具合を 生じさせ，玄米の白濁化を引き起こすものと考えられ る．玄米の白濁化の分子生理機構は，最終的にはデンプ ン顆粒構造の形成不全によるものもあるが，さまざまな 因子がかかわり，そして多様な経路が複雑に絡み合って おり，その詳細は依然として不明な点が多い．高温スト レス下にスーパーオキシドジスムターゼによって生成さ れるH2O2は高温応答シグナルとして働き，早期にスト レス応答タンパク質を誘導し，デンプンの合成・分解の バランス異常を回避する方向に導くものと思われる（図 3）．登熟種子胚乳細胞では細胞内膜系におけるグルテリ ンの成熟型への変換に伴ってO2−からH2O2が生成す る(35)．貯蔵タンパク質の細胞内膜系から液胞への輸送 にかかわる因子である や の遺伝子欠損が 玄米白濁化をもたらす原因もH2O2生成にあるのかもし
れない(36, 37)．われわれは，H2O2が高温登熟性の鍵因子
の一つであり，登熟開始時におけるH2O2濃度上昇誘導 が高温登熟性改善の戦略となりうると考えている．
文献
1) T. Tashiro & I. F. Wardlaw: , 42, 485 (1991).
2) 長田健二，滝田 正，吉永悟志，寺島一男，福田あかり：
日作記，73, 336 (2004).
3) 森田 敏：農業技術，60, 442 (2005).
4) N. Inouchi, H. Ando, M. Asaoka, K. Okuno & H. Fuwa:
, 52, 8 (2000).
5) T. Umemoto & K. Terashima: , 29, 1121 (2002).
6) N. Tanaka, N. Fujita, A. Nishi, H. Satoh, Y. Hosaka, M.
Ugaki, S. Kawasaki & Y. Nakamura: , 2, 507 (2004).
7) T. Ohdan, T. Sawada & Y. Nakamura: , 58, 19 (2011).
8) S. Asatsuma, C. Sawada, A. Kitajima, T. Asakura & T.
Mitsui: , 53, 187 (2006).
9) H. Yamakawa, T. Hirose, M. Kuroda & T. Yamaguchi:
, 144, 258 (2007).
10) 山川博幹，羽方 誠：化学と生物，49, 624 (2011).
11) T. Ishimaru, A. K. Horigane, M. Ida, N. Iwasawa, A. Y.
San-oh, M. Nakazono, K. N. Nishizawa, T. Masumura, M.
Kondo & M. Yoshida: , 50, 166 (2009).
12) T. Mitsui, J. Yamaguchi & T. Akazawa: , 110, 1395 (1996).
13) M. Tsuyokubo, T. Ookura, S. Tsukui, T. Mitsui & M. Ka-
sai: , 18, 659 (2012).
14) T. Mitsui & K. Itoh: , 2, 255 (1997).
15) A. Ochiai, H. Sugai, K. Harada, S. Tanaka, Y. Ishiyama, K. Ito, T. Tanaka, T. Uchiumi, M. Taniguchi & T. Mitsui:
, 78, 989 (2014).
16) A. Kitajima, S. Asatsuma, H. Okada, Y. Hamada, K.
Kaneko, Y. Nanjo, Y. Kawagoe, K. Toyooka, K. Matsuoka, A. Nakano : , 21, 2844 (2009).
17) Y. Nanjo, H. Oka, N. Ikarashi, K. Kaneko, A. Kitajima, T.
Mitsui, F. J. Muñoz, M. Rodríguez-López, E. Baroja- Fernández & J. Pozueta-Romero: , 18, 2582 (2006).
18) K. Kaneko, C. Yamada, A. Yanagida, T. Koshu, Y.
Umezawa, K. Itoh, H. Hori & T. Mitsui:
, 28, 69 (2011).
19) T. Shiraya, T. Mori, T. Maruyama, M. Sasaki, T. Taka- matsu, K. Oikawa, K. Itoh, K. Kaneko, H. Ichikawa & T.
