DAFTAR LAMPIRAN
B. METODE PENELITIAN
1. Penyiapan dan Karakterisasi Empulur Sagu
Empulur sagu yang diperoleh dari industri pati sagu rakyat di Cimahpar, Bogor dikeringkan terlebih dahulu untuk mencegah adanya perubahan karakteristik empulur sagu tersebut. Setelah dikeringkan, empulur sagu dihancurkan dan diayak hingga lolos pada saringan 30 mesh sehingga menjadi tepung empulur sagu yang siap untuk digunakan pada tahap selanjutnya.
Karakterisasi tepung empulur sagu terdiri dari uji komponen proksimat (air, abu, protein, lemak, serat kasar, dan karbohidrat by difference) sesuai dengan metode AOAC (1999) serta komponen serat (selulosa, hemiselulosa, dan lignin) berdasarkan metode Van Soest (1969). Prosedur analisa komponen proksimat dan komponen serat disajikan pada Lampiran 1.
2. Karakterisasi Enzim
Karakterisasi kondisi optimum enzim yang digunakan dilakukan untuk mengetahui suhu dan pH optimum enzim bekerja baik secara tunggal maupun konsorsium. Karakterisasi enzim dilakukan pada enzim α-amilase, selulase, dan xilanase, sedangkan enzim dextrozyme dilakukan berdasarkan penelitian Wibisono (2004) yaitu pada pH 4.5 dan suhu 60oC. Penentuan pH dan suhu optimum untuk kerja enzim α- amilase dilakukan pada rentang pH 5 hingga pH 6 dan suhu 95oC menggunakan substrat soluble starch. Untuk enzim selulase dilakukan pada pH 5 dan suhu 60oC menggunakan substrat CMC (CMC-ase), sedangkan untuk enzim xilanase dilakukan pada pH 6 dan suhu 50oC menggunakan substrat xilan (birchwood). Prosedur karakterisasi kondisi optimum enzim disajikan pada Lampiran 2.
12
3. Produksi Fermentable Sugar
Proses produksi gula terfermentasikan dilakukan secara hidrolisis enzimatis dan dibagi menjadi (1) perlakuan pendahuluan atau pretreatment yaitu pemanasan menggunakan gelombang mikro (microwave pretreatment), dan (2) hidrolisis enzimatis.
a. Pemanasan dengan gelombang mikro
Penggunaan gelombang mikro untuk pemanasan empulur sagu dilakukan berdasarkan perlakuan terbaik yang diperoleh dari penelitian Derosya (2010), yaitu tepung empulur sagu yang telah dicampur dengan air sehingga membentuk slurry 8% (b/v) pada wadah gelas, lalu dipanaskan menggunakan oven gelombang mikro merk SHARP tipe R-348 C pada aras daya 30% dan 50%. Sebagai kontrol, slurry 8% dipanaskan dengan menggunakan otoklaf pada 121oC selama 15 menit. Slurry hasil pemanasan menggunakan gelombang mikro pada aras daya 30% dan 50% serta pemanasan menggunakan otoklaf akan diamati pada tingkat gelatinisasi substrat empulur sagu di dalam air, ketersediaan air pada slurry
yang telah dipanaskan, dan tidak terjadinya browning. Pengamatan ini dilakukan secara visual dan mikroskopik. Selain itu dilakukan juga analisa yang bersifat kuantitatif, yaitu : (1) volume filtrat, (2) analisa gula (gula pereduksi dan total gula), dan (3) pengukuran bobot residu.
