IR-LEGO（Infrared laser-evoked gene operator）とは，赤外 レーザーを生体の単一細胞（組織）に照射することで細胞を 温 め て 熱 シ ョ ッ ク 応 答 を 起 こ さ せ，熱 シ ョ ッ ク プ ロ モ ー ター下流の遺伝子の発現誘導を行うシステムである．この技 術を用いることにより，特定の時期に特定の細胞で特定の遺 伝 子 の 発 現 を 誘 導 す る こ と が 可 能 と な る．本 稿 で はIR- LEGO技術の原理や応用例について紹介するとともに，われ われが所属する基礎生物学研究所の共同利用研究システムに ついて紹介する．
はじめに
多細胞生物の複雑な生命現象において，細胞はどのよ うに自分の方向性を決めているのだろうか．そこには細 胞間の相互作用が重要な役割を果たしている．細胞は増 殖，発生，分化，再生，がん化などのさまざまな生体反 応において，周囲の細胞からの刺激やシグナルを受けて
おり，近年そのような情報交換にかかわる分子が多数同 定されてきた．しかしそれらが本当に細胞間相互作用に 関与するのかを生きた生体内で解析する手段はいまだに 十分に確立されているとは言えない．IR-LEGOはその ような問題を解決する一つの手段として開発された(1)
．
これまでも組織特異的あるいはランダムに遺伝子発現を 引き起こすモザイク解析と呼ばれる方法はあったが，一 細胞レベルで自分の狙った時期に狙った細胞だけで特定 の遺伝子の発現を誘導できる方法はなかった．たとえば 体全体で発現させると致死になってしまう遺伝子でも，体のある場所でだけその遺伝子の発現をなくすと個体自 体は致死にはならず，発現した細胞あるいは近接する細 胞でどのような異常が起こるかを調べることによりその 遺伝子の機能を知ることが可能となる．また，それ以外 にも蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を発現させ ると細胞のトレースや系譜解析など，さまざまな研究に 応用できる．IR-LEGO技術は生物がもともともつ熱 ショック応答機構を利用しているため，形質転換体の作 成が可能な生物であればどんな生物にも応用可能であ る．実際，すでに線虫(1〜3)
，ショウジョウバエ
(4, 5)，メ
ダカ(6〜9)
，ゼブラフィッシュ
(6, 10, 11)，アフリカツメガエ
【解説】
Introduction of Infrared Laser Evoked Gene Operator (IR-LEGO) Technique
Misako SAIDA-TANIGUCHI, Yasuhiro KAMEI, *1 自然科学研究 機構基礎生物学研究所生物機能解析センター，*2 自然科学研究機 構基礎生物学研究所研究力強化戦略室，*3 総合研究大学院大学生 命科学研究科
IR-LEGO技術の紹介と その利用方法
斎田（谷口）美佐子 * 1 ，亀井保博 * 1 , 2 , 3
ル(12)
，シロイヌナズナ
(6, 13)で実施例が報告されており，イベリアトゲイモリ(14)
，ゼニゴケで筆者らが共同研究
者とともに応用可能なことを確認している．本稿ではこ のIR-LEGO技術の原理を紹介するとともに，われわれ が所属する基礎生物学研究所の共同利用研究システムを 利用して実施された具体的な応用研究も紹介する．原理 1. 概要
ほとんどの生物は高温などのストレス環境下において 通常発現していない遺伝子群の発現が起こることが知ら
れており，この反応は「熱ショック応答」と呼ばれてい る（図
1
）．IR-LEGOではこの熱ショック応答を利用す
る．熱ショック応答タンパク質のプロモーターの下流に 任意の遺伝子のcDNA配列をもつ形質転換体を作製す る（図2
a）．この形質転換体に顕微鏡下で赤外レーザー
を局所的に照射すると焦点位置の細胞のみが温められ，その細胞でのみ熱ショック応答が起こり，目的の遺伝子 の発現を誘導することができる（図2b）
．
2. 装置の構成
IR-LEGOは顕微鏡に赤外レーザーおよびコントロー ラーが付いたシンプルな構成となる．倒立顕微鏡の場合 の装置の大まかな構成を図
3
に示した．発振器より発振 されたIRレーザーはファイバー伝送後ビームエキスパ ンダで広げ，ビーム径を最適化して平行光としてダイク ロイックミラーで無限遠光学系に合流し，対物レンズを 通って試料面へと照射される（図3）．レーザー照射は
円錐状に当てて円錐の頂点，すなわち焦点位置のエネル ギーが最も高くなる．観察系と同軸で照射できるため，蛍光観察しながらの照射も可能である．
実験を行うにあたって
1. 熱ショック応答形質転換体の作製
