Aktivitas Xilanase pada pH 6 dan suhu 50 o C

et al 1989) dan Kurva Standar Glukosa Untuk Total Gula 1 Prosedur Pengukuran Total Gula

Lampiran 9. Aktivitas Enzim α amilase, Selulase, dan Xilanase

3. Aktivitas Xilanase pada pH 6 dan suhu 50 o C

Waktu (menit) Aktivitas (U/ml)

0 0 10 173.33 20 178.89 30 182.22 40 146.11 50 134.22 60 117.04

Lampiran 1. Prosedur Analisa Karakteristik Tepung Empulur Sagu

1. Analisa Proksimat

a. Kadar Air (AOAC 1999)

Sampel sebanyak 2 g ditimbang dan ditaruh di dalam cawan aluminium yang telah diketahui bobot keringnya. Bahan kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 100oC selama 5 jam. Sampel kemudian didinginkan dalam desikator. Bobot akhir ditimbang dan diulang hingga konstan.

Kadar Air (%) = A – B x 100% B

Keterangan:

A = bobot awal sampel (g) B = bobot akhir sampel (g) b. Kadar Abu (AOAC 1999)

Sampel sebanyak 3-5 g ditimbang dan ditaruh di cawan porselen yang telah diketahui bobot keringnya. Sebelum diabukan, sampel terlebih dahulu dipanaskan di atas pemanas destruksi hingga berbentuk arang dan tidak berasap lagi. Sampel kemudian diabukan dalam tanur listrik pada suhu 550oC hingga berbentuk warna abu-abu. Sampel kemudian didinginkan dalam desikator. Sampel ditimbang bobot akhirnya dan diulangi hingga bobot konstan.

Kadar Abu (%) = bobot abu setelah pengabuan (g) x 100% bobot awal sampel (g)

c. Kadar Lemak (Metode Soxhlet)

Labu dikeringkan dengan oven bersuhu 100-102oC selama ± 15 menit kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang. Sampel ditimbang sebanyak ± 5 g kemudian dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet kemudian direfluks selama 5-6 jam. Pelarut dalam labu lemak didestilasi dan ditampung hasilnya. Labu lemak yang berisi hasil ekstraksi dipanaskan di dalam oven 105oC. Setelah pelarut menguap semua, labu lemak diangkat dan didinginkan di dalam desikator kemudian ditimbang. Nilai kadar lemak dapat diperoleh dengan perhitungan sebagai berikut : Kadar Lemak (%) = berat lemak (g) x 100%

berat sampel d. Kadar Protein (AOAC 1999)

Sebanyak 0.1 g contoh dimasukkan ke dalam labu Kjedahl lalu ditambahkan 2.5 ml H2SO4 pekat, 1 g katalis dan beberapa butir batu didih. Larutan didesktruksi hingga menghasilkan larutan jernih kemudian didinginkan. Larutan hasil destruksi dipindahkan ke alat destilasi dan ditambahkan 15 ml NaOH 50%. Labu erlenmeyer yang berisi 25 ml HCl 0.02 N dan 2-4 tetes indikator mengsel (campuran metal merah 0.02% dalam alkohol dan metal biru 0.02% dalam alkohol 2:1) diletakkan di bawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam dalam larutan HCl. Destilasi dilakukan sampai volume larutan

53 dalam erlenmeyer mencapai 2 kali volume awal. Ujung kondensor dibilas dengan akuades (ditampung dalam erlenmeyer). Larutan yang berada di dalam erlenmeyer dititrasi dengan NaOH 0.02 N hingga diperoleh perubahan warna dari hijau menjadi ungu. Setelah itu dilakukan pula penetapan blanko.

Kadar Protein (%) = (a-b) x N x 0.014 x 6.25 x 100% W

Keterangan:

a= ml NaOH untuk titrasi blanko b = ml NaOH untuk titrasi contoh N = normalitas NaOH

W = bobot contoh (g) e. Kadar Serat Kasar (AOAC 1999)

Sebanyak 2 g contoh dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml dan ditambahkan 100 ml H2SO4 0.325 N. Campuran dihidrolisis dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 105oC dan didinginkan kemudian ditambahkan NaOH 1.25 N sebanyak 50 ml. Sampel dihidrolisis kembali dalam otoklaf selama 15 menit. Sampel disaring tersebut dicuci berturut-turut dengan air panas, 25 ml H2SO4 0.325 N lalu dengan air panas dan terakhir menggunakan alkohol 25 ml. Kertas saring tersebut dikeringkan dalam oven bersuhu 105oC selama 1 jam dan dilanjutkan sampai bobot tetap.

