659
化学と生物 Vol. 55, No. 10, 2017
GLUT4 の細胞内動態を可視化する
化学アプローチで明らかとなった糖鎖の役割
グルコース輸送体の一種であるGLUT4は，主に筋肉組 織や脂肪組織に発現する12回膜貫通型タンパク質であり，
インスリン刺激に応じて血中のグルコースを細胞内に取 り込み血糖値を下げる役割を担っている(1)．GLUT4は，
通常は細胞内に存在するが，インスリンが分泌されると 細胞膜へ移行しグルコースを細胞内に取り込む．この制 御機構が正常に機能しなくなり，グルコースを細胞内に 取り込めなくなることは，2型糖尿病の発症の原因とな る．このため，GLUT4の細胞内動態の制御機構を明らか にすることは，生命科学や医学の観点から重要な課題で ある．近年，GLUT4の細胞膜外ループのAsnに付加さ れる糖鎖（N-結合型糖鎖）が，GLUT4の細胞内動態の 制御に関与していると報告された(2)．これに対し，N-結 合型糖鎖は，GLUT4の細胞内動態には影響を与えない という研究結果も発表されており(3)，その役割の有無に 注目が集まっていた．本研究では，新たに高精度なタン パク質イメージング技術を開発することで，GLUT4の 動態を解析しN-結合型糖鎖の役割を調べることを目的 とした．
筆者らは，紅色硫黄細菌由来の小タンパク質（125ア ミノ酸）であるPYP（Photoactive yellow protein）をタ グタンパク質として標的タンパク質につなぎ，合成蛍光 プローブによって特異的にPYPタグをラベル化すること によって，標的タンパク質を蛍光イメージングする手法 を開発してきた(4)．この技術のポイントは，プローブが 遊離状態では非蛍光性で，タンパク質をラベル化すると 蛍光性となる「発蛍光プローブ」を用いることである．
通常のプローブは，常に蛍光を発するため，細胞に発現 しているタンパク質をイメージングするには，洗浄操作 により遊離のプローブを除く必要がある．これに対し，
発蛍光プローブは，洗浄操作を行うことなく迅速かつ高 いコントラストでタンパク質をイメージングできる．本 研究で，GLUT4の細胞内動態を詳細に解析するために，
PYPタグをラベル化する複数の新たな発蛍光プローブを 開発した．開発したプローブのうち，AT-DNB2と名づ けたものは，細胞膜非透過性でPYPタグをラベル化する と遠赤色の蛍光を発する．このプローブをGLUT4の動 態解析に用いる利点は，GLUT4の細胞膜外ドメインに
PYPタグをつないだとき，細胞内のGLUT4をラベル化 することなく，選択的に細胞膜移行したGLUT4をラベ ル化できることである．さらに，AT-DNB2は発蛍光プ ローブであるため，洗浄操作なしでインスリン存在下の GLUT4の動態をイメージングできることである．洗浄操 作を行うとインスリンも除去されるため，GLUT4の動態 に影響するが，AT-DNB2を用いることでこの悪影響を 回避できる．実際に，PYPをGLUT4の細胞膜外ループ に挿入したPYP-GLUT4を細胞に発現させ，AT-DNB2 を添加したところ，インスリンに応答したPYP-GLUT4
図1■PYPタグラベル化技術を用いたGLUT4の細胞内動態の 可視化と糖鎖の機能解析
（A）インスリン存在下における正常糖鎖をもつGLUT4の細胞内 動態（右は実際のイメージング画像で，スケールバーは10 µmを 示す）．PYPタグは，細胞膜外ループに挿入されており，膜非透 過性プローブを用いると細胞内のPYP-GLUT4はラベル化されず，
細胞膜移行したPYP-GLUT4のみラベル化される．また，用いた プローブは，遊離状態では非蛍光性でラベル化されると蛍光強度 が上昇する．このため，遊離プローブを洗浄操作により除去する ことなくイメージング実験ができる．（B）インスリン存在下にお ける糖鎖欠損GLUT4の細胞内動態（右は実際のイメージング画 像で，スケールバーは10 µmを示す）．GLUT4の糖鎖欠損変異体 を用いてイメージングを行うと，インスリン刺激によりPYP- GLUT4変異体は細胞膜移行し，プローブによりラベル化され細胞 膜にとどまることなくエンドサイトーシスする．