熱ショック応答システムはほぼすべての生物種がもと も と も っ て い る ス ト レ ス 応 答 機 構 で あ る た め，IR- LEGOは多くの実験生物への応用が可能である．実質的
図2■IR-LEGOの概要
a. 熱ショックプロモーターで標的遺伝子をド ライブできるトランスジェニック系統を作製 する．b. できた系統の個体（図ではメダカ胚）
の局所の単一細胞をねらって赤外レーザーを照 射すると，局所加熱され熱ショック応答によ り単一細胞レベルで標的遺伝子を誘導できる．
図1■動物細胞の熱ショック応答機構
熱ショックやストレスを受けると内在のHSF1が変性し，三量体 を 形 成 し，核 に 移 行 す る．核 内 に 移 行 し た 三 量 体HSF1は 熱 ショックエレメントに結合し，下流の熱ショックタンパク質の発 現を誘導する．
な問題は，その生物で，形質転換体の作製方法が確立さ れているか，利用できる熱ショック応答遺伝子プロモー ターがあるかである．前者は現在多くの生物種で遺伝子 導入法が確立されている．後者はもし既存の適当なプロ モーターがない場合は研究者自身で検定する必要があ る．熱ショック系タンパク質はものによって発現の強弱 などに差があるので，できれば複数を試すのが良いだろ う．表
1
に実際これまでにIR-LEGOでの発現誘導に成 功した熱ショックプロモーターをリストした．2. 赤外レーザーの特徴と使用上の注意点
IR-LEGOでは熱ショック応答のための照射に1,480 nm の波長の赤外レーザーを使う．この波長を使う理由は生 体の主要構成成分である水分子の吸収が大きく，効率良 く細胞を温められるからである．本稿で詳細は解説しな いが，赤外レーザー照射に伴う温度の経時変化や空間的 特性に関しても検討しており，熱により熱ショックが駆 動していることがわかっている(1)
．しかし，赤外レー
ザーを使ううえで注意しなければならない点がいくつかある．以下に列挙する．
1）対物レンズの透過率
通常の対物レンズは可視領域での観察しか想定されて いないので，せいぜい300〜1,000 nmでの透過率しか チェックされていない．IR-LEGOで使う1,480 nmとい う波長は対物レンズ設計上想定外であるため，透過率が 未知で，たいていは可視光に比べて透過率が悪い．赤外 域の透過率が悪い原因は主にレンズ面の反射防止マルチ コーティング成分にあるため，IR-LEGO用の対物レン ズはノンコーティングの特注品となる．もちろんパワー の高いレーザーを用いれば通常の対物レンズでもある程 度適用が可能である．
2）対物レンズの色収差
光がレンズを通過するとき波長ごとに屈折率が異なる ため，結像位置のずれが生じる．通常，研究用の顕微鏡 に付いている対物レンズはその用途に応じてこの結像位 置のずれが補正されているが，またしても赤外域という のは観察に必要ないため補正対象外である．レンズの種 類によるが，可視領域と1,480 nmでは数ミクロンから
図3■IR-LEGOの装置構成
無限遠光学系の顕微鏡躯体へビーム経調整し た赤外レーザーをダイクロイックミラーを通 して導入する．基本的に観察面に集光するが，
対物レンズは可視光に合わせて設計されてい るために赤外の焦点位置が多少ずれる．光学 ユニット内にはアクチュエーターが設置され ており，これにより観察面（可視光）と赤外 焦点位置を補正する．照射パワーは減光フィ ルターならびに発振器の電流量で調節する．
また，照射時間はシャッターユニットにより 制御する．
表1■実際にIR-LEGOでの発現誘導に使用された熱ショックプロモーター
応用生物種 プロモーター 詳細
線虫 hsp16-2 線虫hsp16-2上流約0.4 kb(1) メダ力 hsp70.1 メダ力hsp70.1上流1.5〜3 kb(6, 14)
8xHSE 人工熱ショックプロモーター(7〜9, 15) ゼブラフィッシュ hsp70 ゼブラフィッシュ hsp70上流約1.5 kb(6, 10, 11)
シロイヌナズナ hsp18.2 シロイヌナズナhsp8l.2上流約0.9 kb(6)
アフリカツメガエル hsp70 アフリカツメガエルhsp70上流−256から＋88 bpの345 bp(12) ショウジョウバエ hsp70 ショウジョウバエhsp70上流−315 bpから−38 bpの278 bp(4)
十数ミクロンのずれが生じる．これを解消するために IR-LEGOではIRレーザーの光路に補正用のアクチュ エーターがあり，対物レンズごとに観察焦点位置とぴっ たり一致するように調整できるようになっている（図3）
．
3）組織内部の照射の際の注意点
