N.M. Widi Astuti1)N.P. Linda Laksmiani2), I.M.A. Gelgel Wirasuta3)
2PS S1 Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana, Kampus Bukit Jimbaran, Badung, 80361 Telp/Fax : 081805378490, E-mail : [email protected]
2PS S1 Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana, Kampus Bukit Jimbaran, Badung, 80361
3PS S1 Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana, Kampus Bukit Jimbaran, Badung, 80361
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk melihat aktivitas kemoprevensi dari ekstrak metanolik biji alpukat (Persea
americana MILL.) agar dapat dikembangkan sebagai senyawa antikanker. Kandungan flavonoid quercetin dan
katekin dalam biji alpukat memiliki aktivitas antikanker (sitotoksik). Sel WiDr merupakan sel kanker kolon yang diisolasi dari kolonmanusia. Penelitian ini diawali dengan ekstraksi biji alpukat dengan metanol, dilanjutkan dengan pembuatan larutan uji ekstrak dalam berbagai seri konsentrasi dan preparasi sel. Uji sitotoksisitas ekstrak dilakukan dengan metode MTT dimana perlakuan terhadap sel WiDr dilakukan selama 24, 48, dan 72 jam. Pengamatan apoptosis akibat perlakuan ekstrak dilakukan dengan metode flowcytometry. Penghambatan siklus sel/proliferasi sel dilakukan dengan membandingkan antara efek perlakuan ekstrak dengan kontrol. Hasil uji induksi apoptosis dengan flowcytometrymenunjukkan jumlah sel hidup pada pemberian perlakuan IC50 ekstrak lebih sedikit dibandingkan kelompok kontrol. Hal ini berbanding terbalik dengan jumlah sel yang mengalami nekrosis dimana pada pemberian perlakuan IC50 ekstrak jumlah sel nekrosis lebih banyak dibandingkan kelompok kontrol. Ekstrak metanolik biji alpukat memiliki aktivitas induksi apoptosis akan tetapi jumlah sel hidup dari jam ke jam6-72 semakin meningkat.
Kata kunci: apoptosis, MTT, biji alpukat, flowcytometry, sel WiDr ABSTRACK
This study aims to see the chemoprevention activity of methanolic extract of avocado seed (Persea americana MILL) to be developed as an anticancer compound. The content of quercetin and catechin in avocado seed has anticancer (cytotoxic)activity. The WiDr cell is a colon cancer cell that was isolated from human colon. First step was extraction of avocado seeds with methanol, followed by the preparation of extract test solutions in various series of concentrations and cell preparations. Cytotoxicity test was performed by MTT method where the treatment of WiDr cells was performed for 24, 48, and 72 hours. Observation of apoptosis due to extract treatment was done by flowcytometry method. Cell cycle/cell proliferation inhibition was done by comparing the effect of extract treatment with control. The result of apoptotic induction test showed live cell count on treatment IC50extract was less than control group. This is inversely related to the number of necrosis cells where in the treatment IC50 extract the number of necrosis cells more than the control group. Methanolic extract of avocado seed has an apoptotic induction activity but the number of living cells from hour to hour 6-72 is increasing.
Keywords: apoptosis, MTT, avocado seeds, flowcytometry, WiDr cells
1. PENDAHULUAN
Kanker merupakan salah satu jenis penyakit yang sering menyebabkan kematian yang ditandai dengan pertumbuhan jaringan yang pesat dan tidak terkendali. Kanker kolon merupakan penyebab kematian tertinggi ketiga di seluruh dunia yang terjadi baik pada pria maupun wanita (NCCN, 2014). Kanker kolon di Indonesia menempati urutan ke-4 dari 10 kanker penyebab kematian yang paling sering terjadi (Purwani dan Suhartono, 2014).Faktor risiko penyebab kanker kolon adalah peningkatan intensitas kontak zat-zat toksik dengan kolon. Kebiasaan merokok, konsumsi alkohol, dan obesitas juga dapat meningkatkan insidensi penyakit ini (De Vita et al., 2008).
Salah satu bahan alam yang memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker adalah biji alpukat (Persea americana MILL.). Biji alpukat memiliki kandungan katekin dan quercetin yang telah diketahui memiliki aktivitas antikanker. Quercetin dan katekin memiliki aktivitas sitotoksik pada neuroblastoma; sel HepG2 (Hepar); sel HCT15 (Kolon); sel PC3 (Prostat) dan MCF-7 (Payudara) (Priya et al., 2013; Joshiet al., 2011; Chien et al., 2009; Evacuasiany et al., 2014).
SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI IV 2017
“Inovasi Humaniora, Sains dan Teknologi untuk Pembangunan Berkelanjutan”
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antikanker (sitotoksik) dari ekstrak metanolik biji alpukat terhadap sel kanker kolon yaitu sel WiDr dengan melihat aktivitas antiproliperatifnya menggunakan metode MTT yang dikombinasi dengan flowcymetry.