Kadar Serat (%) = (a-b)/c x 100% Keterangan:

a = bobot residu serat dalam kertas saring (g) b = bobot kertas saring kering (g)

c = bobot bahan awal (g) f. Kadar Karbohidrat (by difference)

Kadar Karbohidrat (% b/b) = 100% - (kadar air + kadar abu + kadar lemak + kadar protein + kadar serat kasar)

2. Analisa Komponen Serat

a. Penetapan NDF (Neutral Detergent Fiber) (Van Soest 1969 dalam Apriantono et al.1969)

Sampel sebanyak 0.5 g (A), dimasukkan ke dalam gelas piala berukuran 250 ml serta ditambahkan dengan larutan NDF. Larutan NDF terdiri atas bahan kimia sebagai berikut : akuades 1 l; Natrium Sulfat 30 g; EDTA 18.81 g; Natrium Borat 10 H2O 6.81 g; di-Na-HPO4 anhidrat 4.5 g dan 2- etoksi etanol murni 10 ml.

Sampel yang mengandung pati ditambahkan dengan α-amilase 30 ml dalam bufer fosfat pH 7 0.067 N selama 16 jam dalam inkubator 40oC. Sampel kemudian ditambahkan larutan NDF disaring pada

filter glass dengan bantuan pompa vakum, dibilas bergantian dengan air panas dan aseton. Hasil penyaringan tersebut dikeringkan dalam oven 105oC hingga stabil, setelah itu dimasukkan dalam desikator selama satu jam, kemudian dilakukan penimbangan (B). Filter glass diabukan pada tanur dengan suhu 450-500oC sampai diperoleh bobot setimbang, kemudian ditimbang (C).

Kadar NDF (%) = (B-C)/A x 100% Keterangan :

A = bobot sampel (g)

B = bobot filter glass dan sampel setelah dioven (g) C = bobot filter glass dan sampel setelah ditanur (g)

b. Penetapan ADF dan Hemiselulosa (Van Soest 1969 dalam Apriantono et al.1969)

Sampel sebanyak 1 g (A), dimasukkan ke dalam gelas piala serta ditambahkan dengan 50 ml larutan ADF. Larutan ADF terdiri atas 1 liter H2SO4 1 N dan 20 g CTAB (chetyle trimethyl ammonium bromide). Sampel yang telah ditambahkan larutan tersebut dipanaskan selama satu jam di atas pendingin balik.

Penyaringan dilakukan dengan bantuan pompa vakum dengan menggunakan filter glass. Pencucian dilakukan bergantian dengan aseton dan air panas. Hasil penyaringan tersebut dikeringkan di dalam oven 105oC hingga stabil, setelah itu dimasukkan ke dalam desikator selama satu jam, kemudian dilakukan penimbangan (B). Filter diabukan pada tanur dengan suhu 450-500oC sampai diperoleh bobot setimbang, kemudian ditimbang (C).

Kadar ADF (%) = (B-C)/A x 100% Keterangan :

A = bobot sampel (g)

B = bobot filter glass dan sampel setelah dioven (g) C = bobot filter glass dan sampel setelah ditanur (g) c. Kadar Selulosa

Residu ADF (C) yang berada di dalam filter glass diletakkan di atas nampan yang berisi air setinggi kira-kira 1 cm. Kemudian ditambahkan H2SO4 setinggi ¾ bagian filter glass dan dibiarkan selama 3 jam sambil diaduk-aduk. Penyaringan dengan filter glass dibantu dengan pompa vakum. Pencucian dilakukan dengan aseton dan air panas. Dilakukan pengeringan dan memasukkan hasil penyaringan

55 tersebut ke dalam oven. Setelah itu dimasukkan lagi ke dalam desikator untuk melakukan pendinginan dan ditimbang (D).

Kadar Selulosa = (D-C)/A x 100% Keterangan :

A = bobot sampel (g)

C = bobot filter glass dan residu ADF awal (g)

Lampiran 2. Prosedur Karakterisasi Kondisi Optimum Enzim

1. Penentuan Kondisi Optimum Enzim α-amilase dan Dextrozyme

Prosedur untuk penentuan kondisi optimum kerja enzim α-amilase yang meliputi pH dan suhu optimum dilakukan pada rentang pH 5 hingga 6 (5, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, dan 6) terhadap substrat soluble starch dan dalam rentang waktu inkubasi 10 hingga 60 menit. Pembentukan gula pereduksi dari hasil hidrolisis enzim α-amilase diukur menggunakan metode DNS. Penentuan kondisi optimum enzim dextrozyme dilakukan berdasarkan penelitian Akyuni (2004).