b. Hidrolisis enzimatis
Hidrolisis enzimatis pada substrat empulur sagu yang telah dikenai perlakuan pemanasan terdiri dari dua tahap, yaitu likuifikasi menggunakan enzim α-amilase dan sakarifikasi yang menggunakan konsorsium enzim dextrozyme, selulase, dan xilanase. Pada tahap likuifikasi, empulur sagu (slurry 8%) ditambahkan enzim α-amilase sebanyak 3.5 U/g, 7 U/g, dan 1.75 U/g sebagai kontrol (Derosya 2010) yang dikondisikan pada suhu 95oC selama 3 jam pada shaker waterbath. Pada akhir masa inkubasi, filtrat dipisahkan untuk diukur volumenya sedangkan ampas yang diperoleh dikeringkan di dalam oven pada suhu 105oC agar diketahui bobot residu yang diperoleh. Filtrat diambil untuk diketahui volume, total gula dan gula pereduksinya sehingga dapat ditentukan perlakuan terbaik dari tahap ini untuk selanjutnya masuk ke tahap sakarifikasi. Selain itu juga dilakukan analisa terhadap kejernihan filtrat.
Pada tahap sakarifikasi, perlakuan terbaik yang berasal dari tahap likuifikasi akan disakarifikasi menggunakan konsorsium enzim. Konsorsium enzim tersebut terdiri atas dexrozyme (AMG dan pullulanase) pada konsentrasi 0.3 U/g dan 0.6 U/g, serta selulase dan xilanase pada konsentrasi masing- masing 1 U/g dan 2 U/g. Proses sakarifikasi dilakukan pada suhu 50oC yang merupakan titik optimum aktivitas enzim-enzim konsorsium tersebut selama 48 jam pada shaker waterbath. Pada akhir inkubasi, filtrat dipisahkan untuk diukur volumenya serta dianalisa total gula dan gula pereduksinya sedangkan ampas yang masih tersisa dikeringkan di oven pada suhu 105oC untuk mengetahui bobot residunya. Dari tahap likuifikasi dan sakarifikasi ini akan ditentukan perlakuan terbaik untuk selanjutnya memasuki tahap fermentasi.
4. Produksi Bioetanol
a. Persiapan biakan mikroba
Biakan mikroba yang digunakan pada tahap produksi bioetanol yaitu Saccharomyces elippsoides
(Derosya 2010) dan Pichia stipitis. Kedua jenis mikroba ini diinokulasikan pada agar miring PDA (Potato Dextrose Agar). Inkubasi dilakukan menggunakan inkubator pada suhu ruang selama 24 jam. Hasil inokulasi pada medium PDA dipindahkan pada medium agar PDB (Potato Dextrose Broth) sebanyak 1 ose setiap 50 ml medium agar PDB dan diinkubasikan pada suhu ruang menggunakan shaker incubator
13 selama 24 jam. Setelah diinkubasi pada medium PDB, biakan Saccharomyces elippsoides dan Pichia stipitis digunakan untuk fermentasi bioetanol sebanyak 10 ml kultur tiap 100 ml substrat.
b. Fermentasi
Tahap fermentasi sirup glukosa untuk menghasilkan bioetanol ini menggunakan metode modifikasi berdasarkan penelitian Derosya (2010). Untuk tahap fermentasi ini, perlakuan yang dipilih sebagai substrat ialah : (1) sirup glukosa dari perlakuan dari pemanasan gelombang mikro dan kombinasi konsentrasi enzim terbaik, (2) sirup glukosa dari perlakuan kombinasi enzim terbaik dengan pemanasan otoklaf sebagai pembanding, dan (3) sirup glukosa dari glukosa teknis. Substrat yang digunakan diinkubasi menggunakan Saccharomyces elippsoides dan Pichia stipitis secara simultan atau tanpa inaktivasi enzim.