組織の深い位置，すなわち表面から離れた位置で発現 誘導をさせることは少し難しい．なぜなら，赤外レー ザーは通過経路で吸収されて目的位置でのパワーが減少 するからである．実際，寒天を用いた実験では約170
μ
m の深さで半分のパワーが吸収されることが確認された．また焦点位置で最もパワーが高くなるとはいえ，当然そ の周囲も加温されるため，焦点位置でのみ熱ショック応 答が起こる照射条件にするためには条件検討が必要であ る．また同時に，通り道では生体の組成が異なるため屈 折率分布が存在し，深くなればなるほど集光点が広がっ てしまい単一細胞レベルでの発現誘導が難しくなる．
4）赤外レーザー取扱い上の注意点
機種によっては1 Wという高出力の赤外レーザーを搭 載している．これは直接あるいは鏡面反射した光だけで なく散乱光も危険とされる最も危険なレベルであるレー ザー安全基準クラス4に分類され，保護メガネの着用や 安全教育などが必須とされている．パワーが高いことに 加えて目に見えない波長であるため取扱いにはより注意 が必要である．
これまでの研究報告例
ここまでIR-LEGOの技術的な解説をしてきたが，次 に実際IR-LEGOを用いた研究例をいくつか紹介したい．
まず，2009年に報告された初報(1)では，線虫
を用いた実験が行われ，生殖細胞の形成に必要な遺伝子 の働きがIR-LEGOを用いて証明された． の生 殖器官は遠位端細胞（DTC）と呼ばれる細胞が体の中 を移動しながら形成されるが， という遺伝子の欠 損変異体ではDTCの移動に異常が見られ，正常な生殖 器官が形成されない．そこで 変異体でIR-LEGOを 用いて本来 を発現する細胞だけに の発現を誘 導したところ，DTCは高い確率で正しい方向へ移動す るようになり，正常な生殖器官を形成した．これによっ て がDTC移動に必要であることが直接証明され た．また，2013年に報告されたメダカを用いた島田ら の論文(9)では，蛍光タンパク質による細胞の系譜解析が 行われ，魚のうろこの進化的な起源についてこれまでの 知見を覆す結果が得られた．つまりそれまでは硬骨魚の うろこは外胚葉である神経堤由来と考えられていたが，
この研究により中胚葉由来であることが示された（表紙 写真）
．この実験では移植実験とIR-LEGOによる発現誘
導実験とが行われたが，移植の場合はほかの細胞や組織 片の混入など外科的処置自体の精度が問われるが，IR- LEGOによる解析ではそのような心配がない．また，こ の実験ではIR-LEGOの発現誘導を恒常的に維持するた めにcre/loxPという部位特異的組換え技術が利用された(7〜9)
．ファージ由来のDNA組換え酵素CreはloxPと
いう特定のDNA配列を認識し，組換えを起こす．発現 させたい遺伝子（この場合GFP）は熱ショックプロ モーターの下流ではなく，loxP配列の下流に，そして loxP配列の間には転写をストップさせる配列を挿入し ておく．そこに熱ショックプロモーターの下流にcreを つないだトランスジーンが共存すると，熱ショック応答 によりcreが発現し，Cre組換え酵素の働きによりloxP の間のストップ配列が外れ，目的の遺伝子が発現するよ うになる．これにより一過的な熱ショック応答で恒常的 な遺伝子発現が可能となった（図
4
）．
IR-LEGOを使うには？
基礎生物学研究所の共同利用研究システムの紹介 もしIR-LEGOを試してみたいという方がいたら，ぜ ひわれわれにご相談いただきたい．われわれが所属する 基礎生物学研究所は大学共同利用機関であり，日本国内 の研究者であればだれでも利用申請が可能である．実 際，毎年多くの研究者がIR-LEGOをはじめとした最先
図4■一過性の熱ショック応答を長期的発現誘導に切り替える 熱ショック応答で誘導する遺伝子をCre（組換え酵素）にするこ とで，長期的な発現誘導を可能にする．組み換え自体は細胞単位 で起こるため，一度組み換えられればその細胞の系譜はすべて gene Xを発現するようになる．
端機器を使いに研究所を訪れ，数多くの研究成果を発表 している．利用可能な機器としてはIR-LEGOのほかに，
二光子顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡，ライトシート顕 微鏡などの顕微鏡類，その他各種分析機器も充実してい る．研究所には宿泊施設も併設されており，旅費などの 支給もされる．利用のための申請の流れを図
5
に示し た．詳しくは基礎生物学研究所のホームページ（http://www.nibb.ac.jp/collabo/collabo.html; IR-LEGOは個別共 同 利 用 研 究 に 該 当） も し く は 担 当 窓 口（img@nibb.