Ditambah 0.5 ml soluble starch0.15% 0.5 ml enzim α-amilase

Ditambah 1 ml DNS

Dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit

Didinginkan dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada

550 nm Diinkubasi pada suhu 95oC (10, 20, 30, 40, 50,

2. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Selulase

Penentuan kondisi optimum enzim selulase dilakukan pada pH 5 yaitu pengenceran pada bufer pH 5 dan substrat yang digunakan adalah CMC. Aktivitas enzim dihitung melalui pembentukan gula pereduksi (DNS) pada rentang waktu 10, 20, 30 menit inkubasi. Untuk blanko digunakan akuades sedangkan untuk perlakuan kontrol digunakan substrat dan enzim yang langsung ditambahkan DNS (0 menit).

0.5 ml enzim

Ditambah 0.5 ml soluble starch0.15%

Diinkubasi pada suhu 95oC selama 3 menit 0.5 ml enzim selulase

Ditambah 0.5 ml CMC 0.15%

Diinkubasi pada suhu 60oC (10, 20, dan 30

menit)

Dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit

Didinginkan dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada

550 nm Ditambah 1 ml DNS

3. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Xilanase

Penentuan kondisi optimum enzim xilanase dilakukan pada pengenceran dengan bufer pH 6 dengan substrat yang digunakan adalah xilan (birchwood). Aktivitas enzim dihitung melalui pembentukan gula pereduksi (DNS) pada rentang waktu 10 hingga 60 menit inkubasi. Untuk blanko digunakan akuades sedangkan untuk perlakuan kontrol digunakan substrat dan enzim yang langsung ditambahkan DNS (0 menit).

0.5 ml enzim

Ditambah 0.5 ml soluble starch0.15%

Diinkubasi pada suhu 95oC selama 3 menit 0.5 ml enzim xilanase

Ditambah 0.5 ml xilan 0.15%

Diinkubasi pada suhu 60oC (10, 20, 30, 40, 50,

dan 60 menit)

Dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit

Didinginkan dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada

550 nm Ditambah 1 ml DNS

Lampiran 3. Prosedur Pembuatan Pereaksi DNS dan Bufer pH

1. Pereaksi DNS

Sebanyak 19.8 g NaOH, 306 g K Na Tartarat, 8.3 g Sodium Metabisulfit, 10.6 g DNS, dan 7.8 g Fenol (telah dicairkan pada suhu 50oC) dicampur dengan 1416 ml akuades. Semua bahan dicampur hingga homogen . Setelah campuran homogen, sebanyak 3 ml ditritrasi dengan HCl 0.1 N dengan menggunakan indikator PP. Apabila ml HCl untuk titrasi lebih dari 6 ml maka untuk setiap penambahan ml HCl 0.1 N, ditambahkan dengan 2 g/ml NaOH.

2. Bufer pH (Bufer Sitrat-Fosfat)

a. Bufer sitrat-fosfat untuk pH 4.5 (100 ml) asam sitrat 0.1 M : 27.8 ml

Na2HPO4 : 22.2 ml

ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml b. Bufer sitrat-fosfat untuk pH 5 (100 ml)

asam sitrat 0.1 N : 24.3 ml Na2HPO4 : 25.7 ml

ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml c. Bufer sitrat-fosfat untuk pH 5.2 (100 ml)

asam sitrat 0.1 N : 23.3 ml Na2HPO4 : 26.7 ml

ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml d. Bufer sitrat-fosfat untuk pH 5.4 (100 ml)

asam sitrat 0.1 N : 22.2 ml Na2HPO4 : 27.8 ml

ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml e. Bufer sitrat-fosfat untuk pH 5.6 (100 ml)

asam sitrat 0.1 N : 21.0 ml Na2HPO4 : 29.0 ml

ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml f. Bufer sitrat-fosfat untuk pH 5.8 (100 ml)

asam sitrat 0.1 N : 19.7 ml Na2HPO4 : 30.3 ml

ditambahkan akuades steril hingga volume larutan mencapai 100 ml g. Bufer sitrat-fosfat untuk pH 6.0 (100 ml)

asam sitrat 0.1 N : 17.9 ml Na2HPO4 : 32.1 ml

Lampiran 4. Prosedur Pengukuran Gula Pereduksi dengan Metode DNS

(Apriyanto et al. 1989) dan Kurva Standar Glukosa Untuk Gula

Pereduksi

1. Prosedur Pengukuran Gula Pereduksi

Pengukuran gula pereduksi dengan menggunakan metode DNS dilakukan dengan cara mencampurkan 1 ml filtrat dari sampel yang akan diuji dengan 1 ml larutan pereaksi DNS kemudian dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit. Setelah itu, didinginkan lalu dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm.