Masing-masing sirup glukosa dari (1) perlakuan dari pemanasan gelombang mikro dan kombinasi konsentrasi enzim terbaik, (2) perlakuan kombinasi enzim terbaik dengan pemanasan otoklaf sebagai pembanding, dan (3) glukosa teknis diperkaya dengan pupuk NPK (0.04 g) dan ZA (0.15 g). Fermentasi dilakukan pada sistem tertutup tanpa aerasi (Derosya 2010) menggunakan labu leher angsa seperti yang disajikan pada Gambar 6. Pembentukan CO2 dari proses fermentasi alkohol diukur setiap 6 jam dan ditetapkan sebagai laju pembentukan gas. Inkubasi berlangsung selama 72 jam, setelah masa inkubasi berakhir, kultur ditetapkan pH-nya, kandungan total gula residu, gula pereduksi, total asam, dan konsentrasi etanol (P). Konsentrasi etanol dianalisa menggunakan metode Kromatografi Gas (GC). Prosedur analisa gula, kejernihan filtrat, dan kaldu fermentasi disajikan pada Lampiran 3 hingga 7.
Gambar 6. Rangkaian peralatan pada fermentasi etanol sistem tertutup
5. Rancangan Percobaan
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh aras daya(P) pemanasan gelombang mikro dan konsentrasi enzim (U) terhadap substrat empulur sagu untuk memperoleh karakteristik sirup glukosa terbaik yang sesuai untuk dijadikan substrat fermentasi etanol. Perlakuan terbaik ditentukan berdasarkan pengamatan terhadap volume filtrat, total gula, gula pereduksi, derajat polimerisasi, dekstrose ekivalen, bobot residu, dan kejernihan filtrat. Dari tiap perlakuan diuji homogenitasnya menggunakan SAS dimana tiap perlakuan dianggap berbeda dan terpisah.
Hipotesis yang diuji : Ho : σ12 = σ22
14 H1 : σ12≠σ22
σ12 : varians skor kelompok eksperimen
σ22 : varians skor kelompok kontrol
Fhitung : = (varians terbesar)
(varians terkecil) Jika Fhitung < Ftabel, maka Ho diterima
Tabel 2. Faktor Perlakuan Pemanasan dan Hidrolisis Enzimatis
Faktor Kode
Aras Daya Konsentrasi Enzim
50% 1. Likuifikasi :
1.75 U/g P5U1
3.5 U/g P5U3
7 U/g P5U7
2. Sakarifikasi :
0.3 U/g Dekstrozyme, 1 U/g Selulase, 1 U/g Xilanase P5U1K P5U7K 0.6 U/g Dekstrozyme, 2 U/g Selulase, 2 U/g Xilanase P5U1P P5U7P 30% 1. Likuifikasi : 1.75 U/g P3U1 3.5 U/g P3U3 7 U/g P3U7 2. Sakarifikasi :
0.3 U/g Dekstrozyme, 1 U/g Selulase, 1 U/g Xilanase P3U1K P3U7K 0.6 U/g Dekstrozyme, 2 U/g Selulase, 2 U/g Xilanase P3U1P P3U7P
Perlakuan pada pemanasan menggunakan gelombang mikro yaitu aras daya 30% (P3) dan aras daya 50% (P5) sedangkan pada tahap likuifikasi yaitu konsentrasi enzim α-amilase 1.75 U/g (U1), 3.5 U/g (U3), dan 7 U/g (U7). Untuk tahap sakarifikasi, perlakuannya yaitu 0.3 U/g Dekstrozyme, 1 U/g Selulase, dan 1 U/g Xilanase (K) serta 0.6 U/g Dekstrozyme, 2 U/g Selulase, dan 2 U/g Xilanase (P). Pembanding perlakuan pendahuluan empulur sagu menggunakan gelombang mikro, dilakukan dengan pemanasan menggunakan otoklaf. Perbedaan aras daya dan konsentrasi enzim merupakan satu perlakuan dengan dua kali ulangan. Perlakuan terbaik dari kombinasi perlakuan pendahuluan menggunakan gelombang mikro (aras daya 30% dan 50%) dan konsentrasi enzim pada hidrolisis enzimatis akan digunakan untuk produksi bioetanol dengan menggunakan Saccharomyces elippsoides dan Pichia stipitis.
S12 S22