2. METODE PENELITIAN
Serbuk biji alpukat sebanyak 1 Kg dimaserasi dengan metanol sebanyak tiga kali selama 3 hari. Filtrat diuapkan dengan rotary evaporator dan dikeringkan dengan freeze-dryer. Larutan uji ekstrak dibuat 5 seri konsentrasi masing-masing 12,5 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, dan 150 µg/mL menggunakan kosolven DMSO dan media penumbuhDulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) high glucose yang mengandung Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco). Preparasi sel dilakukan dengan cara memindahkan sel dari tangki nitrogen cair ke dalam conical tube steril yang berisi media, disentrifugasi 600 rpm 5 menit, supernatan dibuang lalu ditambahkan media yang baru, dimasukkan ke dalam inkubator CO2 37o 24 jam dengan aliran CO2 5%, lalu media kultur diganti begitu seterusnya hingga diperoleh sel kofluen. Selanjutnya media dibuang, sel dicuci dengan PBS dan ditambahkan tripsin-EDTA diinkubasi 3 menit. Media ditambahkan, sel diresuspensi lalu dipindahkan ke dalam conical tube steril. Sel dihitung dengan haemositometer dan dibuat sel dengan konsentrasi yang dibutuhkan.
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan mendistribusikan 1 x 104 sel/sumuran ke dalam plate 96 sumuran, diinkubasi 24 jam. Media diambil, dicuci PBS kemudian ditambahkan 100 µl media kultur saja (kontrol) atau sampel, diinkubasi 24 jam. Media kultur yang mengandung sampel dibuang, dicuci dengan 100 µl PBS. Kemudian ditambahkan 100 µl media kultur yang mengandung MTT 5 mg/mlke dalam masing-masing sumuran, diinkubasi 37oC 4 jam. Media yang mengandung MTT dibuang, dicuci PBS kemudian ditambahkan 200 µl larutan asam isopropanol. Dikocokdengan shaker 10 menit, kemudian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1. Hasil
SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI IV 2017 “Inovasi Humaniora, Sains dan Teknologi untuk Pembangunan Berkelanjutan”
Hasil uji induksi apoptosis dengan flowcytometry dapat dilihat pada gambar 2 dan tabel1.
Gambar 2. Hasil analisis dengan pencarian sek pada konsentrasi KS (Kontrol Sel) dan IC50;
Kiri bawah: sel hidup, Kanan bawah: apoptosis awal, Kanan atas: apoptosis akhir, dan Kiri atas: nekrosis
Tabel 1. Persentase Hasil Induksi Apoptosis pada Sel WiDr Percentage of WiDr cells population Sample Living Cells Early Apoptotic Late Apoptotic Necrosis Cells control 97.86 1 0.56 0.57 ¼ IC50 97.86 1.06 0.62 0.46 ½ IC50 97.44 0.92 0.73 0.91 IC50 96.81 0.68 0.76 1.65 3.2. Pembahasan
Dalam pengembangan obat antikanker baru, evaluasi preklinik terkait uji aktivitas neoplastiknya sangatlah penting. Dalam hal ini dilakukan uji untuk mengetahui potensi ketoksikan bahan uji yaitu ektrak biji alpukat terhadap sel WiDr. Uji sitotoksisitas merupakan evaluasi yang telah terstandarisasi untuk menentukan apakah suatu material mengandung bahan yang berbahaya (toksik) secara biologis. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan biji alpukat sebagai agen kemoterapi melalui uji efek sitotoksik dan kemampuan apoptosisnya.Efek sitotoksik ekstrak biji alpukat pada sel WiDr mungkin disebabkan oleh cell cycle arrest atau apoptosis induksi. Pengamatan kinetika proliferasi sel perlu dilakukan untuk mengetahui terjadinya penghambatan proliferasi sel yang dapat berupa cell cycle arrest maupun cell cycle delay.
Aktivitas kemoprevensi suatu senyawa dapat ditunjukkan melalui penghambatan proliferasi sel. Gambar 1 menunjukkan hasil uji aktivitas antiproliferatif ekstrak metanolik biji alpukat. Berdasarkan gambar tersebut terlihat bahwa kelompok kontrol memberikan nilai absorbansi yang lebih besar dibandingkan kelompok perlakuan. Perbedaan nilai absorbansi yang diberikan oleh kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan cukup signifikan, hal ini terlihat dari pengamatan pada jam ke-6 sampai jam ke-72, baik pada konsentrasi ekstrak 50 ug/mL maupun 100 ug/mL. Ini menunjukkan bahwa biji alpukat mengandung senyawa yang menghambat proliferasi sel kanker.
Prinsip dari uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT yaitu adanya sistem reduktase yang mereduksi garam kuning tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid). Dari reaksi tersebut akan terbentuk garam formazan akibat reduksi reagen garam tetrazolium MTT
SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI IV 2017
“Inovasi Humaniora, Sains dan Teknologi untuk Pembangunan Berkelanjutan”
oleh enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat pada sel yang viabel (Doyle and Griffiths, 2000). Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam mitokondria sel-sel yang hidup membentuk kristal formazan yang tidak larut air. Nilai absorbansi diberikan oleh garam formazan yang berwarna ungu dimana hal tersebut merepresentasikan viabilitas sel. Intensitas warna ungu tersebut dapat diukur dan proporsional terhadap jumlah sel hidup, nilai ini dapat dikonversi menjadi persen viabilitas sel.