Mitsui: , 13, 1251 (2015).
20) A. Villarejo, S. Burén, S. Larsson, A. Déjardin, M. Monné, C. Rudhe, J. Karlsson, S. Jansson, P. Lerouge, N. Rolland
: , 7, 1224 (2005).
21) S. Burén, C. Ortega-Villasante, A. Blanco-Rivero, A. Mar- tínez-Bernardini, T. Shutova, D. Shevela, J. Messinger, L.
Bako, A. Villarejo & G. Samuelsson: , 6, e1 (2011).
22) K. Tsutsui, K. Kaneko, I. Hanashiro, K. Nishinari & T.
Mitsui: , 53, 187 (2013).
23) T. Mitsui, T. Shiraya, K. Kaneko & K. Wada:
, 4, 36 (2013).
24) 金古ほか：未発表データ．
25) M. Hakata, M. Kuroda, T. Miyashita, T. Yamaguchi, M.
Kojima, H. Sakakibara, T. Mitsui & H. Yamakawa:
, 10, 1110 (2012).
26) 山川博幹，羽方 誠，黒田昌治，宮下朋美，山口武志，
小嶋美紀子，榊原 均，三ツ井敏明：JATAFFジャーナ ル，1, 24 (2013).
27) A. Kobayashi, J. Sonoda, K. Sugimoto, M. Kondo, N. Iwa- sawa, T. Hayashi, K. Tomita, M. Yano & T. Shimizu:
, 63, 339 (2013).
28) K. C. She, H. Kusano, K. Koizumi, H. Yamakawa, M.
Hakata, T. Imamura, M. Fukuda, N. Naito, Y. Tsurumaki, M. Yaeshima : , 22, 3280 (2010).
29) M. Fukuda, L. Wen, M. Satoh-Cruz, Y. Kawagoe, Y.
Nagamura, T. W. Okita, H. Washida, A. Sugino, S. Ishino, Y. Ishino : , 162, 663 (2013).
30) Y. Ren, Y. Wang, F. Liu, K. Zhou, Y. Ding, F. Zhou, Y.
Wang, K. Liu, L. Gan, W. Ma : , 26, 410 (2014).
31) 石崎和彦：農業技術，60, 458 (2005).
32) 農林水産省：平成22年度高温適応技術レポート．
33) Y. Tanaka, T. Hibino, Y. Hayashi, A. Tanaka, S. Kishi- tani, T. Takabe, S. Yokota & T. Takabe: , 148, 131 (1999).
34) F.-Z. Wang, Q.-B. Wang, S.-Y. Kwon, S.-S. Kwak & W.-A.
Su: , 162, 465 (2005).
35) Y. Onda, T. Kumamaru & Y. Kawagoe:
, 106, 14156 (2009).
36) Y. Onda, A. Nagamine, M. Sakurai, T. Kumamaru, M.
Ogawa & Y. Kawagoe: , 23, 210 (2011).
37) Y. Onda & Y. Kawagoe: , 6, 1966 (2011).
日本農芸化学会
● 化学 と 生物
プロフィール
三ツ井 敏明（Toshiaki MITSUI）
＜略歴＞1986年名古屋大学大学院農学研 究科生化学制御専攻博士後期課程修了（農 博）／同年日本学術振興会特別研究員／同 年 新 潟 大 学 農 学 部 助 手／1993年 同 助 教 授／2002年同教授／2008年新潟大学自然 科学系大学院自然科学研究科主担当，現在 に至る．この間，1989〜1991年米国ケー スウェアスタンリザーブ大学医学部博士研 究員＜研究テーマと抱負＞イネデンプン代 謝制御に関する分子細胞生物学，特に，糖 タンパク質のプラスチドターゲティングや 高温登熟耐性イネの開発に興味＜趣味＞昼 寝
Copyright © 2016 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.54.254
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