Pembacaan pada spektrofotometer memberikan nilai dalam satuan absorbansi sehingga untuk mengetahui konsentrasi gula pereduksi di dalam sampel tersebut, terlebih dahulu dibuat kurva standar glukosa. Untuk pembuatan kurva standar glukosa, digunakan glukosa standar (0, 100, 150, 200, dan 250 ppm). Masing-masing diambil 1 ml sesuai dengan prosedur pengukuran gula pereduksi di atas. Hasil pembacaan pada spektrofotometer dikumpulkan dan dicari persamaannya, dari persamaan inilah dapat diketahui konsentrasi gula pereduksi di dalam sampel.

2. Kurva Standar Glukosa untuk Gula Pereduksi

ppm Abs 100 0.158 100 0.178 150 0.433 150 0.436 200 0.678 200 0.702 250 1.035 250 1.004

Lampiran 5. Prosedur Pengukuran Total Gula dengan Metode Fenol (Apriyanto

et al. 1989) dan Kurva Standar Glukosa Untuk Total Gula

1. Prosedur Pengukuran Total Gula

Pengukuran total gula dengan menggunakan metode Fenol dilakukan dengan cara mencampurkan 1 ml filtrat dari sampel yang akan diuji dengan 0.5 ml Fenol 5% dan 2.5 ml H2SO4 pekat kemudian dipanaskan pada air mendidih selama 15 menit. Setelah itu, didinginkan lalu dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm.

Pembacaan pada spektrofotometer memberikan nilai dalam satuan absorbansi sehingga untuk mengetahui jumlah total di dalam sampel tersebut, terlebih dahulu dibuat kurva standar glukosa. Untuk pembuatan kurva standar glukosa, digunakan glukosa standar (0, 10, 20, 30, 40, dan 50 ppm). Masing- masing diambil 1 ml sesuai dengan prosedur pengukuran gula pereduksi di atas. Hasil pembacaan pada spektrofotometer dikumpulkan dan dicari persamaannya, dari persamaan inilah dapat diketahui jumlah total gula yang terdapat di dalam sampel.

2. Kurva Standar Glukosa untuk Total Gula

ppm Abs 10 0.147 10 0.163 20 0.316 20 0.324 30 0.495 30 0.513 40 0.659 40 0.654 50 0.803 50 0.823

Lampiran 6. Prosedur Analisa Kejernihan Filtrat Hidrolisat (Sunarti et al. 2011)

Prosedur analisa kejernihan filtrat dari hasil hidrolisis adalah sebagai berikut :

Sampel dicelupkan ke dalam air mendidih selama 30 menit

Tabung sampel dikocok setiap 5 menit

Sampel didinginkan kemudian dibaca nilai trasmitannya (%) menggunakan spektrofotometer pada λ 650 nm

Lampiran 7. Prosedur Analisa Kaldu Fermentasi

1. pH (AOAC 1999)

Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH-meter. Bagian elektroda pada pH-meter terlebih dahulu dicuci dengan akuades, lalu dimasukkan ke dalam sampel. Nilai pH sampel ditetapkan setelah nilai yang ditampilkan oleh alat menunjukkan nilai konstan.

2. Total Asam (Dewipadma 1978 dalam Derosya 2010)

Total asam ditentukan dengan cara titrasi dan dinyatakan sebagai asam laktat. Sampel diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 ml. Selanjutnya ditambahkan dengan 9 ml akuades dan dipanaskan untuk menghilangkan CO2 yang terdapat di dalam sampel. Campuran didinginkan kemudian dititrasi dengan NaOH 0.1 N dengan indikator fenolftalein.

Total Asam (g/) = ml NaOH x N NaOH x 9 x faktor pengenceran ml contoh

3. Kadar Etanol

Penentuan kadar etanol dilakukan dengan metode Gas Chromtography (GC). Metode yang digunakan untuk menentukan kadar etanol ialah dengan membandingkan waktu retensi contoh dengan waktu retensi standar etanol. Konsentasi standar etanol yang diinjeksikan adalah 1% (v/v). Kadar etanol yang terdapat di dalam contoh dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut :

Kadar Etanol (%) = luas area contoh x [standar] luas area standar

Lampiran 8. Uji Homogenitas Total Gula, Gula Pereduksi, Derajat Polimerisasi,

dan Dextrose Equivalent

1. Likuifikasi

a. Total Gula dB Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Hitung Pr>F Total Gula 8 9398.50 1174.81 13.31 0.0004