日本農芸化学会
● 化学 と 生物
今日の話題
660 化学と生物 Vol. 55, No. 10, 2017
の細胞膜移行が洗浄操作なしで観察できた．
次に，N-結合型糖鎖の役割を調べるために，糖鎖形成阻 害剤や糖鎖欠失変異体を用い，糖鎖の異常がPYP-GLUT4 の動態に与える影響についてイメージング実験により検討 した．驚いたことに，インスリン存在下では，AT-DNB2 が細胞膜非透過性であるのにもかかわらず，その蛍光は 細胞内から観測された．この結果は，糖鎖に異常のある PYP-GLUT4は，インスリン刺激により一過性に細胞膜 移行してAT-DNB2によりラベル化され，その後迅速に 細胞内にエンドサイトーシスすることを示唆した．そこ で，エンドサイトーシスを阻害したところ，AT-DNB2 由来の蛍光が細胞膜上から観測されたことから，糖鎖異 常のあるPYP-GLUT4は一過性に細胞膜移行することが 証明された．以上の結果から，糖鎖は，GLUT4の細胞 膜への局在を維持させる役割を果たしていると考えられ た(5)（図1）．
GLUT4の膜局在の維持にかかわるしくみの破綻は，
血糖値の上昇を引き起こし，2型糖尿病の発症の原因と なる可能性がある．本研究の結果は，GLUT4の膜局在 化機構の解明に加え，糖尿病の発症機構の解明と治療薬 の開発につながることが期待される．
1) D. Leto & A. R. Saltiel: , 13, 383 (2012).
2) Y. Haga, K. Ishii & T. Suzuki: , 286, 31320 (2011).
3) N. Zaarour, M. Berenguer, Y. Le Marchand-Brustel & R.
Govers: , 445, 265 (2012).
4) Y. Hori & K. Kikuchi: , 17, 644
(2013).
5) S. Hirayama, Y. Hori, Z. Benedek, T. Suzuki & K. Kikuchi:
, 12, 853 (2016).
（堀 雄一郎*1,2，菊地和也*1,2，*1 大阪大学大学院工学 研究科，*2 大阪大学免疫学フロンティア研究センター）
プロフィール
堀 雄一郎（Yuichiro HORI）
＜略歴＞2001年京都大学大学院薬学研究 科 修 士 課 程 修 了／2004年 同 博 士 課 程 修 了／同年ロックフェラー大学博士研究員／
2006年大阪大学大学院工学研究科助教／
2012年JSTさきがけ研究者（兼任）／2013 年大阪大学免疫学フロンティア研究セン ター助教（兼任）／2016年大阪大学大学院 工学研究科准教授，同免疫学フロンティア 研究センター准教授（兼任），現在に至る
＜研究テーマと抱負＞蛍光プローブの開 発，ケミカルバイオロジー，タンパク質・
ペプチドの機能化学＜趣味＞読書，ジョギ ング
菊地 和也（Kazuya KIKUCHI）
＜略歴＞1990年東京大学大学院薬学系研 究科修士課程修了／1994年同博士課程修 了／同年カリフォルニア大学サンディエゴ 校博士研究員／1995年スクリプス研究所 リサーチアソシエイト／1997年東京大学 大学院薬学系研究科助手／2000年同助教 授／2005年大阪大学大学院工学研究科教 授／2009年同大学免疫学フロンティア研 究センター教授（兼任），現在に至る＜研 究テーマと抱負＞化学プローブの設計・合 成・生物応用
Copyright © 2017 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.55.659
日本農芸化学会