Semakin besar intensitas warna ungu yang terbentuk maka hal tersebut berarti bahwa semakin banyak jumlah sel hidupnya. Berdasarkan hasil uji yang telah diperoleh, kelompok kontrol memberikan nilai absorbansi yang lebih besar yang menunjukkan bahwa jumlah sel hidup yang ada pada kelompok kontrol lebih banyak dibandingkan jumlah sel hidup yang ada pada kelompok perlakuan. Akan tetapi dari penelitian ini juga terlihat bahwa jumlah sel hidup pada jam ke-72 lebih banyak dibandingkan jumlah sel hidup pada jam ke-6. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanolik biji alpukat belum optimal membunuh sel kanker.
Kemampuan induksi apoptosis dari suatu senyawa sangat diharapkan terutama untuk agen antikanker. Apoptosis juga merupakan salah satu hal yang menunjukkan penghambatan proliferasi sel. Hasil uji induksi apoptosis dengan flowcytometry dapat dilihat pada gambar 2. Metode flowcytometry mampu membedakan sel-sel hidup, awal apoptosis, akhir apoptosis dan nekrosis, karena reagen Annexin V dan bekerja PI selektif mengikat sel-sel utuh atau tidak utuh (fragmentasi).
Berdasarkan tabel 1, hasil uji induksi apoptosis dengan flowcytometry menunjukkan jumlah sel hidup pada pemberian perlakuan IC50 ekstrak lebih sedikit dibandingkan kelompok kontrol. Hal ini berbanding terbalik dengan jumlah sel yang mengalami nekrosis dimana pada pemberian perlakuan IC50 ekstrak jumlah sel nekrosis lebih banyak dibandingkan kelompok kontrol. Ekstrak biji alpukat memiliki kemampuan untuk menginduksi apoptosis.
4. KESIMPULAN
Penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak metanolik biji alpukat terbukti memiliki aktivitas induksi apoptosis yang ditunjukkan dari hasil flowcytometry. Kemampuan induksi apoptosis ini menyebabkan ekstrak metanolik biji alpukat mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai agen antikanker.
Ucapan Terimakasih
Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada pihak-pihak yang telah mendukung penelitian ini. Ucapan terimakasih juga terutama penulis sampaikan kepada Universitas Udayana yang telah memberikan bantuan dana penelitian.
DAFTAR PUSTAKA
Chien, S., Y. Wu, J. Chung, J. Yang, H. Lu, M. Tsou, WG Wood, S. Kuo, and D. Chen. 2009. Quercetin-induced Apoptosis Acts Through Mitochondrial- and Caspase-3-dependent Pathways In Human Breast Cancer MDA-MB-231 cells. Human and Experimental Toxicology 28 (8). P.493-503.
De Vita, V.T., Lawrence, S.T., and Rosenberg, S.A.2008.Cancer: Principle & Practice of Oncology, 8th edition, volume 1. Lippincott Williams & Wilkins, A Wolter Kluwer Business.Philadelphia. Doyle, A. & Griffiths, J.B. 1998. Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology.
Wiley. Chichester.
Evacuasiany, E., H. Ratnawati, L.K. Liana, W. Widowati, M. Maesaroh, T. Mozef, and C. Risdian. 2014. Cytotoxic and Antioxidant Activities of Catechins in Inhibiting The Malignancy of Breast Cancer. Oxid Antioxid Med Sci 3(2). P. 141-146.
Joshi, U.J., A.S. Gadge, P. D’Mello, R. Sinha, S. Srivastava, and G. Govil. 2011. Anti-inflammatory, Antioxidant and Anticancer Activity of Quercetin and Its Analogues. International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences Vol. 2 (4). P.1756-1766.
National Comprehensive Colon Network. 2014. NCCN Guideline for Patiens: Colon Cancer. Ver. 1. 2014. Washington: NCCN Foundation.
SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI IV 2017 “Inovasi Humaniora, Sains dan Teknologi untuk Pembangunan Berkelanjutan”
Priya, E.S., K. Selvakumar, S. Bavithra, P. Elumalai, R. Arunkumar, P.R. Singh, A.B. Mercy, and J. Arunakaran. 2013. Anti-cancer Activity of Quercetin in Neuroblastoma: An In Vitro Approach. Neurol Sci.
Purwani, E. Y., M. T. Suhartono. 2014. Pati Resistan serta Perannya dalam Penghambatan Proliferasi dan Induksi Apoptosis Sel Kanker Kolon. Indonesian Journal of Cancer. Vol. 8 (4). p. 137-177.
SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI IV 2017
“Inovasi Humaniora, Sains dan Teknologi untuk Pembangunan Berkelanjutan”