ac.jp）に直接お問い合わせいただきたい。
IR-LEGOシステムはシグマ光機株式会社から販売さ れている．正立顕微鏡と倒立顕微鏡のどちらにも対応し ているが，一部機能については倒立のみの対応となって いる．また，赤外レーザーの発振出力は200 mWと1W の2つのタイプがあるが，現状のレンズ群では200 mW あれば十分と推定している．一式購入するとそれなりに 高価にはなるが，既存の顕微鏡へのアドオンも可能であ り，すでに顕微鏡があればその分安くセットアップがで きる．ちなみにわれわれが所有している機器は倒立顕微 鏡と赤外レーザー1W搭載タイプである．
まとめ（おわりに）
IR-LEGO法は現在のところ，熱ショック応答系に利 用できる熱ショックプロモーターが確立されている多く のモデル動植物でワークすることが確認されている．し かし，そのほとんどはGFPなどのレポーター遺伝子に よる発現誘導確認実験である．いくつかの生物種では内 在遺伝子による機能解析に成功しており，新たな知見も 得られ始めており，今後もさまざまな細胞間コミュニ ケーションにかかわる遺伝子機能解析に利用されるであ ろう．一方で，熱ショック以外に温度や熱による生体応 答の研究にも利用可能であり，その方面での利用も想定 される．たとえば，温度を感知する神経細胞の研究や，
温度ストレスによる性転換機構の解明などに利用するこ とが可能である．
近年オプトジェネティクスによる神経細胞の光刺激で 新たな神経研究分野が広がったように，IR-LEGOによ る遺伝子発現誘導による機能解析研究分野が生まれれば と思っている．顕微鏡は観る道具であったが，オプト
ジェネティクスやIR-LEGOは細胞を操作する顕微鏡技 術であり，これら光細胞操作技術が今後さまざまな生命 現象の解明に応用されるであろう．
謝辞：本稿の研究例の多くは，基礎生物学研究所の共同利用研究課題に より実施された成果です．共同研究者の方々にはこの場を借りて御礼申 し上げます．また，シグマ光機株式会社の大宮弘道氏には光学系に関し てご助言いただきました．IR-LEGOの分子生物学的あるいは光学的な改 良は科研費（研究課題番号：23657109, 26282128），物質・デバイス領域 共同研究課題（課題番号：2013B04, 2014051）のサポートを受けました．
文献
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図5■基礎生物学研究所共同利用研究の利用 方法
研究計画などを事前に打ち合わせ，申請書を 提出していただき，審査を経て採択された後 に利用が可能となる．
プロフィル
斎田（谷口） 美佐子
（Misako SAIDA-TANIGUCHI）
＜略歴＞1995年名古屋大学農学部農芸化 学科卒業／1997年同大学大学院農学研究 科修士課程修了／同年国立遺伝学研究所技 術職員／2009年基礎生物学研究所技術職 員，現在に至る＜研究テーマと抱負＞大学 共同利用機関の技術職員として，光学顕微 鏡の管理・運営を行い，研究者へ技術サ ポートを行っています＜趣味＞バドミント ン
亀井 保博（Yasuhiro KAMEI）
＜略歴＞1992年大阪府立大学工学部応用 化学科卒業／1994年同大学大学院工学研 究科博士前期課程修了／1999年宮崎医科 大学大学院医学研究科博士課程修了（博士
（医学）），大阪大学生命機能研究科ポスド ク，産業技術総合研究所ポスドクなどを経 て，2003年京都大学放射線研究センター 助手・助教／2008年大阪大学大学院医学 系研究科特任研究員／2010年基礎生物学 研究所特任准教授／2012年総合研究大学 院大学生命機能研究科准教授（兼）／2013 年基礎生物研究所研究力強化戦略室URA
（兼），現在に至る＜研究テーマと抱負＞生 物学的発見の現場に居合わせ，共同研究者 とワクワクを共有すること＜趣味＞遊び全 般（特にサンプリング），読書＜所属研究 室ホームページ＞http://www.nibb.ac.jp/
lspectro/＜リ サ ー チ マ ッ プ＞http://re- searchmap.jp/ykamei/
Copyright © 2015 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.53.580
